Visualizzazione dei microrganismi del suolo tramite il test su vetrino a contatto e microscopia

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz

Il suolo comprende il sottile strato sulla superficie terrestre, contenente fattori biotici e abiotici che contribuiscono alla vita. La porzione abiotica comprende particelle inorganiche di dimensioni e forma variabili che determinano la consistenza del suolo. La porzione biotica incorpora residui vegetali, radici, materia organica e microrganismi. L'abbondanza e la diversità dei microbi del suolo è espansiva, poiché un grammo di terreno contiene 10^{batteri 7-8, 10 6-8} actinomiceti,^{10 funghi 5-6, 10 3} lieviti,^{10 4-6} protozoi,^{10 3-4} alghe e 5³ nematodi. Insieme, i fattori biotici e abiotici formano architetture attorno alle radici delle piante, note come rizosfera, che forniscono condizioni favorevoli per i microrganismi del suolo.

I fattori biotici e abiotici promuovono la vita nei suoli. Tuttavia, contribuiscono anche a dinamiche stressanti che limitano i microbi. Lo stress biotico comporta la competizione tra la vita per adattarsi e sopravvivere in condizioni ambientali. Ad esempio, i microbi possono secernere sostanze inibitorie o tossiche per danneggiare i microrganismi vicini. Penicillium notatum è un fungo famigerato, in quanto riduce la competizione per i nutrienti producendo un antimicrobico, che gli esseri umani raccolgono per creare la penicillina farmaceutica. Gli stress abiotici derivano da proprietà fisiche o chimiche che limitano la sopravvivenza microbica, come luce, umidità, temperatura, pH, sostanze nutritive e consistenza.

Osservare direttamente le interrelazioni tra organismi del suolo, particelle e comportamenti all'interno di ambienti del suolo diversi è difficile, ma il test del vetrino di contatto, noto anche come tecnica del vetrino sepolto, sviluppato da Rossi et al. (1936) fornisce un punto di vista istantaneo nella microbiologia del suolo. Questo metodo è utile per osservare funghi del suolo, actinomiceti e batteri tramite microscopia. Tuttavia, non è destinato a quantificazioni microbiche, in quanto implica solo una piccola porzione di un ambiente eterogeneo più grande.

Questo metodo viene facilmente eseguito seppellendo un vetrino nel terreno per diversi giorni, quindi fissando i microrganismi sul vetrino con acido acetico. I microbi sono colorati con colorante Rose Bengal e osservati al microscopio utilizzando l'immersione in olio sull'obiettivo 100X. Si possono distinguere tre gruppi microbici, poiché i batteri appaiono come piccole forme arrotondate, i filamenti actinomiceti come stringhe sottili e le ife fungine come fili spessi. Nel suolo, quasi tutti i batteri sono più piccoli e più rotondi di quelli in coltura pura a causa dello stress nutrizionale, che provoca restringimento e arrotondamento per un rapporto superficie/volume più favorevole. Le forme scure irregolari non macchiate sono particelle di terreno. Diversi emendamenti nutrizionali possono essere aggiunti al suolo per fornire fonti di carbonio e glucosio che promuovono la crescita e le interazioni microbiche. Questa tecnica consente una facile osservazione della microbiologia del suolo e aiuta a identificare diversi organismi presenti nell'ambiente.

1. Preparazione del microcosmo del scivolo del suolo

1. Raccogliere il terreno del giardino dalla superficie (profondità 0-6 ") e pesare 150 g di terreno in due tazze separate.
   1. Se il terreno ha un'alta densità di materia organica, pesare 100 g.
2. Etichettare una tazza "Trattamento" e l'altra "Controllo".
3. Calcola la quantità di acqua necessaria per alterare il contenuto di umidità.
   1. Il contenuto di umidità è spesso vicino alla capacità del campo.
      
4. Misurare la quantità di acqua distillata con un cilindro graduato.
5. Versare la quantità di acqua distillata in due flaconcini.
6. Etichettare una fiala "Trattamento" e l'altra "Controllo".
7. Modificare l'acqua nel flaconcino "Trattamento" con glucosio sufficiente per una concentrazione finale di glucosio nel suolo dell'1%, in base a una base di peso secco nel terreno "Trattamento".
8. Aggiungere 200 mg di NH₄NO₃ nel flaconcino "Trattamento" e mescolare per sciogliere le modifiche. Il nitrato funge da fonte di azoto di nutrienti per i microbi del suolo.
9. Non modifichi il flaconcino "Controllo".
10. In piccole aliquote di circa 50 mg, mescolare il contenuto del flaconcino "Trattamento" nella tazza "Trattamento". Mescolare con una spatola dopo ogni aggiunta di aliquota.
11. In piccole aliquote, mescolare il contenuto del flaconcino "Control" nella tazza "Control". Mescolare con una spatola dopo ogni aggiunta di aliquota.
12. Etichettare quattro vetrini per microscopio puliti: due vetrini "Trattamento" e due vetrini "Controllo".
13. Inserire i due vetrini "Trattamento" nella coppa del terreno "Trattamento" e inserire i due vetrini "Control" nella tazza del terreno "Control". Lasciare 2 cm di ogni diapositiva sporgente sopra la superficie del terreno e assicurarsi di lasciare uno spazio tra le due diapositive.
14. Coprire le tazze con pellicola trasparente e fissarla con un elastico.
15. Forare l'involucro più volte per consentire l'aria, ma evitare comunque un'eccessiva evaporazione.
16. Registra il peso di entrambe le tazze.
17. Incubare le tazze piene di terreno a temperatura ambiente in un'area designata / incubatore per 7 giorni.

2. Colorazione e microscopia a vetrino

1. Registra il peso di entrambe le tazze.
2. Calcola l'umidità del suolo al momento della rimozione della diapositiva.
3. Rimuovere le due diapositive da ciascuna tazza premendo ciascuna diapositiva in posizione inclinata e ritirandosi in modo che la faccia superiore della diapositiva non venga disturbata.
4. Identificare e contrassegnare il lato della diapositiva da macchiare e osservare.
5. Picchiettare delicatamente le diapositive sul piano di lavoro per rimuovere le particelle di terreno di grandi dimensioni.
6. Usando un asciugamano di carta umido, pulire la faccia inferiore delle diapositive. Asciugare le diapositive a temperatura ambiente.
7. Indossando occhiali protettivi e tenendo ogni vetrino con una pinna, immergere i vetrini in acido acetico al 40% (v / v) per 1-3 minuti sotto un cappa aspirante.
8. Lavare via l'acido in eccesso sotto un leggero getto d'acqua.
9. Usando una bottiglia contagocce, coprire la superficie dei vetrini con Rose Bengal fenolico. Sostenere la diapositiva su un rack di colorazione sopra un contenitore per catturare la macchia in eccesso. Fare attenzione, non lavare con forza che potrebbe rimuovere i microrganismi dalla superficie dei vetrini.
10. Macchiare i vetrini per 5-10 minuti. Non lasciare asciugare il vetrino. Aggiungi più macchie se necessario.
11. Lavare delicatamente le diapositive per rimuovere le macchie in eccesso.
12. Lasciare asciugare le diapositive a temperatura ambiente.
13. Utilizzando l'obiettivo di immersione in olio, osservare il vetrino utilizzando un microscopio (Figura 1).

Figura 1. Un vetrino al microscopio.

I funghi mostrano ife spesse e filamentose (Figura 2). Gli actinomiceti mostrano ife sottili e filamentose. I batteri mostrano piccoli cocchi o forme di bastoncello. Si trovano spesso in ciuffi, particelle di terreno o ife fungine di rivestimento. Le particelle del suolo mostrano forme irregolari e scure (Figura 3).

Figura 2. Immagine della diapositiva a contatto utilizzando l'obiettivo 100X.
Foto per gentile concessione di W.H. Fuller.

Figura 3. Immagine della diapositiva a contatto utilizzando l'obiettivo 100X.
Foto per gentile concessione di W.H. Fuller.

Il test del vetrino a contatto, noto anche come scivolo sepolto, è una tecnica semplice utilizzata per osservare qualitativamente il biota del suolo. Questo test mostra qualitativamente le interazioni spaziali tra ife fungine, filamenti actinomiceti, batteri e particelle del suolo. Gli individui o l'industria possono utilizzare questo test per raccogliere conoscenze sulla salute di un particolare suolo per quanto riguarda l'agricoltura, il giardinaggio, il compostaggio, l'insegnamento e lo studio. Tuttavia, questa tecnica non quantifica il micro biota del suolo, in quanto comprende solo un piccolo ritratto di un ambiente eterogeneo più ampio.

Le relazioni tra gli organismi del suolo possono essere osservate eseguendo il test del vetrino di contatto e visualizzando i risultati attraverso la microscopia ad immersione in olio 100X (Figure 2 e 3). La semplicità e la facilità di eseguire questo test lo rendono un'ottima tecnica di partenza per coloro che non sono mai stati esposti alla microbiologia e potrebbero visualizzare i microrganismi attraverso un microscopio per la prima volta.

1. Pepper, I. L., & Gerba, C P. 'Contact Slide Assay.' Environmental Microbiology A Laboratory Manual. 2nd ed. Elsevier 19-25 (2004).
2. Pepper, I. L., Gerba, C. P., & Gentry, T. J. 'Earth Environments.' Environmental Microbiology. 3rd ed. Elsevier 59-88 (2014).
3. Rossi, G., Ricardo, S., Gesue, G., Stanganelli, M., and Want, T.K. Direct Microscopic and bacteriological investigations of the soil. Soil Science. 41, 52 – 66 (1936).