Isolamento de bactérias fecais de amostras de água por filtração

Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner

A qualidade da água destinada ao uso em ambientes agrícolas, recreativos e domésticos é de grande importância devido ao potencial de surtos de doenças transmitidas pela água. Agentes microbianos implicados em tais eventos incluem parasitas, bactérias e vírus que são derramados em alto número nas fezes de pessoas e animais infectados. A transmissão para hospedeiros novos e suscetíveis pode ocorrer através da rota fecal-oral após a ingestão de água contaminada. Portanto, a capacidade de monitorar as fontes de água para a presença de microrganismos patogênicos é significativa para garantir a saúde pública.

Devido ao grande número e variedade de potenciais patógenos fecais-orais que podem estar presentes na água e suas concentrações variáveis, é impraticável e caro ensaio diretamente para cada um deles regularmente. Portanto, os ensaios microbiológicos para monitoramento da qualidade da água empregam bactérias indicadoras de coliformes. Coliformes compreendem, em parte, a microflora intestinal normal de mamíferos de sangue quente, não são patogênicos, e são consistentemente excretados nas fezes. Portanto, a detecção de bactérias coliformes na água significa que ocorreu uma liberação fecal, e que microrganismos patogênicos prejudiciais também podem estar presentes.

A técnica de filtragem de membrana é utilizada para avaliar a qualidade microbiológica da água, ensaio para bactérias indicadoras fecais. Uma quantidade de água (por exemplo, 100 mL) é passada através de um filtro de membrana especializado com um tamanho médio mínimo de 0,45 μm, facilitando a captura de bactérias, pois são aproximadamente 1-μm de tamanho. Após a filtragem, a membrana é cuidadosamente aplicada a um meio de cultura agarose especializada, e incubada sob as condições adequadas à cultura dos microrganismos alvo.

Quando aplicada para uso no monitoramento da qualidade da água, a filtragem de membrana é mais ideal para fontes de baixa turbidez, como água potável, piscinas e águas recreativas naturais, como lagos e reservatórios. Águas ricas em material particulado (por exemplo, esgoto bruto) resultarão em incrusção do filtro; portanto, apenas volumes menores (por exemplo, 100 mL) podem ser analisados. A filtragem de membrana também não é prática para fontes de água com grande número de bactérias de fundo (ou não coliformes), o que pode aumentar a dificuldade de enumerar as bactérias coliformes alvo no meio da ágarose após a incubação.

Este vídeo demonstra a coleta de amostras de água potável e água ambiental, a filtragem de membrana das amostras e a enumeração de vários tipos de colônias bacterianas indicadoras fecais utilizando meios de crescimento especializados, incluindo coliformes totais, coliformes fecais e enterococci fecal. Também são mostrados testes realizados para verificar colônias presuntivas.

1. Coleta e Processamento de Amostras de Água

1. Coletar várias amostras de água 1-L da fonte de água de teste (por exemplo, fontes de água, piscinas, reservatórios, sistemas de distribuição de água, esgoto bruto ou tratado), e transportar gelo para o laboratório para análise microbiana.
2. Esterilize ou higienize o conjunto de coletores de filtragem de membrana antes do uso por autoclaving, exposição à radiação UV (2 min) ou ignição por etanol-chama.
3. Após o resfriamento de todas as peças, conecte corretamente o coletor a uma bomba de vácuo e frasco de resíduo de filtragem de vácuo contendo alvejante.
4. A chama de etanol esteriliza um par de fórceps e, com eles, remove um filtro de membrana estéril e gridded de sua embalagem. São tipicamente utilizadas membranas de 47 mm de diâmetro com tamanho de poros de 0,45 μm. No entanto, diâmetros alternativos e tamanhos de poros podem ser empregados desde que o tamanho dos poros possa prender suficientemente os microrganismos alvo, e pelo menos 70% da área do filtro é composta por espaço poroso.
5. Coloque o filtro no centro da área de filtragem da membrana do coletor, e aplique um funil de filtro estéril na unidade e fixá-lo no lugar.
6. Meça um volume desejado de água de teste (por exemplo, 100 mL) e adicione-a ao funil (uma marca de linha de 100 mL é visível no funil).
7. Aplique um vácuo parcial [diferencial de pressão de 34 a 51 kPa (kiloPascals)] para desenhar a amostra de ensaio através do filtro. Material sólido total suspenso, incluindo bactérias e matéria orgânica em decomposição, maior do que o tamanho médio do poros do filtro de 0,45 μm estão presos no filtro. Partículas menores, incluindo vírus e sólidos dissolvidos, como pequenas quantidades de matéria orgânica e sais, passarão pela membrana e pelo frasco de vácuo do recipiente de resíduos contendo alvejante.
8. Após a passagem completa da amostra através do filtro, enxágue o interior do funil com volumes de 20 a 30 mL de água estéril.
9. Desligo o vácuo e remova o funil do coletor após o fechamento da lavagem final.
10. Com fórceps esterilizados com chama de etanol, remova imediatamente o filtro de membrana da unidade e coloque-o prontamente no meio de agarose de crescimento adequado para o microrganismo alvo (a Tabela 1 lista as condições recomendadas de mídia de crescimento e incubação para cada um).
11. Aplique o filtro de membrana na superfície da ágarose com um movimento tipo rolo para garantir o contato completo da membrana com o meio de crescimento e evitar a armadilha das bolhas de ar.
12. Substitua o funil de filtragem usado por uma unidade estéril entre o processamento de cada amostra e o etanol-higienize o coletor de aço inoxidável, a fim de evitar a contaminação cruzada.

2. Enumeração da Colônia

1. Após o período de incubação, remova as placas de crescimento da incubadora para enumeração.
2. Idealmente, realizar a contagem da colônia sob baixa ampliação de energia usando uma fonte de luz branca fria.
3. Coliformes totais
   1. Colônias coliformes totais são tipicamente rosa a vermelho-escuro na cor com um brilho de superfície metálica. O brilho em si pode cobrir parcial ou completamente a colônia. Morfologias totais de colônia coliformes atípicas podem ser vermelhas, mucoides ou nucleadas sem brilho.
   2. Colônias que são rosa, azul, branca ou incolor enquanto sem brilho são consideradas não coliformes.
4. Coliformes fecais
   1. Colônias coliformes fecais aparecem como vários tons de azul.
   2. Colônias coliformes não-africanas são cinza para creme na cor.
5. Enterococci fecal
   1. As colônias de enterococci fecal variam de cor rosa a vermelho escuro.

3. Verificação da Colônia

1. Coliformes totais
   1. Para uma verificação presença-ausência, cotonete toda a membrana usando um laço inoculante estéril. Para colônias, é preferível verificar pelo menos cinco de morfologias típicas e atípicas.
   2. Transfira a colônia selecionada para um vaso de vidro contendo caldo de lauryl tryptose com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 35±0,5 °C por 48 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como um coliforme.
2. Coliformes fecais
   1. Transfira colônias de cor azul asepticamente em vasos de vidro contendo meio EC estéril com um tubo durham. Incubar os tubos inoculados a 44,5 ± 0,2 °C por 24 h. A presença de turbidez indicando crescimento em conjunto com a produção de gás verifica a colônia como coliforme fecal.
3. Enterococci fecal
   1. Colônias de greve tipificando a morfologia de enterococci fecal para isolamento asepticamente no Ágar de Infusão Cérebro-Coração (BHIA), e incubam a 35 ± 0,5 °C por 24 a 48 h.
   2. Transfira o crescimento de uma colônia isolada na BHIA para dois slides de vidro pré-limpos.
   3. Adicione duas a três gotas de peróxido de hidrogênio de 3% para manchas preparadas nos slides. O aparecimento rápido de bolhas indica um resultado "catalase positivo", e o isolado não é uma bactéria estreptococo fecal.
   4. Realize uma mancha gram para testes isolados como "catalase negativo" (sem bolhas observadas). Enterococci fecal são Gram-positivos, vazios, e aparecem principalmente em pares ou cadeias curtas.

Mesa 1. Mídia de crescimento cultural comumente utilizada para a detecção de indicadores bacterianos fecais em amostras ambientais
¹ Conforme recomendado pelos Métodos Padrão para o Exame de Água e Esgoto (American Public Health Asssociation and the American Water Works Association, 22ª Edição, 2012)

A filtragem da membrana é usada na captura e concentração de vírus da água. Os vírus patogênicos humanos carregam uma carga negativa líquida em soluções aquáticas, e muitas vezes estão presentes em baixos níveis nas fontes de água. Portanto, devem estar concentrados antes da análise. Filtração de membrana é apenas um método de captura para este fim, e emprega um filtro carregado negativamente. As amostras de água (por exemplo, 1-L) de interesse são alteradas com uma solução de sal (por exemplo,cloreto de magnésio) para transmitir uma carga positiva aos vírus, facilitando assim sua adsorção ao filtro de membrana HA carregado negativamente à medida que a água é filtrada. Uma solução de ácido de baixa concentração é usada para enxaguar a membrana e livrá-la do excesso de sais. Uma baixa concentração e volume de hidróxido de sódio é então usado para liberar os vírus do filtro antes de novas concentrações e análises (por exemplo, ensaios de infectidade da cultura celular ou PCR quantitativo).

A filtragem de membrana também é utilizada na produção de água de processo de alta pureza para uso industrial. Muitas indústrias exigem água altamente purificada para seus processos operacionais. A filtragem da membrana (por exemplo, nano-filtração) serve para remover contaminantes, incluindo metais e sais dissolvidos da água. A filtragem da membrana também é usada na dessalinização da água salgada para produzir água potável.