Visualização de Microrganismos do Solo por Meio do Ensaio de Lâmina de Contato e Microscopia

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autor de Demonstração: Bradley Schmitz

O solo compreende a fina camada na superfície da Terra, contendo fatores bióticos e abióticos que contribuem para a vida. A porção abiótica inclui partículas inorgânicas variando em tamanho e forma que determinam a textura do solo. A porção biótica incorpora resíduos vegetais, raízes, matéria orgânica e microrganismos. A abundância e a diversidade dos micróbios do solo são expansivos, pois um grama de solo contém 10 bactérias^7-8, 10^6-8 actinomycetes, 10^{fungos 5-6,} 10³ leveduras, 10 protozoários^4-6, 10^3-4 algas e 5 nematoides. Juntos, os fatores bióticos e abióticos formam arquiteturas em torno das raízes vegetais, conhecidas como rizosfera, que fornecem condições favoráveis para os microrganismos do solo.

Fatores bióticos e abióticos promovem a vida nos solos. No entanto, eles também contribuem com dinâmicas estressantes que limitam micróbios. O estresse biótico envolve competição entre a vida para se adaptar e sobreviver em condições ambientais. Por exemplo, micróbios podem secretar substâncias inibitórias ou tóxicas para prejudicar os microrganismos vizinhos. Penicillium notatum é um fungo notório, pois reduz a competição por nutrientes produzindo um antimicrobiano, que os humanos colhem para criar a penicilina farmacêutica. As tensões abióticas surgem de propriedades físicas ou químicas que limitam a sobrevivência microbiana, como luz, umidade, temperatura, pH, nutrientes e textura.

Observar diretamente as inter-relações entre organismos do solo, partículas e comportamentos em ambientes variados do solo é difícil, mas o ensaio de slides de contato, também conhecido como técnica de deslizamento enterrado, desenvolvido por Rossi et al. (1936) fornece um ponto de vista instantâneo na microbiologia do solo. Este método é útil para observar fungos do solo, actinomycetes e bactérias através de microscopia. Embora não se destine a quantificações microbianas, pois implica apenas uma pequena porção de um ambiente heterogêneo maior.

Este método é facilmente executado enterrando um deslizamento de vidro no solo por vários dias, em seguida, fixando os microrganismos na lâmina com ácido acético. Os micróbios são manchados com corante rose bengala e observados via microscopia usando imersão de óleo no objetivo de 100X. Três grupos microbianos podem ser distinguidos, pois as bactérias aparecem como pequenas formas arredondadas, filamentos de actinomícetos como cordas finas, e hifas fúngicas como fios grossos. No solo, quase todas as bactérias são menores e mais redondas do que aquelas em cultura pura devido ao estresse nutricional, o que causa encolhimento e arredondamento para uma superfície mais favorável: razão de volume. As formas escuras irregulares não manchadas são partículas de solo. Diferentes alterações de nutrientes podem ser adicionadas ao solo para fornecer fontes de carbono e glicose que promovam o crescimento e as interações microbianas. Esta técnica permite fácil observação da microbiologia do solo e ajuda a identificar diversos organismos presentes no ambiente.

1. Preparação do Microcosmo do Slide do Solo

1. Colete o solo do jardim da superfície (profundidade de 0-6" e pese 150 g de solo em duas xícaras separadas.
   1. Se o solo tem alta densidade de matéria orgânica, pesa 100 g.
2. Rotule uma xícara de "Tratamento" e a outra "Controle".
3. Calcule a quantidade de água necessária para alterar o teor de umidade.
   1. O teor de umidade é muitas vezes próximo da capacidade de campo.
      
4. Meça a quantidade de água destilada com um cilindro graduado.
5. Despeje a quantidade de água destilada em dois frascos.
6. Rotule um frasco de "Tratamento" e o outro "Controle".
7. Altere a água no frasco "Tratamento" com glicose suficiente para uma concentração final de glicose do solo de 1%, de acordo com uma base de peso seco no solo "Tratamento".
8. Adicione 200 mg NH₄NO₃ no frasco "Tratamento" e mexa para dissolver as alterações. O nitrato serve como uma fonte de nitrogênio de nutrientes para os micróbios do solo.
9. Não altere o frasco "Controle".
10. Em pequenas alíquotas de aproximadamente 50 mgs, misture o conteúdo do frasco de "Tratamento" no copo "Tratamento". Mexa com uma espátula após cada adição de alíquota.
11. Em pequenas alíquotas, misture o conteúdo do frasco "Controle" no copo "Controle". Mexa com uma espátula após cada adição de alíquota.
12. Rotule quatro slides de microscópio limpos: dois slides "Treatment" e dois slides "Control".
13. Insira os dois slides "Treatment" no copo de solo "Treatment" e insira os dois slides "Control" no copo de solo "Control". Deixe 2 cm de cada slide projetando acima da superfície do solo, e certifique-se de deixar uma lacuna entre os dois slides.
14. Cubra os copos com plástico e fixe-o com um elástico.
15. Puna o envoltório várias vezes para permitir o ar, mas ainda assim evitar a evaporação excessiva.
16. Registo o peso das duas xícaras.
17. Incubar os copos cheios de solo à temperatura ambiente em uma área/incubadora designada por 7 dias.

2. Mancha de slides e microscopia

1. Registo o peso das duas xícaras.
2. Calcule a umidade do solo no momento da remoção do slide.
3. Remova os dois slides de cada xícara pressionando cada slide para uma posição inclinada e retirando para que a face superior do slide não seja perturbada.
4. Identifique e marque o lado do slide a ser manchado e observado.
5. Toque suavemente os slides na parte superior do banco para remover grandes partículas do solo.
6. Usando uma toalha de papel úmida, limpe a face inferior dos slides. Seque os slides à temperatura ambiente.
7. Usando óculos de proteção e segurando cada lâmina com fórceps, mergulhe os slides em 40% (v/v) ácido acético por 1-3 min sob um capô de fumaça.
8. Lave o excesso de ácido sob um fluxo suave de água.
9. Usando uma garrafa de porta-gotas, cubra a superfície dos slides com a fenólica Rose Bengala. Apoie o slide em um rack de manchas sobre um recipiente para pegar o excesso de mancha. Tenha cuidado, não lave com força que possa remover microrganismos da superfície dos slides.
10. Manche os slides por 5-10 min. Não deixe o slide ficar seco. Adicione mais manchas conforme necessário.
11. Lave delicadamente as lâminas para remover o excesso de manchas.
12. Deixe os slides secarem à temperatura ambiente.
13. Utilizando o objetivo de imersão do óleo, observe o slide usando um microscópio(Figura 1).

Figura 1. Um slide sob um microscópio.

Fungos exibem higefa grossa e filamentosa(Figura 2). Actinomycetes exibem hifa fina e filamentosa. As bactérias exibem pequenas formas de cocci ou haste. Eles são frequentemente encontrados em aglomerados, em partículas do solo, ou forrando hifas fúngicas. As partículas do solo apresentam formas irregulares e escuras(Figura 3).

Figura 2. Entre em contato com a imagem do slide usando a lente objetiva 100X.
Foto cortesia W.H. Fuller.

Figura 3. Entre em contato com a imagem do slide usando a lente objetiva 100X.
Foto cortesia W.H. Fuller.

O ensaio de slide de contato, também referido como o deslizamento enterrado, é uma técnica simples utilizada para observar qualitativamente a biota do solo. Este ensaio mostra qualitativamente as interações espaciais entre hifae fúngica, filamentos de actinomíceto, bactérias e partículas do solo. Indivíduos ou indústria podem empregar este ensaio para reunir conhecimento sobre a saúde de um determinado solo no que diz respeito à agricultura, jardinagem, compostagem, ensino e estudo. No entanto, essa técnica não quantifica a microbiota do solo, pois abrange apenas um pequeno retrato de um ambiente heterogêneo maior.

As relações com o organismo do solo podem ser observadas realizando o ensaio de slides de contato e visualizando os resultados através da microscopia de imersão em óleo 100X(Figuras 2 e 3). A simplicidade e facilidade para realizar este ensaio torna-o uma ótima técnica inicial para aqueles que nunca foram expostos à microbiologia e podem estar visualizando microrganismos através de um microscópio pela primeira vez.

1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).