Filamentöse Pilze

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Bradley Schmitz

Pilze sind Heterotrophe eukaryotische Organismen, und mit Ausnahme von Hefen sind aerob. Sie sind reichlich in Oberböden und sind wichtig für ihre Rolle in der Nährstoffkreisläufe und die Zersetzung von organischen Stoffen und organischen Verunreinigungen. Weiße Fäule Pilze (Phanerochaete Chryosporium) z. B. (Abbildung 1) bekanntermaßen Aromaten zu degradieren.

Abbildung 1. Fäulnis auf Birke weiß.

Böden enthalten in der Regel Millionen Pilze pro Gramm, so dass der Boden in der Regel verdünnt wird mit Hilfe einer Verdünnungsreihe. Eine Verdünnungsreihe erfolgt dadurch, dass eine bestimmte Menge an Boden bei einer Dispergier-Lösung wie deionisiertes Wasser. Die Aliquote der Suspensionen werden frische Lösung übertragen bis die Suspension ausreichend verdünnt wird, um einzelne diskrete pilzartige Kolonien auf Agarplatten wachsen zu lassen. (Abbildung 2)

Nach der Inokulation auf mehrere replizieren Agarplatten werden die Platten bei 25 ° c inkubiert. Nachdem die makroskopischen pilzartigen Kolonien gebildet sind, werden sie gezählt, wie in Abbildung 3dargestellt. Denn es davon ausgegangen wird, dass eine pilzartige Kolonie ist abgeleitet von einem Organismus, der Begriff Kolonie Bildenden Einheiten (KBE) in der abschließenden Analyse verwendet wird, mit den Resultaten ausgedrückt KBE pro Gramm Ofen trocknen Sie Boden.

Normale kultivierbare Pilze Grafen aus fruchtbaren Boden sind im Bereich von 10⁶-10⁶ Pilz "Brutkörper" (hyphal Fragmente, Sporen oder Hyphen) pro Gramm trockenen Boden. Kultivierbare Platte Grafen wurden zum Auflisten von Organismen seit dem 19. Jahrhundert gebräuchlich. Sie weiterhin heute verwendet werden, wie sie kostengünstig sind zu führen, erfordert wenig Arbeit, sind schnell und relativ reproduzierbar sind. Allerdings leiden sie an einer Anzahl von Fehlern, die bei der Bewertung der Ergebnisse berücksichtigt werden müssen. Die bedeutendste dieser Fehler ist die Tatsache, die viele Organismen nicht auf Medien Platten Kultur werden.

Abbildung 2: Verdünnung und Galvanik Technik. Hier die verdünnte Boden Aussetzung fließen direkt in das Agar-Medium anstatt Oberfläche angewendet wie im Falle der Verbreitung Beschichtung. Von Environmental & Verschmutzung Wissenschaft, 2^Nd Ed., Academic Press, San Diego, CA

Abbildung 3. Beschmutzen Sie Pilze isoliert von einer Oberfläche des Bodens in einer Petrischale mit Rose Bengal Agar gewachsen. Foto mit freundlicher Genehmigung k.l. Josephson. Von Environmental & Verschmutzung Wissenschaft, 2^Nd Ed., Academic Press, San Diego, Kalifornien.

1. Boden Probenvorbereitung

1. Ermitteln Sie zunächst den ursprünglichen Feuchtigkeitsgehalt des Bodens durch über Nacht trocknen von einer bekannten Menge des feuchten Bodens und Gegengutachten die getrockneten Boden. Die Gleichung den ursprünglichen Feuchtigkeitsgehalt des Bodens zu bestimmen ist:
   
   (Gleichung 1)
   Wo:
   MC = Feuchtigkeitsgehalt
   W = Nettogewicht
   D = Trockengewicht
2. Berechnen Sie die Menge des Wassers, die 25 g des Bodens erhöhen die Bodenfeuchte, 10 % auf einer trockenen Gewicht-Basis hinzugefügt werden muss.
3. Fügen Sie diese Menge an Wasser, 25 g des Bodens.
4. Decken Sie den Container mit Plastikfolie und Punktion des Films mehrmals mit einer Sonde zur Belüftung während der Inkubation zu ermöglichen. Befestigen Sie den Film mit einem Gummiband.
5. Wiegen des Bodens und wickeln, dann eine Woche Probe bei Raumtemperatur inkubieren.

(2) Pilz Impfung und Inkubation

1. Nach die Inkubation abgeschlossen ist, wiegen Sie die Bodenprobe mit Wrap und Gummiband. Berechnen Sie die Gewichtsabnahme durch den Feuchtigkeitsverlust von.
2. Berechnen Sie die neue Bodenfeuchte.
3. Als nächstes bereiten Sie eine Reihe von 1/10-Verdünnung der Böden wie in Abbildung 2dargestellt. Dadurch werden Verdünnungen von 10^-1 (a-Flasche), 10^-2 (Rohr B), 10^-3 (Rohr C), 10^-4 (Rohr D) und 10^-5 (Rohr E) g Erde pro mL Suspensionen.
4. Bereiten Sie sterile Rose Bengal-Streptomycin Agarplatten. Die Rose Bengal und Streptomycin hemmen Wachstum von Bakterien. Für sehr fruchtbaren Böden, wo Boden mikrobiellen Populationen hoch sind, die gewählten Verdünnungen sollte höher sein, d.h., 10^-310^-4und 10^-5g Boden pro Platte.
5. Zu jedem der 10^-3 Platten, fügen Sie 0,1 mL Verdünnung Röhre 10^-2und Verbreitung über die Agar-Oberfläche mit einer Ethanol-Flamme sterilisiert Glas Streuer. Weil eine Menge von 0,1 mL überzogen ist, macht dies die effektive Verdünnung 10^-3. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Verdünnungen.
6. Eine Woche inkubieren Sie Platten bei Raumtemperatur.

(3) Koloniezahlbestimmung und Prüfung durch Mikroskopie

1. Kolonie zählt nur eine Verdünnung von jeder Boden zu machen. Die Platten, die gezählt werden sollte diskrete zählbare Kolonien haben. Überwucherte Platten sollten nicht gezählt werden. Ebenso sollten die Platten mit weniger als 10 Kolonien nicht gezählt werden. Beachten Sie, und beschreiben Sie die kulturellen Besonderheiten von drei verschiedenen Kolonien zu.
2. Detaillierten Mikroskop Studie mithilfe des folgenden Verfahrens bereiten Sie Druck Klebeband (Tesafilm) Halterungen auf Folien vor:
   1. Hinterlegen Sie einen Tropfen Flüssigkeit in der Mitte des einen sauberen Objektträger Montage lactophenol
   2. Schneiden Sie einen Streifen von klaren Tesafilm etwa 3 cm lang aus dem Lager Rollen. Zur Vermeidung einer Kontamination der Klebefläche, verwenden Sie Zange beim Umgang mit des Bands. Sezierenden Nadel wird helfen, das Band von der Zange zu befreien.
   3. Die klebende Seite des Bandes wird die Oberfläche einer sporulating Pilz-Kolonie. Achten Sie darauf, übermäßigen Druck auf das Band oder zu dicht, eine Masse von Hyphen und Sporen werden gesammelt.
   4. Entfernen Sie das Klebeband vom Kontakt mit der Pilz-Kolonie und wenden sie, Klebeseite nach unten, bis die Tropfen Flüssigkeit auf den Objektträger zu montieren. Das Band mit einer glatten, flachen Instrument zur ausdrücklichen Luftblasen einmassieren.
   5. Prüfen Sie die Band Mount mikroskopisch unter dem Öl-Immersion-Ziel mit Öl.
   6. Identifizieren Sie zwei verschiedene Pilz-Gattungen mit den mitgelieferten Pilz Identifikationsschlüssel (Abbildung 4).

Abbildung 4. Pilz Identifikationsschlüssel.

Kolonie zählt

Die Anzahl der pilzartige Kolonien pro Gramm Boden ist gleich der Anzahl der Kolonien auf der Platte, multipliziert mit der Kehrwert der Verdünnung überzogen gezählt. Beispielsweise wenn bei einer Verdünnung von 10^-546 Kolonien gezählt werden, dann die KBE pro Gramm Boden ist 46 x 10⁵ oder 4.6 x 10⁶.

Identifizierung von drei verschiedenen Pilz-Gattungen

Pilze können durch Prüfung der Fruchtkörper und Sporen mikroskopisch identifiziert werden. Ein Pilze Identifikationsschlüssel kann diesen Prozess unterstützen. (Abbildung 4) Gängigen Pilze beobachtet gehören Penicillium und Aspergillus.

Verdünnung und Beschichtung von Bodenpilzen können als Indikator für die Gesundheit des Bodens verwendet werden. Normalerweise wird ein "gesunder" fruchtbaren Boden haben 10⁵ 10⁶ Pilze pro Gramm Boden. Es kann auch verwendet werden, um Reinkulturen von bestimmten Pilzen, anschließend ausgewertet für bestimmte Eigenschaften, z. B. die Fähigkeit, organische Verbindungen zersetzen zu isolieren. Diese können wie im Fall von Weißfäule-Pilze schädlich sein, oder vorteilhaft, wenn toxische organische Stoffe werden abgebaut durch biologischen Abbau. Andere Verwendungen von Reinkulturen von Pilzen gehören die Isolation von Pilzen für Antibiotika. Beispielsweise war das erste Antibiotikum Penicillin, produziert durch bodenbürtige Pilz Penicillium. Dies wurde erstmals von Sir entdeckt. Alexander Fleming im Jahr 1929.

1. Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
2. Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).