Funghi filamentosi

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz

I funghi sono organismi eucariotici eterotrofici e, ad eccezione dei lieviti, sono aerobici. Sono abbondanti nei terreni superficiali e sono importanti per il loro ruolo nel ciclo dei nutrienti e nella decomposizione della materia organica e dei contaminanti organici. I funghi marciume bianchi (phanerochaete chryosporium) per esempio, (Figura 1) sono noti per degradare gli aromatici.

Figura 1. Marciume bianco su betulla.

I terreni contengono generalmente milioni di funghi per grammo, quindi il terreno viene in genere diluito utilizzando una serie di diluizione. Una serie di diluizione viene effettuata sospendendo una data quantità di terreno in una soluzione dispersiva, come l'acqua deionizzata. Le aliquote delle sospensioni vengono quindi trasferite in soluzione fresca, fino a quando la sospensione non viene diluita sufficientemente da consentire alle singole colonie fungine discrete di crescere sulle piastre di agar. (Figura 2)

Dopo l'inoculazione su diverse piastre di agar replicate, le piastre vengono incubate a 25 °C. Dopo che le colonie fungine macroscopiche si sono formate, vengono contate, come mostrato nella Figura 3. Poiché l'ipotesi è che una colonia fungina sia derivata da un organismo, il termine Unità formanti colonie (CFU) viene utilizzato in analisi finale, con i risultati espressi in termini di CFU per grammo di terreno secco del forno.

I normali conteggi fungini coltivabili dal terreno fertile sono nell'intervallo di 10^{6-10 6} "propaguloli" fungini (spore, ife o frammenti ifali) per grammo di terreno asciutto. I conteggi delle piastre coltivabili sono stati utilizzati per enumerare gli organismi dal diciannovesimo secolo. Continuano ad essere utilizzati oggi, in quanto sono poco costosi da eseguire, richiedono poco lavoro, sono veloci e sono abbastanza riproducibili. Tuttavia, soffrono di una serie di errori, che devono essere considerati quando si valutano i risultati. Il più significativo di questi errori è il fatto che molti organismi non si svilupperanno su piastre di supporto.

Figura 2. Tecnica di diluizione e placcatura. Qui, la sospensione del terreno diluito viene incorporata direttamente nel mezzo agar piuttosto che essere applicata in superficie come nel caso della placcatura diffusa. Da Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed., Academic Press, San Diego, CA

Figura 3. Funghi del suolo isolati da un terreno superficiale coltivato in una capsula di Petri contenente Rose Bengal Agar. Foto per gentile concessione di K.L. Josephson. Da Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed., Academic Press, San Diego, CA.

1. Preparazione del campione di terreno

1. In primo luogo, determinare il contenuto di umidità iniziale del terreno mediante essiccazione notturna di una quantità nota di terreno umido e ripesatura del terreno essiccato. L'equazione per determinare il contenuto di umidità iniziale del terreno è:
   
   (Equazione 1)
   dove:
   MC = contenuto di umidità
   W = peso netto
   D = peso a secco
2. Calcola la quantità di acqua che deve essere aggiunta a 25 g di terreno per aumentare il contenuto di umidità del suolo al 10% su una base di peso secco.
3. Quindi, aggiungi quella quantità di acqua a 25 g di terreno.
4. Coprire il contenitore con pellicola trasparente e forare il film più volte con una sonda per consentire l'aerazione durante l'incubazione. Fissare il film con un elastico.
5. Pesare il terreno e avvolgere, quindi incubare il campione a temperatura ambiente per una settimana.

2. Inoculazione e incubazione di funghi

1. Al termine dell'incubazione, pesare il campione di terreno con l'involucro e l'elastico. Calcola la perdita di peso dovuta alla perdita di umidità.
2. Calcola il nuovo contenuto di umidità del suolo.
3. Quindi, preparare una serie di diluizione 1/10 dei terreni come mostrato nella Figura 2. Ciò comporterà diluizioni di 10^-1 (bottiglia A), 10^-2 (tubo B), 10^-3 (tubo C), 10^-4 (tubo D) e 10^-5 (tubo E) g di terreno per mL di sospensioni.
4. Preparare piatti sterili di agar Rose Bengal-streptomycin. Sia il Rose Bengal che la streptomicina inibiscono la crescita batterica. Per terreni molto fertili dove le popolazioni microbiche del suolo sono elevate, le diluizioni scelte dovrebbero essere più alte, cioè10^-3,10^-4e 10^-5,g di terreno per piatto.
5. A ciascuna delle 10^-3 piastre, aggiungere 0,1 ml dal tubo di diluizione 10^-2e distribuire sulla superficie dell'agar utilizzando uno spandi vetro sterilizzato a fiamma di etanolo. Poiché una quantità di 0,1 ml è placcata, questo rende la diluizione effettiva 10^-3. Ripetere questi passaggi per tutte le diluizioni.
6. Incubare le piastre a temperatura ambiente per una settimana.

3. Conteggio delle colonie ed esame al microscopio

1. Fai in modo che le colonie contino a una e una sola diluizione di ciascun terreno. Le piastre che vengono contate dovrebbero avere colonie numerabili discrete. I piatti troppo cresciuti non dovrebbero essere contati. Allo stesso modo, le piastre con meno di 10 colonie non dovrebbero essere contate. Nota e descrivi le caratteristiche culturali di tre diverse colonie.
2. Preparare i supporti a nastro a pressione (nastro trasparente) su vetrini per lo studio dettagliato del microscopio utilizzando la seguente procedura:
   1. Depositare una goccia di liquido di montaggio lattofenolo al centro di un vetrino pulito
   2. Tagliare una striscia di nastro di cellophane trasparente lunga circa 3 cm dal rotolo di scorta. Per evitare di contaminare la superficie adesiva, utilizzare una pinetta durante la manipolazione del nastro. Un ago di dissezione aiuterà a liberare il nastro dalla pinzetta.
   3. Il lato adesivo del nastro viene applicato sulla superficie di una colonia di funghi sporulanti. Fare attenzione ad evitare una pressione eccessiva sul nastro o una massa troppo densa di ife e spore verrà raccolta.
   4. Rimuovere il nastro dal contatto con la colonia di funghi e applicarlo, lato adesivo verso il basso, alla goccia di fluido di montaggio sul vetrino. Strofinare delicatamente il nastro con uno strumento liscio e piatto per esprimere bolle d'aria.
   5. Esaminare il supporto del nastro microscopicamente sotto l'obiettivo di immersione dell'olio con olio.
   6. Identificare due diversi generi fungini utilizzando la chiave di identificazione fungina fornita (Figura 4).

Figura 4. Chiave di identificazione fungina.

Conteggi delle colonie

Il numero di colonie fungine per grammo di terreno è pari al numero di colonie contate sulla piastra moltiplicato per il reciproco della diluizione placcata. Ad esempio, se 46 colonie vengono contate a una diluizione di 10^-5, allora il CFU per grammo di terreno è 46 x 10⁵ o 4,6 x 10⁶.

Identificazione di tre diversi generi fungini

I funghi possono essere identificati microscopicamente dall'esame dei corpi fruttiferi e delle spore. Una chiave di identificazione dei funghi può aiutare questo processo. (Figura 4) I tipi di funghi comuni osservati includono Penicillium e Aspergillus.

La diluizione e la placcatura dei funghi del suolo possono essere utilizzate come indicazione della salute di un suolo. Normalmente un terreno fertile "sano" avrà da 10⁵ a 10⁶ funghi per grammo di terreno. Può anche essere utilizzato per isolare colture pure di funghi specifici, successivamente valutati per proprietà specifiche, come la capacità di degradare i composti organici. Questi possono essere dannosi come nel caso dei funghi di marciume bianco, o utili quando le sostanze organiche tossiche vengono degradate attraverso la biodegradazione. Altri usi di colture pure di funghi includono l'isolamento di funghi per antibiotici. Ad esempio, il primo antibiotico in assoluto è stata la penicillina, prodotta dal fungo penicilliumtrasmesso dal suolo . Questo fu scoperto per la prima volta da Sir. Alexander Fleming nel 1929.

1. Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2^nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
2. Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).