Method Article
We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.
There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.
Bacterial pathogens are one of the major causes of global morbidity and mortality. Outbreaks from hospital-acquired infections, food-borne pathogens, and bacterial contaminants in the environment pose serious and on-going threats to public health and safety. To prevent these outbreaks, effective tools are needed that permit pathogen detection in a timely fashion under a variety of settings. Simple but still effective tests that are portable and cost-effective are greatly coveted, especially in regions that are susceptible to outbreaks but cannot afford expensive testing facilities.1-3 Although there exists a multitude of methods to detect bacteria, many of them are not suitable as screening or on-site testing tools because they require long test times, expensive instruments and complicated testing procedures.
Colorimetric tests are particularly attractive for point-of-care or field applications as color changes can be easily detected by the naked eye. The litmus test for pH is simple, quick, and effective. Although it is a very old technology, it is still widely used today because of its simplicity and effectiveness. Surprisingly, this simple test had never been modified to achieve the detection of other analytes before we recently developed an approach of modifying this test for E. coli testing.4
The expanded litmus test for E. coli employs three additional components: an E. coli activated RNA-cleaving DNAzyme (EC1), 5 urease, and magnetic beads. DNAzymes refer to synthetic single-stranded DNA molecules with catalytic activity.6 They can be isolated from random-sequence DNA pools using in vitro selection.7,8 They are highly stable and can be produced cost-effectively using high-efficiency automated DNA synthesis.9 For these reasons, DNAzymes, particularly RNA-cleaving DNAzymes, have been widely examined for biosensing applications.6,10,11 RNA-cleaving DNAzyme sensors have been developed to detect metal ions,12-16 small molecules,17,18 bacterial pathogens5,19-21 and cancer cells.22 Given the great availability of target-induced RNA-cleaving DNAzymes, any assay that utilizes a DNAzyme can be potentially expanded to detect a diverse range of analytes.
Urease is chosen for its ability to hydrolyze urea into ammonia,23,24 resulting in a pH increase. Urease is also highly efficient, stable and amenable for conjugation to other biomolecules. Therefore, we postulated that a conjugate of an RNA-cleavage DNAzyme with urease would allow the use of litmus test for the detection of other targets.5
The action of the RNA-cleaving DNAzyme is relayed to urease-mediated increase of pH through the use of magnetic beads that are immobilized with the DNAzyme-urease conjugate. Because the activity of the DNAzyme under investigation is strictly dependent on E. coli, the presence of this bacterium in the test solution will result in the release of urease from the magnetic beads to the solution, which is then taken and used to hydrolyze urea in a reporter solution that contains a pH-sensitive dye. The final outcome of this procedure is a color change that can be conveniently reported by the dye or pH paper.
1. Preparación de los reactivos y búferes
2. Síntesis y purificación de E. colitis sensibles ADNzima EC1
3. Conjugación de ureasa para DNA
4. Montaje de EC1 y UrDNA sobre perlas magnéticas
5. Preparación de células bacterianas 20
6. prueba de fuego
El principio de la prueba de fuego bacteriano se explica en la Figura 1 La prueba utiliza tres materiales principales:. Una ADNzima RNA-cleaving que se activa por una bacteria específica, ureasa y perlas magnéticas. La ADNzima se utiliza como el elemento de reconocimiento molecular para lograr una detección altamente específica de una bacteria de interés. La ureasa y perlas magnéticas se utilizan para conseguir la transducción de señales de la actividad de ARN-escisión de la ADNzima. Esto implica la creación de cuentas magnéticas que contienen conjugados de ureasa-ADNzima. En presencia de la bacteria diana, la ADNzima escinde su vinculación ARN. Esta acción da lugar a la disociación de la ureasa a partir de perlas magnéticas. La ureasa liberado puede ser fácilmente separada de perlas magnéticas y se utiliza para generar un cambio de color en una solución de reportero, que contiene urea y un colorante sensible al pH. La ureasa hidroliza la urea en amoníaco, acompañado por el aumento del pH que activa la ccambio olor del tinte.
La figura 2 presenta una prueba de fuego bacteriano en EC1, una E. coli -responsive RNA-cleaving ADNzima, se utilizó como la ADNzima, y se usó rojo de fenol como el colorante pH de reporte. EC1 fue previamente aislado por nuestro grupo a partir de un conjunto de ADN de secuencia aleatoria usando la técnica de selección in vitro. 5 Nuestros estudios previos han demostrado que EC1 es altamente específico para E. coli y exhibe actividad mínima hacia otras bacterias. 5,19 Se ha encontrado que EC1 es activado por una molécula de proteína de E. coli. Aunque el identidad de este biomarcador de proteína no ha sido descifrado, la alta especificidad de reconocimiento sugiere que esta proteína es única para E. coli. La solución reportero está preparado para tener un pH inicial de 5,5. A este pH, rojo fenol exhibe un color amarillo. Como ureasa hidroliza la urea en amoníaco, la basicidad del sol reporteroution aumenta. Esto se refleja en el cambio gradual del color del amarillo al rosa. La profundidad del cambio de color depende de los dos parámetros siguientes, como se ilustra en la Figura 2: el número de E. coli células utilizadas en la etapa de activación ADNzima y el tiempo permitido para la etapa de hidrólisis de la urea. Más E. células de E. coli dieron como resultado cambios de color más fuertes, que se refleja por la observación de un E.-amarillo a rosa transición de color cuando progresiva células de E. coli se incrementaron en serie 5-5 x 10 7 (10 veces aumentar cada vez). Mientras tanto, un tiempo más largo para la hidrólisis de urea permitido para la detección de un número menor de E. coli células (5000 células en la reacción de 1 hora y 500 células en la reacción de 2 horas).
El cambio de pH de la prueba de fuego bacteriano también se puede controlar utilizando un medidor de pH de mano y resultados representativos se ilustran en la Figura 3. Was encontró que la presencia de 10 7 E. células de E. coli resultó en incremento gradual de pH por 3 unidades dentro de 10 min. En contraste, la ausencia de E. células de E. coli no causó cambios en el pH detectables bajo el mismo entorno.
Figura 1: El principio de diseño de prueba de fuego bacteriano (A) Activación de una ADNzima RNA-cleaving por un biomarcador específico de una bacteria de interés.. En presencia del biomarcador, la ADNzima RNA-cleaving inmovilizados sobre perlas magnéticas escinde la unión de ARN, lo que resulta en la liberación de la ureasa etiquetado de perlas magnéticas a la solución. (B) Procedimiento de ensayo de tres pasos. Paso 1: activación ADNzima, como se describe en el panel A. Paso 2: La separación magnética - la ureasa liberado se separó de las perlas magnéticas. Paso 3: La urea hidrólisis R12; se añade la ureasa se libera en una solución reportero que contiene urea. La ureasa hidroliza la urea en amoníaco, lo que resulta en un cambio en el pH que puede ser informado por un colorante sensible al pH. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Prueba de fuego con E. coli utilizando E. coli -responsive ADNzima EC1. Los resultados que cambian de color representativos con un número variable de E. coli células proporcionadas por encima de cada tubo de ensayo. Rojo fenol fue utilizado como el colorante sensible al pH. Una prueba sin E. coli se utilizó como control negativo. Más E. Se espera que las células de E. coli para producir la liberación de más moléculas de ureasa, acompañado bY más fuertes cambios de color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Supervisión de aumento del pH con un medidor de pH El cambio de pH causado por 10 7 E.. células de E. coli se controló utilizando un medidor de pH portátil. Una prueba sin E. coli se utilizó como control negativo. La presencia de 10 7 E. células de E. coli en la solución de ensayo pueden aumentar la basicidad por unidades de pH ~ 3 en 10 minutos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nombre | Sesecuencia (5'-3 ') | Nota |
BS1 | BTTTT TTTTT TTTAC TCTTC CTAGC FRQGG TTCGA TCAAG Un | B: 5'-biotina; R: ribonucleótidos de adenina; F: fluoresceína-dT; Q: dabcilo-dT |
DE1 | GATGT GCGTT GTCGA GACCT GCGAC CGGAA CACTA CACTG TGTGG GGATG GATTT CTTTA CAGTT GTGTG TTGAA CGCTG TGTCA AAAAA AAAA | |
T1 | GACAA CGCAC ATCTC TTGAT CGAAC C | |
LD1 | XTTTT TTTTT TTTTT TTGAC ACAGC GTTCA Un | X: 5'-NH 2 |
Tabla 1: Secuencias de oligonucleótidos sintéticos.
La traducción de la acción de la actividad RNA escisión de una ADNzima bacteria sensible a una prueba de fuego se hace posible mediante el uso de la ureasa y la separación magnética, como se ilustra en la Figura 1. Aunque la demostración de la prueba de fuego modificado para la detección bacteriana es hecho con una E. coli dependiente de ARN de escisión ADNzima, 5,19,20 el diseño en general se puede ampliarse para cualquier ADNzima ARN de escisión. Dada la gran disponibilidad de DNAzymes RNA-cleaving para diferentes analitos y diversas metodologías para aislar nuevos DNAzymes RNA-cleaving de piscinas de secuencia aleatoria de nuevos objetivos, esperamos que la plataforma de prueba de fuego modificado se puede extender a la detección de diversas dianas de interés .
La prueba de fuego para E. detección coli puede detectar 5.000 y 500 células cuando el tiempo de reacción de notificación se establece para que sea 1 y 2 h, respectivamente. La reacción popular cadena de la polimerasa (PCR) ysándwich unido a enzima ensayo inmunoenzimático (ELISA) métodos pueden alcanzar límites de detección de aproximadamente 10 4 -10 5 E. células de E. coli en tiempos de prueba similares 25,26. Por lo tanto, la prueba de fuego bacteriano ofrece una sensibilidad de detección comparables.
Aunque la prueba de fuego bacteriano es fácil de realizar y puede producir cambios de colores vibrantes, varios factores pueden afectar significativamente los resultados de las pruebas. En primer lugar, la calidad de la ureasa es muy importante. Hemos utilizado la ureasa de diferentes fuentes y ha encontrado los resultados de la prueba pueden variar significativamente. Se recomienda el uso de la ureasa de la fuente especificada en la sección de Materiales.
El conjunto de perlas magnéticas / ureasa / ADNzima necesita una atención especial. lavado a fondo de las perlas magnéticas para eliminar UrDNA sin hibridar es necesaria para evitar resultados falsos positivos. Care también tiene que tener cuidado para evitar la acumulación de perlas magnéticas residuales en la superficie interior de la lIdentificación del tubo de microfuga, que puede ser difícil de ver. Una vez allí, las perlas magnéticas ya no están sometidos a la separación magnética y, por tanto, podrían llevar a algunos UrDNA no hibridada que puede conducir a falsos positivos señales en la reacción indicadora. También es importante para evitar dejar el tubo de microcentrífuga en el estante magnético durante más de 10 min durante la etapa de separación magnética. Las perlas pueden agregar o pegar al tubo de microfuga, que puede reducir la eficacia del lavado e introducir inconsistencia de lote a lote. La inclusión de un 0,01% de Tween-20 en la solución de lavado puede mejorar la consistencia de lote a lote y debe ser implementado.
Las perlas magnéticas se revisten con estreptavidina, que se utilizó como el ancla de montar conjugados ADNzima-ureasa sobre las perlas magnéticas. Tanto estreptavidina y ureasa son moléculas de proteínas que pueden ser desnaturalizadas durante el almacenamiento. Nos suelen almacenar los granos ADNzima-ureasa magnéticos montados a 4 ° C durante un máximo de 4 semanasy hacer lotes frescos regularmente para conseguir resultados más consistentes.
Cuidado también tiene que tener cuidado para evitar accidentalmente tomar perlas magnéticas en la etapa de separación magnética (paso 6.9) tras la activación ADNzima. En nuestra experiencia, los desechos celulares y otras partículas en la solución puede reducir la eficiencia de la separación magnética, y por lo tanto, algunas perlas magnéticas pueden ser sacado involuntariamente durante el pipeteado. Esto dará lugar a resultados falsos positivos. Recomendamos las siguientes medidas para aliviar el problema: un tiempo de separación más larga (por ejemplo, 5 a 10 min), una liberación más lenta de la presión sobre la pipeta para permitir la retirada suave del sobrenadante, y someter el sobrenadante a una ronda adicional de separación magnética .
Por último, es importante evitar la contaminación de la solución de accidente reportero de stock de ureasa durante el curso de un experimento en el que se ponen a prueba múltiples muestras. Dada la alta reactividad de uRease, la contaminación de esta naturaleza puede dar lugar a resultados falsos positivos.
The authors have nothing to disclose.
The funding for this research project was provided by the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) via a Discovery Grant to YL.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | VWR AMRESCO | 0105 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) pellets | BIO BASIC CANADA INC. | SB6789 | |
Tris-base | VWR AMRESCO | 0497 | |
Boric acid | AMRESCO | 0588 | |
Urea | VWR AMRESCO | M123 | |
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BIO BASIC CANADA INC. | A0007 | |
Sucrose | Bioshop Canada inc. | SUC507 | |
Bromophenol blue | Bioshop Canada inc. | BRO777 | |
Xylenecyanol FF | SIGMA-ALDRICH | X-4126 | |
10% sodium dodecyl sulfate | Bioshop Canada inc. | SDS001 | |
Hydrochloric Acid (HCl) | CALEDON LABORATORIES LTD | 6026 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Bioshop Canada inc. | SOD001 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Bioshop Canada inc. | HEP001 | |
Magnesium Chloride (II) hexahydrate | VWR AMRESCO | 0288 | |
Tween 20 | Bioshop Canada inc. | TW508 | |
Adenosine Triphospahte (ATP) | AMRESCO | 0220 | |
Sodium Acetate trihydrate (NaOAc) | SIGMA-ALDRICH | S8625 | |
Ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | |
Tetramethyleneethylenediamine (TEMED) | AMRESCO | 0761 | |
10% Ammonium persulfate (APS) | BIO BASIC CANADA INC. | AB0072 | |
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 22360 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | CALEDON LABORATORIES | 803540 | |
Urease | SIGMA-ALDRICH | U0251 | |
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 70011-069 | |
0.04% Phenol red | SIGMA-ALDRICH | P3532 | |
10x T4 polynucleotide kinase reaction buffer | Lucigen | 30061-1 | |
10x T4 DNA ligase reaction buffer | Bio Basics Canada | B1122-B | |
T4 DNA ligase (5 U/μl) | Thermo Fischer Scientific | B1122 | |
Luria Bertani (LB) Broth | AMRESCO | J106 | |
Agar | AMRESCO | J637 | |
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) | Lucigen | 30061-1 | |
E. coli K12 (MG1655) | ATCC | ATCC700926 | |
Centrifuge | Beckman Coulter, Inc. | 392187 | |
Glass plates | CBS scientific | ngp-250nr | |
0.75 mm thick spacers | CBS scientific | VGS-0725r | |
12-well comb | CBS scientific | VGC-7512 | |
UV Lamp | UVP | 95-0017-09 | |
Spectrophotometer (NanoVue) | GE Healthcare | N/A | |
Metal plate | CBS scientific | CPA165-250 | |
Vortex | VWR International | 58816-123 | |
Gel electrophoresis apparatus | CBS scientific | ASG-250 | |
Petri dishes | VWR International | 25384-342 | |
100 kDa MWCO centrifugal filters | EMD Millipore | UFC510024 | |
Magnetic Bead (BioMag) | Bangs Laboratories Inc | BM568 | |
Magnetic Seperation Rack | New England BioLabs | S1506S | |
Microfuge tubes | Sarstedt | 72.69 | |
Syringe filter (0.22 μm) | VWR International | 28145-501 | |
14 ml culture tube | VWR International | 60818-725 | |
Cell culture incubator | Eppendorf Scientific | M13520000 | |
Branson Ultrasonic cleaner | Branson | N/A | |
Camera (Canon Powershot G11) | Canon | N/A | |
50 ml conical tube | VWR International | 89004-364 |
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