Cultivo e Enumeração de Bactérias de Amostras de Solo

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autores de Demonstração: Bradley Schmitz e Luisa Ikner

Solos superficiais são uma mistura heterogênea de partículas inorgânicas e orgânicas que se combinam para formar agregados secundários. Dentro e entre os agregados estão vazios ou poros que contêm visualmente ar e água. Essas condições criam um ecossistema ideal para bactérias, de modo que todos os solos contêm vastas populações de bactérias, geralmente mais de 1 milhão por grama de solo.

Bactérias são os mais simples dos microrganismos, conhecidos como procariotes. Dentro deste grupo procariótico, há os micróbios filamentosos conhecidos como actinomycetes. Os actinomycetes são na verdade bactérias, mas são frequentemente considerados um grupo único dentro da classificação de bactérias por causa de sua estrutura filamentosa, que consiste em múltiplas células amarradas juntas para formar hifa. Este experimento usa mídia de caso de glicerol que selecionam para colônias de actinomyceto, durante a diluição e o revestimento. Normalmente, os actinomycetes são aproximadamente 10% da população bacteriana total. Bactérias e actinomycetes são encontrados em todos os ambientes da Terra, mas a abundância e diversidade desses micróbios no solo é incomparável. Esses micróbios também são essenciais para a vida humana e afetam o que as pessoas comem, bebem, respiram ou tocam. Além disso, existem espécies bacterianas que podem infectar pessoas e causar doenças, e existem bactérias que podem produzir produtos naturais capazes de curar pessoas. Actinomiccetos são particularmente importantes para a produção de antibióticos, como a estreptomicina. As bactérias são fundamentais para o ciclismo de nutrientes, crescimento vegetal e degradação de contaminantes orgânicos.

As bactérias são altamente diversas em termos do número de espécies que podem ser encontradas no solo, em parte porque são fisiologicamente e metabolicamente diversas. As bactérias podem ser heterotróficas, o que significa que utilizam compostos orgânicos, como glicose, para alimentos e energia, ou autotróficas, o que significa que utilizam compostos inorgânicos, como enxofre elementar, para alimentos e energia. Eles também podem ser aeróbicos, utilizando oxigênio para respiração, ou anaeróbico, utilizando formas combinadas de oxigênio, como nitrato ou sulfato, para respirar. Algumas bactérias podem usar oxigênio ou formas combinadas de oxigênio e são conhecidas como anaerobes facultativos.

Uma maneira de enumerar o número de bactérias presentes em uma amostra de solo é utilizar a metodologia de diluição e revestimento. Essa metodologia utiliza o ágar como meio de crescimento bacteriano, um processo denominado "tecnologia cultural" Devido ao grande número de bactérias encontradas dentro dos solos, uma pequena amostra de solo é diluída em série na água, antes de ser banhado em ágar dentro de uma placa de Petri. Normalmente, uma pequena quantidade de solo contida dentro de 0,1 a 1 mL da suspensão do solo diluído é "espalhada" sobre a superfície da placa de ágar. As placas contêm ágar, que é derretido quando quente, mas sólido quando frio. Além do ágar, nutrientes, como levedura de peptona ou um produto comercialmente disponível como R₂A, são adicionados ao meio para permitir o crescimento de bactérias heterotróficas.

Diluição e revestimento é uma tecnologia barata e relativamente simples para a enumeração das bactérias do solo. No entanto, existem várias desvantagens para a técnica. Alguns erros e suposições comuns associados à diluição e ensaios de revestimento são os seguintes: presume-se que cada bactéria do solo dá origem a uma colônia, mas na realidade uma colônia pode surgir de uma moita de células, resultando em uma subestimação da verdadeira contagem cultural. Durante a diluição seriada do solo, as partículas do solo podem se estabelecer (cair para o fundo), de modo que a verdadeira alíquota do solo não é transmitida para a próxima diluição. Muitos micróbios do solo são viáveis, mas não culturais. Bactérias de crescimento lento podem não resultar em colônias visíveis dentro de um período de tempo razoável (1-2 semanas).

Além disso, as bactérias anaeróbicas não crescem em condições aeróbicas, e as bactérias que crescem são selecionadas pelos nutrientes adicionados ao meio. Assim, R₂A seleciona para bactérias heterotróficas, enquanto o enxofre elementar seleciona para oxidantes de enxofre autotrófico. No geral, estima-se que apenas 0,1 a 1% de todas as bactérias do solo podem ser cultivadas. Portanto, a diluição e o revestimento de bactérias do solo só explicam bactérias culturaveis e subestimam a verdadeira população viável do solo por uma a duas ordens de magnitude. Um exemplo de colônias bacterianas heterotróficas resultantes da diluição do solo e do revestimento é mostrado na Figura 1. Note que aproximadamente 1 milhão de células bacterianas são necessárias para que uma colônia seja visível a olho nu.

Este experimento demonstra a metodologia de diluição e difusão de revestimento utilizada para enumerar o número de bactérias dentro de uma amostra de solo. Especificamente, duas mídias são usadas: uma projetada para todas as bactérias, e outra que seleciona para actinomycetes. Uma vez que as colônias bacterianas tenham crescido nas placas de ágar, isole as culturas puras das colônias selecionadas usando uma técnica de placa de raia. Tais culturas puras podem então ser mais analisadas e caracterizadas para traços e funções específicas.

Figura 1. Colônias heterotróficas em uma placa de ágar R₂A. Uma série de colônias discretas com morfologia diversificada surgem após a diluição e o revestimento do solo. Permissão de uso concedida pela Academic Press.

1. Preparação de Diluições do Solo

1. Para iniciar o procedimento, pese 10 g de amostra de solo e adicione a 95 mL de água deionizada. Agite bem a suspensão, e rotule como "A".
2. Antes que o solo se instale, remova 1 mL da suspensão com uma pipeta estéril e transfira-a para uma água deionizada de 9 mL em branco. Vórtice completamente, e rotular como "B".
3. Repita esta etapa de diluição três vezes, cada vez com 1 mL da suspensão anterior e uma água deionizada de 9 mL em branco. Rotule-os sequencialmente como tubos C, D e E. Isso resulta em diluições seriais de 10^-1 a 10^-5 gramas de solo por mL

2. Fazer placas de difusão para a cultura bacteriana

1. Para cultivar colônias bacterianas, pegue três placas de ágar de peptone-levedura pré-preparadas e rotule-as como amostras C, D e E. Vortex C, D e E, e pipeta 0,1 mL em cada prato. Isso aumenta ainda mais o valor de diluição, por um fator de dez (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Em seguida, mergulhe um espalhador de vidro no etanol. Coloque o espalhador em chamas por alguns segundos para acender e queimar o etanol. Isso esterilizará o espalhador.
3. Segure o espalhador acima da primeira placa até que a chama seja apagada. Abra a placa rapidamente, segurando a tampa por perto. Toque o espalhador para o ágar longe do áculo (Inoculum = células usadas para começar uma cultura) para esfriar, e depois espalhe a gota de inóculo ao redor da superfície do ágar até que traços de líquido livre desapareçam. Substitua a tampa da placa.
4. Re-flame o espalhador e repita o processo com a próxima placa, trabalhando rapidamente para não contaminar o ágar com organismos aéreos
5. Incubar as placas de bactérias à temperatura ambiente por 1 semana. Certifique-se de que as placas estão invertidas durante a incubação para evitar que gotas de umidade de condensação caiam sobre a superfície do ágar.

3. Fabricação de placas de difusão para Actinomycetes

1. Para cultivar actinomycetes, pegue três placas de glicerol pré-preparadas e rotule-as como B, C e D. Utilizando as técnicas mostradas anteriormente, espalhe placa de 0,1 mL das suspensões B, C e D. As diluições mais baixas são utilizadas porque os actinomycetes estão tipicamente presentes como 1/10 da população bacteriana (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Incubar as placas de actinomycete (invertidas) à temperatura ambiente por 2 semanas.

4. Contagem de bactérias e actinomycetos

1. Após a incubação, examine cuidadosamente todas as placas de bactérias e note diferenças no tamanho e forma da colônia. Quando cultivadas em ágar, as bactérias produzem colônias viscosas que vão de incolor a laranja brilhante, amarelo ou rosa. Em contraste, as colônias de actinomycete são calcéticas, firmes, de couro, e quebrarão sob pressão, onde outras colônias bacterianas irão manchar. Isso permite que as colônias sejam distinguidas pelo contato com um laço estéril.
2. Conte e regise o número de colônias bacterianas, incluindo quaisquer actinomycetes. Só conte placas com 30-200 colônias por placa.

5. Isolamento de Culturas Puras

1. Selecione colônias bacterianas individuais de qualquer uma das placas. Mais colônias podem ser selecionadas se houver interesse particular no solo. Use uma placa de diluição alta, pois tende a ter colônias puras que são bem separadas. Escolha apenas colônias bem separadas das colônias vizinhas e pareça morfologicamente distintas umas das outras.
2. Esterilize o laço mergulhando-o em álcool e flamejando-o. Abra rapidamente a placa de Petri de interesse, e toque o laço em um ponto nu no ágar para esfriá-lo. Em seguida, remova uma pequena quantidade de uma colônia de interesse no loop.
3. Tomando uma placa de levedura de peptone fresco, faça uma raia de alguns centímetros de comprimento de um lado. Esterilizar e esfriar novamente, depois faça uma raia que cruza a raia inicial apenas na primeira passagem. Repita este processo mais duas vezes da mesma maneira. Essa "diluição" de streaking resulta em células no loop sendo separadas umas das outras. Coloque a placa em uma área escura para incubar em temperatura ambiente por duas semanas.

Uma amostra de 10 g de solo com teor de umidade de 20% em base de peso seco é analisada para bactérias culturaveis viáveis através de técnicas de diluição e revestimento. As diluições foram feitas conforme mostrado na Tabela 1. 1 mL de solução E é derramado em um meio apropriado e resulta em 200 colônias bacterianas.

Mas, por 10 g de solo úmido,

Portanto

Tabela 1: Diluição e revestimento das amostras.

Existem duas aplicações fundamentais de diluição e revestimento de bactérias do solo. A primeira aplicação é a enumeração de bactérias culturais dentro de um determinado solo. A quantificação do número de bactérias do solo indica a saúde do solo. Por exemplo, se houver 10⁶ a 10⁸ bactérias culturable presentes por grama de solo, este seria considerado um número saudável. Um número inferior a 10⁶ por grama indica pior saúde do solo, o que pode ser devido à falta de nutrientes encontrados em solos de baixa matéria orgânica; estresse abiótico imposto por valores extremos de pH do solo (pH < 5 ou > 8); ou toxicidade imposta por contaminantes antropogênicos orgânicos ou inorgânicos.

A segunda maior aplicação é a visualização e isolamento de culturas puras de bactérias. As culturas puras podem posteriormente ser caracterizadas e avaliadas para características específicas que podem ser úteis em aplicações médicas ou ambientais. Exemplos incluem: produção de antibióticos; biodegradação de orgânicos tóxicos; ou rizobia específica útil para fixação de nitrogênio por culturas legúminous, como ervilhas ou feijões.