Coloração de Gram de bactérias de fontes ambientais

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner

O espectro de pesquisas em microbiologia ambiental é amplo em escopo e potencial de aplicação. Se o trabalho é de bancada com isolados bacterianos conhecidos, ou no campo coletando amostras de solo ou água contendo isolados bacterianos desconhecidos, a capacidade de discernir rapidamente e visualmente populações culturais de interesse permanece de grande importação para microbiologistas ambientais ainda hoje com a abundância de técnicas moleculares disponíveis para uso. Este vídeo demonstrará uma dessas técnicas, conhecida como mancha gram.

A mancha de Gram é uma técnica clássica e importante de coloração que permanece amplamente utilizada por microbiologistas ambientais. Semelhante a uma simples mancha, permite a avaliação da morfologia celular bacteriana (por exemplo,cocci, hastes, esporos- ex), tamanho e arranjo(por exemplo,cadeias ou aglomerados). Além disso, permite diferenciar bactérias em dois grupos distintos de princípios — Gram-negativo e Gram-positivo — de acordo com a composição e estrutura da parede celular(Figura 1).

A coloração de grama é um processo de várias etapas. Antes da coloração, uma mancha bacteriana é preparada usando uma cultura de placa, inclinação ou caldo. A preparação para a mancha é seca e fixada em uma lâmina de vidro limpa. Uma mancha primária de violeta cristalina é então aplicada à mancha fixa. O violeta cristalina é uma mancha básica composta por íons coloridos carregados positivamente (ou seja, cromóforos) que formam ligações iônicas fracas com grupos funcionais negativamente carregados presentes na parede celular bacteriana. Depois de enxaguar suavemente o toboágua com água, o iodo de Gram é aplicado, e forma complexos insolúveis com o cristal violeta na parede celular. Os complexos de cristal violeta-iodo se ligam ainda mais com peptidoglycan, um componente principal das paredes celulares bacterianas. Após uma segunda lavagem de água, um agente descolorante é brevemente aplicado à mancha. Para bactérias Gram-negativas, o complexo cristalino-iodo é lavado durante a etapa de descoloração, com bactérias Gram-positivas retendo a mancha roxa. Uma terceira e última lavagem de água é seguida por uma contra-mancha de safran que colore as bactérias Gram-negativas rosa ou vermelha.

Figura 1. Comparação da parede celular de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.

1. Coleta de Amostras

1. Coletar amostras de solo e transportar para o laboratório para análise microbiana.
2. No laboratório, pese uma amostra de 10 g usando um equilíbrio analítico.
3. Diluir a amostra 1:10 em 95 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (10 partes de solo equivale a 5 partes de líquido aquoso) e vórtice para misturar(Figura 2, Passo 1).
4. Realizar diluições subsequentes de 1:10 até pelo menos 10^-5 g de solo por mL, e diluições selecionadas em placas de propagação em réplicas de dois ou três em um meio de ágar de baixo nutriente(por exemplo,R2A) (Figura 2, Passos 2-3).
5. Incubar as placas durante uma semana em temperatura ambiente(Figura 2, Passo 4).
6. Selecione uma ou duas colônias para isolamento e listrada em placas de ágar fresco(Figura 3, Passos 1-3).
7. Incubar as placas de raia por dois a três dias em temperatura ambiente(Figura 3, Passo 4).

2. Preparação de manchas bacterianas

1. Observe as placas de listras para colônias isoladas.
2. Para preparar cada preparação de difamação, mergulhe um laço inoculante em etanol, esterilizar a chama e coloque de 1 a 2 laços de água destilada estéril no centro de lâminas de vidro pré-limpas.
3. Esterilize o laço de inoculação novamente como descrito anteriormente. Uma vez resfriado, remova uma pequena quantidade de cultura de uma única colônia isolada e misture-a com as gotículas de água no escorregador (a mancha deve se assemelhar ao leite desnatado diluído). O laço inoculante deve ser resfriado antes do isolamento da colônia. Um laço muito quente fará com que a colônia e/ou o meio espirrem, o que pode levar à aerossolização de bactérias. Geralmente, quando o laço é muito quente para uso, um som "assobiar" será ouvido quando aplicado ao ágar ou colônia. O resfriamento inadequado do loop também pode resultar em transferência de cultura para slide menos eficiente e distorção da morfologia celular.
4. Espalhe a mancha sobre a superfície do slide medindo aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm, e deixe-a secar. É importante que a secagem do ar ocorra sob condições de fluxo laminar. Os slides não devem ser secados para não interromper a mancha. Além disso, os slides não devem ser secos à chama, a fim de manter a morfologia celular.
5. Após a secagem, o calor corrija a mancha passando rapidamente pelo escorregador através de uma chama de 2-3x. O slide não deve ser mantido parado na chama, para evitar distorção da morfologia celular e/ou danos ao escorregador de vidro.

3. Mancha de grama

1. Fixar o slide em uma extremidade usando um grampo de roupa limpo.
2. Cubra a mancha com violeta cristalina (mancha primária) e segure por 2 a 3 minutos.
3. Lave cuidadosamente o escorregador com água destilada. O fluxo de água não deve ser direcionado para a mancha, a fim de evitar danos e/ou desprendimento da lâmina de vidro.
4. Cubra a mancha com o iodo do Gram e segure por 2 minutos, depois enxágue suavemente o toboágua com água.
5. Descolorir a mancha usando 95% de etanol até que a mancha não lave mais do escorregador (isso geralmente não leva mais de 20 s dependendo da espessura da mancha), depois enxágue imediatamente com água destilada. Esta etapa é fundamental para evitar a descoloração excessiva do slide, o que pode levar a uma designação falsa de mancha gram (ou seja, variável Gram).
6. Adicione a contra-mancha (safranin) à mancha e segure por 30 s. Em seguida, enxágue suavemente o escorregador com água destilada e enxugue a mancha usando papel absorvente.

4. Observação microscópica de slides

1. Observe os slides usando objetivos baixos (por exemplo,4X ou 10X), de alta seca(por exemplo,40X) e de imersão de óleo (100X). Para imersão em óleo, adicione o óleo diretamente à mancha.
2. Para obter resultados representativos de bactérias do solo Gram-positivo e Gram-negativos, consulte as Figuras 4 e 5.

Figura 2. Técnica de diluição e revestimento de difusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Isolamento da colônia usando a técnica da placa de raia.

Figura 4. Gram-positivo bactéria do solo Staphylococcus aureus.

Figura 5. Gram-negativo bactéria do solo Escherichia coli.

A mancha de Gram é usada nos muitos subágros da microbiologia ambiental e clínica. Cientistas de qualidade da água podem usar a mancha de Gram como uma ferramenta confirmatória para a detecção de bactérias fecais em amostras de água. Isolados bacterianos de solos são manchados de Gram para caracterizar ainda mais as comunidades de solos culturais. Para microbiologistas ambientais, a mancha de gram auxilia na categorização das populações bacterianas de acordo com a estrutura da parede celular. Isso, por sua vez, fornece informações sobre a capacidade geral de uma determinada comunidade microbiana de suportar a dessecação e outros estressores ambientais. O conhecimento da designação de manchas gram também é importante na pesquisa e desenvolvimento de desinfetantes e outros antimicrobianos, já que as bactérias Gram-positivas tendem a ser mais resistentes à inativação por químicas particulares do que as bactérias Gram-negativas.

Para aplicações clínicas de microbiologia, a mancha de Gram é usada para confirmar a identidade dos agentes de doenças bacteriológicas, juntamente com os métodos tradicionais de diagnóstico. É também de grande ajuda quando a colheita falhou, ou não é uma opção. A coloração gramada de amostras clínicas pode revelar a presença de agentes etiológicos que podem não ter sido observados de outra forma.