Fungos Filamentosos

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

Fungos são organismos eucarióticos heterotróficos, e com exceção das leveduras, são aeróbicos. São abundantes em solos superficiais e são importantes por seu papel no ciclismo de nutrientes e pela decomposição de matéria orgânica e contaminantes orgânicos. Fungos de podridão branco (phanerochaete chryosporium) por exemplo,(Figura 1) são conhecidos por degradar aromáticos.

Figura 1. Apodrecimento branco na bétula.

Os solos geralmente contêm milhões de fungos por grama, de modo que o solo é tipicamente diluído usando uma série de diluição. Uma série de diluição é feita suspendendo uma determinada quantidade de solo em uma solução dispersante, como a água deionizada. As alíquotas das suspensões são então transferidas para uma solução fresca, até que a suspensão seja diluída o suficiente para permitir que colônias fúngicas discretas individuais cresçam nas placas de ágar. (Figura 2)

Após a inoculação em várias placas de ágar de réplica, as placas são incubadas a 25 °C. Após a formação das colônias fúngicas macroscópicas, elas são contadas, como mostra a Figura 3. Como a suposição é que uma colônia fúngica é derivada de um organismo, o termo Unidades formadoras de colônias (UFC) é usado na análise final, com os resultados expressos em termos de UFC por grama de solo seco do forno.

As contagens fúngicas culturable normais do solo fértil estão na faixa de 10⁶-10⁶ fúngicos "propagules" (esporos, hifas ou fragmentos de hifa) por grama de solo seco. A contagem de placas culturais tem sido usada para enumerar organismos desde o século XIX. Eles continuam a ser usados hoje, pois são baratos de realizar, exigem pouco trabalho, são rápidos e são bastante reprodutíveis. No entanto, eles sofrem de uma série de erros, que devem ser considerados na avaliação dos resultados. O mais significativo desses erros é o fato de que muitos organismos não culturam em placas de mídia.

Figura 2. Técnica de diluição e revestimento. Aqui, a suspensão do solo diluído é incorporada diretamente no meio do ágar, em vez de ser aplicada à superfície, como no caso do revestimento de propagação. De Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed., Academic Press, San Diego, CA

Figura 3. Fungos do solo isolados de um solo superficial cultivado em uma placa de Petri contendo Rose Bengal Agar. Foto cortesia K.L. Josephson. De Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed., Academic Press, San Diego, CA.

1. Preparação da amostra do solo

1. Primeiro, determine o teor inicial de umidade do solo secando durante a noite uma quantidade conhecida do solo úmido, e reweighing o solo seco. A equação para determinar o teor inicial de umidade do solo é:
   
   (Equação 1)
   onde:
   MC = teor de umidade
   W = peso líquido
   D = peso seco
2. Calcule a quantidade de água que deve ser adicionada a 25 g de solo para aumentar o teor de umidade do solo para 10% em uma base de peso seco.
3. Em seguida, adicione essa quantidade de água a 25 g do solo.
4. Cubra o recipiente com plástico e perfure o filme várias vezes com uma sonda para permitir a aeração durante a incubação. Segure o filme com um elástico.
5. Pesar o solo e embrulhar, em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente por uma semana.

2. Inoculação e Incubação de Fungos

1. Após a incubação completa, pese a amostra do solo com o envoltório e o elástico. Calcule a perda de peso devido à perda de umidade.
2. Calcule o novo teor de umidade do solo.
3. Em seguida, prepare uma série de diluição de 1/10 dos solos, como mostrado na Figura 2. Isso resultará em diluições de 10^-1 (garrafa A), 10^-2 (tubo B), 10^-3 (tubo C), 10^-4 (tubo D) e 10^-5 (tubo E) g de solo por mL.
4. Prepare placas estéreis de ágar rose bengal-streptomiccin. Tanto a Bengala Rosa quanto a estreptomicina inibem o crescimento bacteriano. Para solos muito férteis, onde as populações microbianas do solo são altas, as diluições escolhidas devem ser maiores, ou seja,10^-3,10^-4e 10^-5, g solo por placa.
5. Para cada uma das 10^-3 placas, adicione 0,1 mL do tubo de diluição^10-2, e espalhe-se sobre a superfície do ágar usando um espalhador de vidro esterilizado com chama de etanol. Como uma quantidade de 0,1 mL é banhada, isso torna a diluição efetiva 10^-3. Repita estes passos para todas as diluições.
6. Incubar placas em temperatura ambiente por uma semana.

3. Contagem e Exame de Colônia por Microscopia

1. Faça colônia conta em um e apenas uma diluição de cada solo. As placas que são contadas devem ter discretas colônias contáveis. Placas overgrown não devem ser contadas. Da mesma forma, placas com menos de 10 colônias não devem ser contadas. Observe e descreva as características culturais de três colônias diferentes.
2. Prepare os suportes de fita de pressão (fita transparente) em slides para estudo detalhado do microscópio usando o seguinte procedimento:
   1. Deposite uma gota de fluido de montagem de lactofenol no centro de um escorregador de vidro limpo
   2. Corte uma tira de fita de celofane clara a cerca de 3 cm de comprimento do rolo de estoque. Para evitar contaminar a superfície adesiva, use fórceps ao manusear a fita. Uma agulha dissecando ajudará a libertar a fita dos fórceps.
   3. O lado adesivo da fita é aplicado na superfície de uma colônia de fungos esporulando. Tome cuidado para evitar pressão excessiva na fita ou muito densa uma massa de hifa e esporos serão coletados.
   4. Remova a fita do contato com a colônia de fungos e aplique-a, lado adesivo para baixo, à gota de fluido de montagem na lâmina de vidro. Esfregue a fita suavemente com um instrumento liso e plano para expressar bolhas de ar.
   5. Examine o suporte da fita microscopicamente sob o objetivo de imersão do óleo com óleo.
   6. Identificar dois gêneros fúngicos diferentes utilizando a chave de identificação fúngica fornecida(Figura 4).

Figura 4. Chave de identificação fúngica.

Contagem de Colônias

O número de colônias fúngicas por grama de solo é igual ao número de colônias contadas na placa multiplicada pela recíproca da diluição banhada. Por exemplo, se 46 colônias forem contadas em uma diluição de 10^-5, então a UFC por grama de solo é 46 x 10⁵ ou 4,6 x 10⁶.

Identificação de Três Gêneros Fúngicos Diferentes

Os fungos podem ser identificados microscopicamente por meio do exame dos corpos e esporos frutíferos. Uma chave de identificação de fungos pode auxiliar nesse processo. (Figura 4) Os tipos de fungos comuns observados incluem Penicillium e Aspergillus.

A diluição e o revestimento de fungos do solo podem ser usados como indicação da saúde de um solo. Normalmente, um solo fértil "saudável" terá de¹⁰ a 10⁶ fungos por grama de solo. Também pode ser utilizado para isolar culturas puras de fungos específicos, posteriormente avaliados para propriedades específicas, como a capacidade de degradar compostos orgânicos. Estes podem ser prejudiciais como no caso de fungos de podridão branca, ou benéficos quando orgânicos tóxicos são degradados através da biodegradação. Outros usos de culturas puras de fungos incluem o isolamento de fungos para antibióticos. Por exemplo, o primeiro antibiótico foi a penicilina, produzida pelo fungo penicilliumtransportado pelo solo. Isto foi descoberto pela primeira vez por Sir. Alexander Fleming em 1929.

1. Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
2. Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).