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Visualização de Microrganismos do Solo por Meio do Ensaio de Lâmina de Contato e Microscopia

Visão Geral

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

O solo compreende a fina camada na superfície da Terra, contendo fatores bióticos e abióticos que contribuem para a vida. A porção abiótica inclui partículas inorgânicas variando em tamanho e forma que determinam a textura do solo. A porção biótica incorpora resíduos vegetais, raízes, matéria orgânica e microrganismos. A abundância e a diversidade dos micróbios do solo são expansivos, pois um grama de solo contém 10 bactérias^7-8, 10^6-8 actinomycetes, 10^{fungos 5-6,} 10³ leveduras, 10 protozoários^4-6, 10^3-4 algas e 5 nematoides. Juntos, os fatores bióticos e abióticos formam arquiteturas em torno das raízes vegetais, conhecidas como rizosfera, que fornecem condições favoráveis para os microrganismos do solo.

Fatores bióticos e abióticos promovem a vida nos solos. No entanto, eles também contribuem com dinâmicas estressantes que limitam micróbios. O estresse biótico envolve competição entre a vida para se adaptar e sobreviver em condições ambientais. Por exemplo, micróbios podem secretar substâncias inibitórias ou tóxicas para prejudicar os microrganismos vizinhos. Penicillium notatum é um fungo notório, pois reduz a competição por nutrientes produzindo um antimicrobiano, que os humanos colhem para criar a penicilina farmacêutica. As tensões abióticas surgem de propriedades físicas ou químicas que limitam a sobrevivência microbiana, como luz, umidade, temperatura, pH, nutrientes e textura.

Procedimento

1. Preparação do Microcosmo do Slide do Solo

Colete o solo do jardim da superfície (profundidade de 0-6" e pese 150 g de solo em duas xícaras separadas.
1. Se o solo tem alta densidade de matéria orgânica, pesa 100 g.
Rotule uma xícara de "Tratamento" e a outra "Controle".
Calcule a quantidade de água necessária para alterar o teor de umidade.
1. O teor de umidade é muitas vezes próximo da capacidade de campo.
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Resultados

Fungos exibem higefa grossa e filamentosa(Figura 2). Actinomycetes exibem hifa fina e filamentosa. As bactérias exibem pequenas formas de cocci ou haste. Eles são frequentemente encontrados em aglomerados, em partículas do solo, ou forrando hifas fúngicas. As partículas do solo apresentam formas irregulares e escuras(Figura 3).

Figura 2. Entre em contato com a imagem do slide usan...

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Aplicação e Resumo

O ensaio de slide de contato, também referido como o deslizamento enterrado, é uma técnica simples utilizada para observar qualitativamente a biota do solo. Este ensaio mostra qualitativamente as interações espaciais entre hifae fúngica, filamentos de actinomíceto, bactérias e partículas do solo. Indivíduos ou indústria podem empregar este ensaio para reunir conhecimento sobre a saúde de um determinado solo no que diz respeito à agricultura, jardinagem, compostagem, ensino e estudo. No entanto, essa técnica...

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Referências

Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).

Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).

Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).

1. Preparação do Microcosmo do Slide do Solo

Colete o solo do jardim da superfície (profundidade de 0-6" e pese 150 g de solo em duas xícaras separadas.

Se o solo tem alta densidade de matéria orgânica, pesa 100 g.

Rotule uma xícara de "Tratamento" e a outra "Controle".

Calcule a quantidade de água necessária para alterar o teor de umidade.

O teor de umidade é muitas vezes próximo da capacidade de campo.

Meça a quantidade de água destilada com um cilindro graduado.

Despeje a quantidade de água destilada em dois frascos.

Rotule um frasco de "Tratamento" e o outro "Controle".

Altere a água no frasco "Tratamento" com glicose suficiente para uma concentração final de glicose do solo de 1%, de acordo com uma base de peso seco no solo "Tratamento".

Adicione 200 mg NH₄NO₃ no frasco "Tratamento" e mexa para dissolver as alterações. O nitrato serve como uma fonte de nitrogênio de nutrientes para os micróbios do solo.

Não altere o frasco "Controle".

Em pequenas alíquotas de aproximadamente 50 mgs, misture o conteúdo do frasco de "Tratamento" no copo "Tratamento". Mexa com uma espátula após cada adição de alíquota.

Em pequenas alíquotas, misture o conteúdo do frasco "Controle" no copo "Controle". Mexa com uma espátula após cada adição de alíquota.

Rotule quatro slides de microscópio limpos: dois slides "Treatment" e dois slides "Control".

Insira os dois slides "Treatment" no copo de solo "Treatment" e insira os dois slides "Control" no copo de solo "Control". Deixe 2 cm de cada slide projetando acima da superfície do solo, e certifique-se de deixar uma lacuna entre os dois slides.

Cubra os copos com plástico e fixe-o com um elástico.

Puna o envoltório várias vezes para permitir o ar, mas ainda assim evitar a evaporação excessiva.

Registo o peso das duas xícaras.

Incubar os copos cheios de solo à temperatura ambiente em uma área/incubadora designada por 7 dias.

2. Mancha de slides e microscopia

Registo o peso das duas xícaras.

Calcule a umidade do solo no momento da remoção do slide.

Remova os dois slides de cada xícara pressionando cada slide para uma posição inclinada e retirando para que a face superior do slide não seja perturbada.

Identifique e marque o lado do slide a ser manchado e observado.

Toque suavemente os slides na parte superior do banco para remover grandes partículas do solo.

Usando uma toalha de papel úmida, limpe a face inferior dos slides. Seque os slides à temperatura ambiente.

Usando óculos de proteção e segurando cada lâmina com fórceps, mergulhe os slides em 40% (v/v) ácido acético por 1-3 min sob um capô de fumaça.

Lave o excesso de ácido sob um fluxo suave de água.

Usando uma garrafa de porta-gotas, cubra a superfície dos slides com a fenólica Rose Bengala. Apoie o slide em um rack de manchas sobre um recipiente para pegar o excesso de mancha. Tenha cuidado, não lave com força que possa remover microrganismos da superfície dos slides.

Manche os slides por 5-10 min. Não deixe o slide ficar seco. Adicione mais manchas conforme necessário.

Lave delicadamente as lâminas para remover o excesso de manchas.

Deixe os slides secarem à temperatura ambiente.

Utilizando o objetivo de imersão do óleo, observe o slide usando um microscópio(Figura 1).

Figura 1. Um slide sob um microscópio.

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0:00

Overview

1:12

Principles of Soil Microorganisms

2:41

Soil Slide Microcosm Preparation

5:12

Slide Staining and Microscopy

6:47

Microscopy Results

7:32

Applications

9:40

Summary

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