Method Article
We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.
There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.
Bacterial pathogens are one of the major causes of global morbidity and mortality. Outbreaks from hospital-acquired infections, food-borne pathogens, and bacterial contaminants in the environment pose serious and on-going threats to public health and safety. To prevent these outbreaks, effective tools are needed that permit pathogen detection in a timely fashion under a variety of settings. Simple but still effective tests that are portable and cost-effective are greatly coveted, especially in regions that are susceptible to outbreaks but cannot afford expensive testing facilities.1-3 Although there exists a multitude of methods to detect bacteria, many of them are not suitable as screening or on-site testing tools because they require long test times, expensive instruments and complicated testing procedures.
Colorimetric tests are particularly attractive for point-of-care or field applications as color changes can be easily detected by the naked eye. The litmus test for pH is simple, quick, and effective. Although it is a very old technology, it is still widely used today because of its simplicity and effectiveness. Surprisingly, this simple test had never been modified to achieve the detection of other analytes before we recently developed an approach of modifying this test for E. coli testing.4
The expanded litmus test for E. coli employs three additional components: an E. coli activated RNA-cleaving DNAzyme (EC1), 5 urease, and magnetic beads. DNAzymes refer to synthetic single-stranded DNA molecules with catalytic activity.6 They can be isolated from random-sequence DNA pools using in vitro selection.7,8 They are highly stable and can be produced cost-effectively using high-efficiency automated DNA synthesis.9 For these reasons, DNAzymes, particularly RNA-cleaving DNAzymes, have been widely examined for biosensing applications.6,10,11 RNA-cleaving DNAzyme sensors have been developed to detect metal ions,12-16 small molecules,17,18 bacterial pathogens5,19-21 and cancer cells.22 Given the great availability of target-induced RNA-cleaving DNAzymes, any assay that utilizes a DNAzyme can be potentially expanded to detect a diverse range of analytes.
Urease is chosen for its ability to hydrolyze urea into ammonia,23,24 resulting in a pH increase. Urease is also highly efficient, stable and amenable for conjugation to other biomolecules. Therefore, we postulated that a conjugate of an RNA-cleavage DNAzyme with urease would allow the use of litmus test for the detection of other targets.5
The action of the RNA-cleaving DNAzyme is relayed to urease-mediated increase of pH through the use of magnetic beads that are immobilized with the DNAzyme-urease conjugate. Because the activity of the DNAzyme under investigation is strictly dependent on E. coli, the presence of this bacterium in the test solution will result in the release of urease from the magnetic beads to the solution, which is then taken and used to hydrolyze urea in a reporter solution that contains a pH-sensitive dye. The final outcome of this procedure is a color change that can be conveniently reported by the dye or pH paper.
Reaktifler ve Tamponlar hazırlanması 1.
2. sentezi ve E. saflaştırma coli- duyarlı DNAzim EC1
DNA üreazın 3. Konjugasyon
Manyetik boncuklar üzerine EC1 ve UrDNA 4. Montaj
Bakteriyel hücreler 20 5. hazırlanması
6. Litmus Testi
Bakteriyel test edeceği prensibi Şekil 1 'de açıklanmıştır Test üç temel malzeme kullanır. Belirli bir bakteri, üreaz ve manyetik boncuklar ile aktive olan bir RNA klivaj DNAzim. DNAzim ilgi konusu bir bakterinin yüksek düzeyde spesifik tespit elde etmek için moleküler tanıma elemanı olarak kullanılır. Üreaz ve manyetik boncuk DNAzıme RNA klivaj aktivitesinin sinyal transdüksiyonunu elde etmek için kullanılır. Bu üreaz-DNAzim konjugatlarının ihtiva manyetik boncuk oluşturulmasını içerir. Hedef bakterinin varlığı, DNAzim parçalayarak kendi RNA bağlantı. Bu işlem, manyetik boncuklardan üreaz ayrışmasına neden olur. serbest üreaz kolay manyetik boncuk ayrılır ve üre ve pH'a duyarlı bir boya içeren bir raportör çözeltisi içinde bir renk değişikliği üretmek için de kullanılabilir. Üreaz c tetikleyen pH artışı eşliğinde amonyak içine üre hidrolizBoyanın enk değişimi.
Şekil 2 nerede EC1, E. bakteriyel bir turnusol testi sunuyor E. coli tepki gösteren RNA klivaj DNAzım, DNAzıme olarak kullanılmıştır, ve fenol kırmızısı, pH raporlama boya olarak kullanılmıştır. EC1 daha önce in vitro seçimi tekniği kullanılarak rasgele dizi DNA havuzu grubumuz ile izole edilmiştir. 5 Daha önceki çalışmalar EC1 E için son derece spesifik olduğu gösterilmiştir E. coli ve 5,19. Diğer bakteri karşı çok az aktivite sergiler EC1 E. bir protein molekülü ile aktive edilir olduğu bulunmuştur Bu protein belirteç kimliği deşifre edilmemiş olmakla birlikte coli., yüksek tanıma özgünlüğü bu proteinin E. özgü olduğunu göstermektedir E. coli. bildirici çözeltisi 5.5 bir başlangıç pH değerine sahip ayarlanır. Bu pH'da fenol kırmızı sarı bir renk sergiler. üreaz olarak, amonyak içine muhabiri solüsyonunun bazlık üre hidrolizKatkı artar. Bu san bir pembe rengin kademeli değişikliği ile yansıtılır. Şekil 2'de gösterildiği gibi renk değişikliği derinliği, aşağıdaki iki parametrelere bağlıdır: E. sayısı DNAzim aktivasyon aşaması, üre hidroliz adımı için izin verilen süre kullanılan coli hücreleri. Daha E. coli hücreleri ilerleyici sarı-to-pembe renk geçişi E. gözlem yansıyan güçlü renk değişikliklere neden coli hücreleri seri artan 5 ile 10 x 5-7 (10-kat, her zaman artış). Diğer taraftan, üre hidrolizi için daha uzun bir zaman E. az sayıda tespiti için izin E. coli hücreleri (1 saat tepkimede 5000 hücreleri ve 2 saat tepkimede 500 hücre).
Bakteriyel test edeceği pH değişikliği, aynı zamanda, bir el pH metre kullanılarak izlenebilir ve Örnek sonuçlar Şekil 3'te gösterilmektedir. Was bulduğu 10 7 E. varlığı coli hücreleri 10 dakika içinde 3 adet pH kademeli artış ile sonuçlanmıştır. Bunun aksine, E. yokluğu coli hücreleri aynı ayarı altında saptanabilir pH değişiklikleri neden olmadı.
Şekil 1: Bakteriyel turnusol test tasarım ilkesi, ilgi konusu bir bakteriden, belirli bir belirteç ile bir RNA klivaj DNAzim (A) aktivasyonu.. belirteç mevcudiyetinde, RNA-yaran DNAzim çözeltisine manyetik boncuklardan etiketli üreaz salınmasına yol açar manyetik boncuk yarılır ilgili RNA bağı hareket. (B) üç adımlı deney prosedürü. Adım 1: DNAzim aktivasyonu, panel A, aşama 2'de tarif edildiği gibi: Manyetik Ayırma - serbest üreaz manyetik boncuk ayrılır. Aşama 3: Üre hidroliz R12; serbest üreaz, bir üre ihtiva eden raportör çözeltisi içine ilave edilir. Üreaz bir pH-duyarlı boya ile rapor edilebilir pH değişikliği ile sonuçlanan, amonyak içine üre hidrolize. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: E. ile Turnusol testi E. coli E. kullanarak coli tepki gösteren DNAzim EC1. E. değişen numaraları ile Temsilcisi renk değiştiren sonuçlar Her bir test tüpüne, yukarıda verilen coli hücreleri. Fenol kırmızı pH'a duyarlı bir boya olarak kullanılmıştır. E. olmadan bir test E. coli, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Daha E. coli hücreleri daha fazla üreaz moleküllerinin salgılanmasına neden bekleniyor, b eşliky güçlü rengi değişir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: pH metre kullanılarak pH artışı İzleme 10 7 E. neden pH değişikliği. coli hücreleri taşınabilir pH metre kullanılarak izlenmiştir. E. olmadan bir test E. coli, bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. 10 7 E. varlığı Test çözeltisi içinde coli hücreleri 10 dakika içinde ~ 3 pH birimi tarafından bazlığını artırabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
isim | Sesekans (5'-3 ') | Not |
BS1 | BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG bir | B: 5'-Biotin; R: adenin ribonükleotid; F: floresein-dT; S: DABCYL-dT |
DE1 | GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA | |
T1 | GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC Cı | |
LD1 | XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA bir | X: 5'-NH2 |
Tablo 1: sentetik oligonükleotit dizileri.
Şekil 1 'de gösterildiği gibi bir turnusol test etmek için bir bakteri duyarlı DNAzıme RNA bölünme etkinliğinin etki yaptı, üreaz ve manyetik ayırma kullanımı ile mümkün olmaktadır. Bakteriyel tespiti için modifiye test edeceği gösteri rağmen E ile yapılan E. coli bağımlı RNA-yaran DNAzim, 5,19,20 tasarım genellikle herhangi RNA-yaran DNAzıme için uzatılabilir. Yeni hedefler için rasgele dizi havuzlarından yeni RNA-yarma DNAzımler izole etmek farklı analitler ve çeşitli metodolojileri için RNA-yaran DNAzimler büyük kullanılabilirliği göz önüne alındığında, biz modifiye turnusol testi platformu ilgi çeşitli hedeflerin tespiti uzatılabilir bekliyoruz .
E. için turnusol testi Raporlama reaksiyon süresi sırasıyla 1 ve 2 saat olmak üzere ayarlandığı zaman coli algılama 5,000 ve 500 hücreleri tespit edebilir. Popüler polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vesandviç immün testi enzim-bağlı (ELISA) yöntemleri yaklaşık 10 4 -10 5 E. algılama sınırlarını elde edebilirsiniz Benzer test zamanlarında coli hücreleri. 25,26 Böylece, bakteriyel bir turnusol testi karşılaştırılabilir algılama hassasiyetini sunar.
Bakteriyel turnusol testi yürütmek kolay ve canlı renk değişiklikleri üretebilir rağmen, çeşitli faktörler önemli ölçüde test sonuçlarını etkileyebilir. İlk olarak, üreaz kalitesi çok önemlidir. Farklı kaynaklardan gelen üreaz kullanılan ve test sonuçları önemli ölçüde değişebilir bulduk. Biz Malzemeler bölümünde belirtilen kaynaktan üreaz kullanılması tavsiye edilir.
DNAzim / üreaz / manyetik boncuk montaj özel dikkat gerektirir. melezleşmemiş UrDNA kaldırmak için manyetik boncuk Kapsamlı yıkama yanlış pozitif sonuçların önlenmesi için gereklidir. Bakım ayrıca l iç yüzeyinde kalan manyetik boncuk birikmesini önlemek için alınması gerekengörmek zor olabilir mikrofuge'de tüp, kimliği. Bir kez orada, manyetik boncuk artık manyetik ayırma tabi tutulur ve böylece muhabir reaksiyonunda yalancı pozitif sinyaller yol açabilir bazı melezleşmemiş UrDNA taşıyabiliyor. Manyetik ayırma adımı sırasında daha uzun bir süre, 10 dakika boyunca manyetik rafa mikrofüj tüpü terk bilmek de önemlidir. boncuk toplamak veya yıkama verimliliği azaltır ve partiden partiye tutarsızlığı tanıtmak olabilir mikrofuge'ye tüp, yapışabilir. Yıkama çözeltisi içinde% 0.01 Tween-20 dahil edilmesi partiden partiye tutarlılık artırabilir ve uygulanmalıdır.
Manyetik kurecikler manyetik boncuklar üzerine DNAzim-üreaz konjugatlarının monte çapa olarak kullanılan streptavidin ile kaplanmıştır. streptavidin ve üreaz Hem depolama sırasında denatüre edilebilir protein molekülleridir. Normal olarak 4 haftaya kadar 4 ° C de bir araya DNAzim-üreaz manyetik boncuk depolamakve daha tutarlı sonuçlar elde etmek için düzenli olarak taze toplu yapmak.
Bakım ayrıca DNAzim aktivasyonunu takiben manyetik ayırma adımı (adım 6.9) manyetik boncuk alarak kaza önlemek için alınması gereken. Bizim deneyim, hücresel enkaz ve çözüm diğer partiküller manyetik ayırma verimliliği azaltabilir ve bu nedenle, bazı manyetik boncuk istemeden pipetleme sırasında alınabilir. Bu yanlış pozitif sonuçlara neden olur. uzun bir ayrılık süresi (örneğin 5-10 dk), pipet üzerinde bir basınç yavaş salınım süpernatant nazik çekilmesi izin verir ve manyetik ayırma ek bir tura yüzer tabi: Biz problemi hafifletmek için aşağıdaki önlemleri tavsiye .
Son olarak, çok sayıda numune test edilir bir deney sırasında üreazın tarafından bildirici stok çözeltisi kaza kirlenmesini önlemek için önemlidir. u yüksek reaktif göz önüne alındığındaSerbest Bırakma, bu doğanın kirlenmesi yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir.
The authors have nothing to disclose.
The funding for this research project was provided by the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) via a Discovery Grant to YL.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
Boric acid | AMRESCO | 0588 | |
Urea | VWR AMRESCO | M123 | |
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
Sucrose | Bioshop Canada inc. | SUC507 | |
Bromophenol blue | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
Xylenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
10% sodium dodecyl sulfate | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
Hydrochloric Acid (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
Magnesium Chloride (II) hexahydrate | VWR AMRESCO | 0288 | |
Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
Adenosine Triphospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
10% Ammonium persulfate (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
0.04% Phenol red | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer | Lucigen | 30061-1 | |
10x T4 DNA ligase reaction buffer | Bio Basics Canada | B1122-B | |
T4 DNA ligase (5 U/μl) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
Luria Bertani (LB) Broth | AMRESCO | J106 | |
Agar | AMRESCO | J637 | |
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) | Lucigen | 30061-1 | |
E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
Centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 392187 | |
Glass plates | CBS scientific | ngp-250nr | |
0.75 mm thick spacers | CBS scientific | VGS-0725r | |
12-well comb | CBS scientific | VGC-7512 | |
UV Lamp | UVP | 95-0017-09 | |
Spectrophotometer (NanoVue) | GE Healthcare | N/A | |
Metal plate | CBS scientific | CPA165-250 | |
Vortex | VWR International | 58816-123 | |
Gel electrophoresis apparatus | CBS scientific | ASG-250 | |
Petri dishes | VWR International | 25384-342 | |
100 kDa MWCO centrifugal filters | EMD Millipore | UFC510024 | |
Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
Magnetic Seperation Rack | New England BioLabs | S1506S | |
Microfuge tubes | Sarstedt | 72.69 | |
Syringe filter (0.22 μm) | VWR International | 28145-501 | |
14 ml culture tube | VWR International | 60818-725 | |
Cell culture incubator | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
Branson Ultrasonic cleaner | Branson | N/A | |
Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
50 ml conical tube | VWR International | 89004-364 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır