Colorazione di Gram dei batteri provenienti da fonti ambientali

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Luisa Ikner

Lo spettro della ricerca in microbiologia ambientale è ampio per portata e potenziale applicativo. Sia che il lavoro sia su scala di banco con isolati batterici noti, o sul campo raccogliendo campioni di suolo o acqua contenenti isolati batterici sconosciuti, la capacità di discernere rapidamente e visivamente popolazioni di interesse coltivabili rimane di grande importanza per i microbiologi ambientali ancora oggi con l'abbondanza di tecniche molecolari disponibili per l'uso. Questo video dimostrerà una di queste tecniche, nota come colorazione di Gram.

La colorazione Gram è una tecnica di colorazione classica e importante che rimane ampiamente utilizzata dai microbiologi ambientali. Simile a una semplice macchia, consente di valutare la morfologia delle cellule batteriche(ad esempio,cocchi, bastoncelli, formatori di spore), dimensioni e disposizione(ad esempio,catene o grappoli). Inoltre, consente di differenziare i batteri in due gruppi distinti - Gram-negativi e Gram-positivi - in base alla composizione e alla struttura della parete cellulare (Figura 1).

La colorazione di Gram è un processo in più fasi. Prima della colorazione, uno striscio batterico viene preparato utilizzando una piastra, un'inclinazione o una coltura di brodo. La preparazione dello striscio viene asciugata e fissata su un vetrino pulito. Una macchia primaria di cristallo viola viene quindi applicata allo striscio fisso. Il viola cristallo è una macchia di base composta da ioni colorati caricati positivamente(cioè cromofori) che formano deboli legami ionici con gruppi funzionali caricati negativamente presenti nella parete cellulare batterica. Dopo aver risciacquo delicatamente il vetrino con acqua, viene applicato lo iodio di Gram e forma complessi insolubili con il viola cristallino nella parete cellulare. I complessi cristallo viola-iodio si legano ulteriormente con il peptidoglicano, un componente principale delle pareti cellulari batteriche. Dopo un secondo risciacquo con acqua, un agente decolorante viene brevemente applicato allo striscio. Per i batteri Gram-negativi, il complesso cristallo viola-iodio viene lavato via durante la fase di decolorazione, con i batteri Gram-positivi che mantengono la macchia viola. Un terzo e ultimo risciacquo con acqua è seguito da una controstain di safranina che colora i batteri Gram-negativi rosa o rosso.

Figura 1. Confronto della parete cellulare dei batteri Gram-positivi e Gram-negativi.

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogliere il campione di terreno e trasportare al laboratorio per l'analisi microbica.
2. In laboratorio, pesare un campione di 10 g utilizzando una bilancia analitica.
3. Diluire il campione 1:10 in 95 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (10 parti di terreno equivale a 5 parti di liquido acquoso) e vortice da miscelare(Figura 2,Fase 1).
4. Eseguire successive diluizioni 1:10 fino ad almeno 10^-5 g di terreno per mL e diluizioni selezionate a piastre di diffusione in repliche di due o tre su un mezzo agar a basso contenuto di nutrienti(ad esempio,R2A) (Figura 2, Passaggi 2-3).
5. Incubare le piastre per una settimana a temperatura ambiente (Figura 2, Passo 4).
6. Selezionare una o due colonie per l'isolamento e strisciare su piastre di agar fresche (Figura 3, Passaggi 1-3).
7. Incubare le piastre striata per due o tre giorni a temperatura ambiente (Figura 3, Fase 4).

2. Preparazione di strisci batterici

1. Osservare le piastre striate per le colonie isolate.
2. Per preparare ogni preparazione dello striscio, immergere un ciclo di inoculazione nell'etanolo, sterilizzare a fiamma e posizionare da 1 a 2 cicli di acqua distillata sterile al centro di vetrini pre-puliti.
3. Sterilizzare nuovamente il ciclo di inoculazione come descritto in precedenza. Una volta raffreddato, rimuovere una piccola quantità di coltura da una singola colonia isolata e mescolarla con le goccioline d'acqua sul vetrino (lo striscio dovrebbe assomigliare al latte scremato diluito). Il ciclo di inoculazione deve essere raffreddato prima dell'isolamento della colonia. Un ciclo troppo caldo causerà lo schizzo della colonia e / o del mezzo, che può portare all'aerosolizzazione dei batteri. Generalmente, quando il loop è troppo caldo per l'uso, si sentirà un suono "sissante" quando applicato all'agar o alla colonia. Il raffreddamento improprio del loop può anche comportare un trasferimento da coltura a diapositiva meno efficiente e una distorsione della morfologia cellulare.
4. Stendere lo striscio sulla superficie del vetrino di circa 2,5 cm x 2,5 cm e lasciarlo asciugare all'aria. È importante che l'essiccazione all'aria avvenga in condizioni di flusso laminare. Le diapositive non devono essere asciugate in modo da non interrompere lo striscio. Inoltre, i vetrini non devono essere essiccati a fiamma, al fine di mantenere la morfologia cellulare.
5. Dopo l'asciugatura, il calore fissa lo striscio facendo passare rapidamente la diapositiva attraverso una fiamma 2-3x. Il vetrino non deve essere tenuto fermo nella fiamma, per evitare distorsioni della morfologia cellulare e/o danni al vetrino.

3. Colorazione del grammo

1. Fissare la diapositiva a un'estremità usando una molletta pulita.
2. Coprire lo striscio con viola cristallo (macchia primaria) e tenere premuto per 2 o 3 minuti.
3. Lavare accuratamente lo scivolo con acqua distillata. Il flusso d'acqua non deve essere diretto verso lo striscio per evitare danni e/o distacchi dal vetrino.
4. Coprire lo striscio con lo iodio di Gram e tenere premuto per 2 minuti, quindi risciacquare delicatamente lo scivolo con acqua.
5. Decolorare lo striscio usando il 95% di etanolo fino a quando la macchia non si lava più dal vetrino (questo di solito non richiede più di 20 s a seconda dello spessore dello striscio), quindi risciacquare immediatamente con acqua distillata. Questo passaggio è fondamentale per evitare la decolorazione eccessiva della diapositiva, che può portare a una falsa designazione della macchia di Gram(cioè grammo-variabile).
6. Aggiungere la controstain (safranin) allo striscio e tenere premuto per 30 s. Quindi risciacquare delicatamente il vetrino con acqua distillata e asciugare con carta assorbente.

4. Osservazione microscopica dei vetrini

1. Osservare le diapositive utilizzando obiettivi bassi(ad esempio,4X o 10X), ad alta secchezza(ad esempio,40X) e ad immersione in olio (100X). Per l'immersione in olio, aggiungere l'olio direttamente allo striscio.
2. Per i risultati rappresentativi dei batteri del suolo Gram-positivi e Gram-negativi, vedere le figure 4 e 5.

Figura 2. Tecnica di diluizione e Spalmatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Isolamento della colonia utilizzando la tecnica streak plate.

Figura 4. Batterio del suolo Gram-positivo Staphylococcus aureus.

Figura 5. Batterio del suolo Gram-negativo Escherichia coli.

La macchia di Gram è utilizzata nei numerosi sottocampi della microbiologia sia ambientale che clinica. Gli scienziati della qualità dell'acqua possono utilizzare la macchia di Gram come strumento di conferma per il rilevamento di batteri fecali nei campioni d'acqua. Gli isolati batterici dei suoli sono colorati di Gram per caratterizzare ulteriormente le comunità del suolo coltivabili. Per i microbiologi ambientali, la colorazione gramino aiuta nella categorizzazione delle popolazioni batteriche in base alla struttura della parete cellulare. Questo, a sua volta, fornisce informazioni sulla capacità generale di una determinata comunità microbica di resistere all'essiccazione e ad altri fattori di stress ambientale. La conoscenza della designazione della colorazione Gram è anche importante nella ricerca e nello sviluppo di disinfettanti e altri antimicrobici, poiché i batteri Gram-positivi tendono ad essere più resistenti all'inattivazione da parte di particolari sostanze chimiche rispetto ai batteri Gram-negativi.

Per le applicazioni di microbiologia clinica, la macchia di Gram viene utilizzata per confermare l'identità degli agenti batteriologici insieme ai metodi diagnostici tradizionali. È anche di grande aiuto quando la coltivazione è fallita o non è un'opzione. La colorazione gram di campioni clinici può rivelare la presenza di agenti eziologici che potrebbero non essere stati osservati altrimenti.