Hongos filamentosos

Fuente: Laboratorios del Dr. Ian Pepper y el Dr. Charles Gerba - Universidad de Arizona
Demostrando autor: Bradley Schmitz

Hongos son organismos eucariotas heterótrofos y con la excepción de levaduras, son aerobios. Son abundantes en suelos superficiales y son importantes para su papel en el ciclo de nutrientes y la descomposición de materia orgánica y contaminantes orgánicos. Blanco hongos (phanerochaete chryosporium) por ejemplo, (figura 1) se saben para degradar compuestos aromáticos de putrefacción.

Figura 1. Blanco rot en abedul.

Suelos generalmente contienen millones de hongos por gramo, por lo que el suelo se diluye normalmente con una serie de diluciones. Una serie de dilución se hace suspendiendo una cantidad dada de suelo en una solución dispersante, como agua desionizada. Las alícuotas de las suspensiones se transfieren a una solución fresca, hasta que la suspensión se diluye suficientemente para permitir colonias fúngicas discretas individuales que crecen en las placas de agar. (Figura 2)

Después de la inoculación en placas de agar replicar varias, las placas se incuban a 25 ° C. Después se forman las colonias de hongos macroscópicas, cuentan, como se muestra en la figura 3. Porque el supuesto es que una colonia de hongos se deriva de un organismo, el término Unidades formadoras de colonias (UFC) se utiliza en el análisis final, con los resultados expresados en términos de unidades formadoras de colonias por gramo de suelo seco de horno.

Cuentas normales de hongos cultivables de suelo fértil están en el rango de 10⁶-10⁶ hongos "propágulos" (esporas, hifas y fragmentos hyphal) por gramo de suelo seco. Cuenta de placa cultivables ha sido en el uso de la enumeración de los organismos desde el siglo XIX. Se siguen usando hoy en día, como son realizar, requieren poca mano de obra baratas, son rápidas y son bastante reproducibles. Sin embargo, sufren una serie de errores, que deben ser consideradas al evaluar los resultados. El más importante de estos errores es el hecho de que muchos organismos no se cultivo en las placas de los medios de comunicación.

Figura 2. Dilución y la técnica de la galjanoplastia. Aquí, la suspensión de suelo diluido se incorpora directamente en el medio de agar en lugar de ser superficie aplicada como en el caso de la galjanoplastia de la propagación. De ambiental & contaminación ciencia, 2^nd Ed., prensa académica, San Diego, CA

Figura 3. Hongos aislados de un suelo superficial en una placa Petri conteniendo Agar de Bengala Rose del suelo. Foto cortesía de K.L. de Josephson. De ambiental & contaminación ciencia, 2^nd Ed., prensa académica, San Diego, CA.

1. preparación de la muestra de suelo

1. En primer lugar, determinar el contenido de humedad inicial del suelo durante la noche secando de una cantidad conocida de suelo húmedo y pesajes el suelo seco. La ecuación para determinar el contenido de humedad inicial del suelo es:
   
   (Ecuación 1)
   donde:
   MC = contenido de humedad
   W = peso neto
   D = peso seco
2. Calcular la cantidad de agua que debe agregarse a 25 g de suelo para aumentar el contenido de humedad al 10% sobre una base de peso seco.
3. A continuación, añadir que la cantidad de agua a 25 g de suelo.
4. Cubra el envase con envoltura de plástico y perforar la película varias veces con una sonda para permitir la aireación durante la incubación. Fije la película con una banda elástica.
5. Pesar el suelo y envolver, luego incubar la muestra a temperatura ambiente durante una semana.

2. incubación e inoculación de hongos

1. Una vez finalizada la incubación, pesar la muestra de suelo con la goma y el plástico. Calcular la pérdida de peso debido a la pérdida de humedad.
2. Calcular el contenido de humedad de suelo nuevo.
3. A continuación, preparar una dilución al 1/10 serie de los suelos tal como se muestra en la figura 2. Esto resultará en diluciones de 10^-1 (frasco A), 10^-2 (tubo B), 10^-3 (tubo C), 10^-4 (tubo D) y 10^-5 (tubo E) g suelo por suspensiones de mL.
4. Preparación estéril Rose Bengal-estreptomicina placas de agar. El rosa Bengala y la estreptomicina inhiben el crecimiento bacteriano. Para terrenos muy fértiles donde las poblaciones de microbios del suelo son altas, las diluciones solicitadas deben ser mayores, es decir, 10^-3, 10^-4y 10^-5, g de suelo por placa.
5. A cada uno de los 10^-3 placas, Añadir 0,1 mL de dilución tubo 10^-2, y extensión sobre la superficie del agar utilizando una llama de etanol esterilizado separador de vidrio. Porque una cantidad de 0,1 mL es plateada, esto hace que la efectiva dilución 10^-3. Repita estos pasos para todas las diluciones.
6. Incubar las placas a temperatura ambiente durante una semana.

3. Colonia contando y el examen por microscopia

1. Realizar recuentos de colonias en la dilución una y sólo una de cada suelo. Las placas que se cuentan tengan colonias contables discretas. No deben contarse los platos demasiado grandes. Asimismo, no deben contar las placas con menos de 10 colonias. Observar y describir las características culturales de tres colonias diferentes.
2. Preparar montajes de cinta (tape transparente) de presión en las diapositivas para estudio detallado microscopio siguiendo el siguiente procedimiento:
   1. Depositar una gota de lactofenol montaje fluido en el centro de un portaobjetos de vidrio limpio
   2. Corte una tira de cinta de celofán transparente unos 3 cm de largo de la lista acciones. Para evitar contaminar la superficie adhesiva, usar pinzas al manipular la cinta. Una aguja de disección ayudará a liberar la cinta de los fórceps.
   3. El lado adhesivo de la cinta se aplica a la superficie de una colonia de hongo de esporulación. Tenga cuidado para evitar una presión excesiva sobre la cinta o una masa muy densa de hifas y las esporas serán recogidas.
   4. Retire la cinta de contacto con la colonia de hongos y aplicarlo, lado adhesivo hacia abajo, a la gota de líquido de montaje sobre el portaobjetos de cristal. Frote suavemente la cinta con un instrumento liso, plano para burbujas express.
   5. Examinar el cinta montaje microscópico con el objetivo de inmersión de aceite con aceite.
   6. Identificar dos géneros diferentes de hongos usando la clave de identificación de hongos suministrados (figura 4).

Figura 4. Clave de identificación de hongos.

Recuentos de colonias

El número de colonias de hongos por gramo de suelo es igual al número de colonias contadas en la placa multiplicada por el recíproco de la dilución plateada. Por ejemplo, si se cuentan las 46 colonias a una dilución de 10^-5, entonces la UFC por gramo de suelo es 46 x 10⁵ o 4.6 x 10⁶.

Identificación de tres géneros diferentes de hongos

Hongos pueden identificarse microscópicamente por la examinación de los cuerpos fructíferos y esporas. Una clave de identificación de hongos puede ayudar a este proceso. (Figura 4) Tipos de hongos comunes observaron incluyen Penicillium y Aspergillus.

Dilución y galjanoplastia de hongos del suelo pueden utilizarse como un indicador de la salud de un suelo. Normalmente un suelo fértil "sano" tendrá 10⁵ 10⁶ hongos por gramo de suelo. Puede utilizarse también para aislar cultivos puros de hongos específicos, posteriormente evaluados para propiedades específicas, tales como la capacidad de degradar compuestos orgánicos. Estos pueden ser perjudiciales como es el caso de los hongos de podredumbre blanca, o beneficiosos cuando tóxicos orgánicos son degradados a través de la biodegradación. Otros usos de cultivos puros de hongos incluyen el aislamiento de hongos antibióticos. Por ejemplo, el primer antibiótico fue alguna vez la penicilina, producida por el hongo Penicilliumdel suelo. Esto fue descubierto por Sir. Alexander Fleming en 1929.

1. Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
2. Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).