בידול וניתוח התבגרות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים שמקורם בתאי גזע עצביים

אנו מתארים את הייצור של תרבויות מעורבות של אסטרוציטים ותאי מבשר אוליגודנדרוציטים הנגזרים מתאי גזע עצביים עובריים או בוגרים המתבדלים לאוליגודנדרוציטים בוגרים, ומודלים במבחנה של גירויים מזיקים. הצימוד עם טכניקת סינון תוכן גבוהה מבוססת תא בונה מערכת סינון סמים אמינה וחזקה.

המשוכה העיקרית בפיתוח טכניקות סינון תרופות להערכת היעילות של אסטרטגיות טיפוליות במחלות מורכבות היא איזון בין פישוט במבחנה לבין יצירה מחדש של סביבת vivo המורכבת, יחד עם המטרה העיקרית, המשותפת לכל אסטרטגיות הסינון, של השגת נתונים חזקים ואמינים, הצפויים מאוד לתרגום in vivo.

בתחום המחלות demyelinating, רוב אסטרטגיות סינון התרופה מבוססות על קווי תאים מונצחים או תרבויות טהורות של תאים מקדימים oligodendrocyte ראשוני מבודד (OPCs) מבעלי חיים שזה עתה נולדו, המובילים להטיות חזקות בשל היעדר הבדלים הקשורים לגיל וכל מצב או מורכבות פתולוגיים אמיתיים.

כאן אנו מראים את ההתקנה של מערכת במבחנה שמטרתה מודל ההבחנה הפיזיולוגית / התבגרות של תאי גזע עצביים (NSC) נגזר OPCs, מניפולציה בקלות כדי לחקות תנאים פתולוגיים האופייניים demyelinating מחלות. יתר על כן, השיטה כוללת בידוד ממוחות עובריים ומבוגרים, המעניקה מערכת המבדילה באופן דינמי מ- OPCs לאוליגודנדרוציטים בוגרים (OLs) בתרבות משותפת ספונטנית הכוללת גם אסטרוציטים. מודל זה דומה מבחינה פיזיולוגית המיאלינציה בתיווך הורמון בלוטת התריס ותהליך תיקון המיאלין, המאפשר תוספת של מפריעים פתולוגיים אשר מודל מנגנוני המחלה. אנו מראים כיצד לחקות את שני המרכיבים העיקריים של מחלות demyelinating (כלומר, היפוקסיה / איסכמיה ודלקת), לשחזר את השפעתם על מיאלינציה התפתחותית ותיקון מיאלין למבוגרים ולקחת בחשבון את כל רכיבי התא של המערכת לאורך כל הדרך, תוך התמקדות בהבחנה OPCs.

מודל מעורב ספונטני זה, יחד עם טכנולוגיות סינון בעלות תוכן גבוה המבוססות על תאים, מאפשר פיתוח של מערכת סינון תרופות חזקה ואמינה לאסטרטגיות טיפוליות שמטרתן להילחם בתהליכים הפתולוגיים המעורבים בדמיאלינציה ובזירוז מינלין.

במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), מיאלין יוצר תאים (אוליגודנדרוציטים, OLs) ומבשריהם (תאי מבשרי אוליגודנדרוציטים, OPCs) אחראים על מיאלינציה התפתחותית, תהליך המתרחש בתקופות פרי- ופוסט לידה, ועל מחזור ותיקון מיאלין (remyelination) בבגרות¹. תאים אלה הם מיוחדים מאוד, אינטראקציה אנטומית ותפקודית עם כל שאר הרכיבים גליה נוירונים, מה שהופך אותם לחלק בסיסי של מבנה ותפקוד CNS.

Demyelinating אירועים מעורבים פציעות מערכת חולים שונות ומחלות², ופועלים בעיקר על OPCs ו OLs באמצעות מנגנונים רב-גורמיים, הן במהלך הפיתוח והן בבגרות. המבשרים הלא מובחנים מונעים על ידי גורמים מבדילים, בעיקר הורמון בלוטת התריס (TH), בתהליך מסונכרן³ שמוביל את OPC לזהות ולהגיב לגירויים ספציפיים הגורמים להתפשטות, הגירה לאקסון הלא מיאלין, ובידול ל- OLs בוגר אשר בתורו לפתח את נדן המיאלין⁴. כל התהליכים הללו נשלטים בקפידה ומתרחשים בסביבה מורכבת.

בשל האופי המורכב של מיאלינציה, רמיאלינציה ואירועי demyelination, יש צורך גדול בשיטת במבחנה פשוטה ואמינה ללמוד את המנגנונים הבסיסיים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, תוך התמקדות בנגן הסלולר העיקרי: OPC⁵.

כדי שמערכת הפריה תהיה אמינה, יש לקחת בחשבון מספר גורמים: המורכבות של הסביבה התאית, הבדלים מהותיים הקשורים לגיל, בידול פיזיולוגי בתיווך TH, מנגנונים פתולוגיים, ואת החוסן של הנתונים⁶. ואכן, הצורך הבלתי ממומש בתחום הוא מודל המחקה את המורכבות של מצב in vivo, שלא הושג בהצלחה באמצעות תרבויות OPC טהורות מבודדות. בנוסף, שני המרכיבים העיקריים של demyelinating אירועים, דלקת היפוקסיה / איסכמיה (HI), ישירות לערב רכיבי תאים אחרים שעשויים להשפיע בעקיפין על ההבחנה הפיזיולוגית וההתבגרות של OPCs, היבט אשר לא ניתן ללמוד במודלים במבחנה פשוטה מדי.

החל ממערכת תרבות חזויה ביותר, האתגר הבא והכלל יותר הוא ייצור נתונים חזקים ואמינים. בהקשר זה, סינון תוכן גבוה מבוסס תא (HCS) היא הטכניקה המתאימה ביותר⁷, שכן המטרה שלנו היא ראשית לנתח את התרבות כולה בזרימת עבודה אוטומטית, הימנעות ההטיה של בחירת שדות מייצגים, ושנית להשיג את הדור האוטומטי ובו זמנית של נתונים מבוססי תוכן גבוה מבוסס הדמיה⁸.

בהתחשב בכך שהצורך העיקרי הוא להשיג את האיזון הטוב ביותר בין פישוט במבחנה לבין מורכבות חיקוי ויוו, כאן אנו מציגים שיטה הניתנת לשחזור גבוהה להשגת OPCs הנגזרים מתאי גזע עצביים (NSCs) המבודדים מהבם החזה העוברי והאזור התת חדרי למבוגרים (SVZ). מודל מבחנה זה מקיף את כל תהליך הבידול של OPC, מ- NSC רב-תכליתי ועד OL בוגר / מיאלינציאלי, באופן פיזיולוגי התלוי ב- TH. התרבות המתקבלת היא מערכת מבדילה/התבגרות דינמית, אשר גורמת לתרבות משותפת ספונטנית המורכבת בעיקר מ- OPCs ואסטרוציטים מבדילים, עם אחוז נמוך של נוירונים. תרבות ראשונית זו מחקה טוב יותר את הסביבה המורכבת של vivo, בעוד נגזרת תאי הגזע שלה מאפשרת לבצע מניפולציות פשוטות כדי להשיג את העשרת שושלת התא הרצויה.

בניגוד לאסטרטגיות אחרות של סינון תרופות באמצעות קווי תאים או תרביות טהורות של OPCs ראשוניים, השיטה המתוארת כאן מאפשרת לחקור את ההשפעה של מפריעים פתולוגיים או מולקולות טיפוליות בסביבה מורכבת, מבלי לאבד את ההתמקדות בסוג התא הרצוי. זרימת העבודה של HCS המתוארת מאפשרת ניתוח של כדאיות התא ומפרט שושלת היוחן, כמו גם מוות תאים ספציפיים לשושלת היוחוס ופרמטרים מורפולוגיים.

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים המתוארים בזאת בוצעו על פי הנחיות מועצת הקהילה האירופית (86/609/EEC) ועומדים בהנחיות שפורסמו במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. פתרונות ות reagents

1. הכן בינוני סטנדרטי: DMEM / F12 גלוטמקס 1x; 8 mmol / L HEPES; 100 U/100 מיקרוגרם פניצילין/סטרפטומיצין (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
2. הכן בינוני נוירוספירה: להוסיף 10 ננוגרם / מ"ל bFGF; 10 ng / mL EGF למדיום סטנדרטי.
3. הכן אוליגוספירה / OPC בינוני: להוסיף 10 ng / mL bFGF; 10 ננוגרם ל'/מ"ל PDGF-AA לבינוני סטנדרטי.
4. הכן בינוני בידול אוליגודנדרוציטים: להוסיף 50 nM T3; 10 ננוגרם לונג/מ"ל CNTF; 1x N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) למדיום סטנדרטי.
5. הכן מאגר דיסוציאציה לא אנזימטי: הוסף 1% P/S למאגר דיסוציאציה לא אנזימטי ולשמור על קר כקרח.
6. הכן פתרון סוכרוז: HBSS, סוכרוז 0.3 גרם /mL.
7. הכן פתרון כביסה BSA: EBSS, 40 מ"ג / מ"ל BSA, 0.02 מ"ל / L HEPES.
8. הכן חיץ דיסוציאציה אנזימטי: HBSS, 5.4 מ"ג / מ"ל D-גלוקוז, 15 mmol / L HEPES, 1.33 מ"ג / מ"ל טריפסין, 0.7 מ"ג / מ"ל היאלורונידדאז, 80 U / mL DNase.
9. הכן תערובת ציטוקינים: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 ו- IFN-γ (20 ננוגרם / מ"ל כל אחד).
10. הכן רכב מיקס ציטוקינים: 0.04% מהמניות (10% גליסול/100 ננומטר גליצין/25 ננומטר טריס, pH 7.3).
11. הכן בינוני מניעת חמצן גלוקוז: בינוני סטנדרטי באמצעות DMEM w/o גלוקוז. בהתאם למתחמרות של מצב מניעת הגלוקוז הרצוי, ניתן להסיר גם B27 ו/או N2 מהמדיום כדי למנוע תרכובות הקשורות לגלוקוז (למשל, D-גלקטוס ב- B27).

2. ביתיתש ובידוד המל"ל

הערה: NSCs עוברי ומבוגרים היו מבודדים מ E13.5 מוח תחתון עוברי או 2.5 חודשים מבוגר אזור חדר (SVZ), בעקבות פרוטוקול אהלניוס וקוקאיה⁹ עם שינויים.

1. תרבויות המל"ל העוברי
   הערה: לפני תחילת הניתוחים, להכין צינורות 1.5 מ"ל המכילים 150 μL של חוצץ דיסוציאציה לא אנזימטית כל אחד; לנקות את מנות פטרי ולהוסיף HBSS קר כקרח.
   1. לאסוף את העוברים ב E13.5 - 14.5 מעכברים בהריון מתוזמן ומניחים בצלחת פטרי המכילה HBSS קר.
   2. לערוף את ראש העוברים באמצעות מלקחיים.
   3. מניחים את ראשי העוברים בצלחת פטרי נקייה המכילה PBS קר כקרח ומסירים את העור מהגולגולת עם מלקחיים, באמצעות משקפיים מגדילים או סטריאוסקופ.
   4. ברגע שהמוח נראה ומנוקה מהעור, סוחט אותו על ידי הפעלת לחץ בצדדים עם מלקחיים.
   5. הסר את המוח הקטן, לשמור רק את המוח המקודם ולהסיר את קרום המוח עם מלקחיים.
   6. מניחים את הרקמה המבודדת במאגר הניתוק הלא אנזימטי וחוזרים על שלבי הניתוח עם העוברים האחרים. הכנס את הרקמה מ 2-3 בעלי חיים לתוך כל צינור המכיל את המאגר.
   7. דגירה ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות תחת רעד מתמשך.
   8. לאחר הדגירה, מוסיפים 850 μL של מדיום סטנדרטי ומערבבים על ידי צנרת עד שהמתלים נקיים מגושים.
   9. אם רקמה לא מנותקת עדיין גלויה, המתן 2 דקות ב- RT עד שהוא מפקיד בתחתית הצינור.
   10. כאשר הניתוק הושלם, לספור את התאים צלחת אותם בהשעיה בצפיפות של 10-50 תאים / μL בבקבוק T-25 או T-45 המכיל 10-30 מ"ל של מדיום נוירוספירה, נשמר במצב אנכי כדי למנוע הידבקות תאים.
2. תרבויות המל"ל למבוגרים
   1. להקריב בעלי חיים על ידי נקע צוואר הרחם.
   2. לאסוף מוחות מ 4-5 עכברים בצינור 50 מ"ל המכיל HBSS קר כקרח.
   3. מניחים את המוח על משטח סטרילי קר. למטרה זו, להשתמש בקבוק T-25 מלא במים להציב ב -20 °C (50 °F) לילה. בזמן הניסוי, לכסות את הבקבוק עם רדיד אלומיניום סטרילי.
   4. הנח את צד הגחון של המוח כלפי מטה, בכיוון רוסטרו-caudal, ולהסיר את נורות הריח באמצעות סכין גילוח.
   5. בעזרת סכין גילוח, חותכים 2-3 פרוסות קורונל בעובי 1 מ"מ, מקליפת המוח ועד הצ'יזמה האופטית.
   6. מניחים את הפרוסות על המשטח הקר בתנוחת חדר-דור ומזהים את הקורפוס קאלוסום ואת שני החדרים לרוחב.
   7. באמצעות משקפיים מגדלים או סטריאוסקופ, לבודד את הקירות של החדרים לרוחב, דואג לא לשאת חתיכות של קלוסום קורפוס.
   8. שים את הרקמה המבודדת במאגר דיסוציאציה אנזימטי (5-10 מ"ל) ודגרה ב 37 °C (15 דקות).
   9. מערבבים את הפתרון, צנרת מספר פעמים (לפחות 50), ודגר שוב ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
   10. לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של בינוני תרבות סטנדרטית ולסנן את הפתרון באמצעות מסנן 70 מיקרומטר.
   11. צנטריפוגה הפתרון המסונן במשך 5 דקות ב 400 x g.
   12. resuspend הכדור בתמיסת סוכרוז וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 500 x g.
   13. יש להזרים את הכדור בתמיסת הכביסה של BSA ואת הצנטריפוגה למשך 7 דקות ב-400 x גרם.
   14. תתקן מחדש את הכדור במדיום התרבות הסטנדרטי, ספר את התאים ובצע ציפוי כמתואר לעיל (בשלב 2.1.10).

3. נוירוספרות ראשוניות

1. הוסף את גורמי הצמיחה (bFGF/EGF) כל יומיים.
2. כל 4-6 ימים (בהתאם לצפיפות התא), לשנות חצי המדיום כדלקמן:
   1. העבר את כל השעיית התא לצינור 15 או 50 מ"ל.
   2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם.
   3. הסר מחצית מנפח האחסון.
   4. הוסיפו את אותה כמות של מדיום טרי, מערבבים בעדינות על ידי צנרת ומוסיפים גורמי גדילה.

4. אוליגוספירות

הערה: בידול Oligodendrocyte מבוצע בעקבות פרוטוקול^{Chen 10} עם שינויים.

1. כאשר הנוירוספרות מגיעות לקוטר של 100-150 מיקרומטר, הן מוכנות לעבור. כדי לעשות זאת, להעביר את כל השעיית התא לצינור 15 או 50 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x גרם.
   1. להעריך במהירות את הקוטר על ידי צילום תמונות של הכדורים באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר הפוך ופתיחתם על ידי תוכנת ImageJ.
   2. לחץ על תפריט ניתוח ומהחלון כלים, בחר סרגל קנה מידה.
   3. הגדר 150 מיקרומטר כרוחב במיקרונים והשווה את סרגל קנה המידה עם הכדורים.
2. הסר את כל הנפח על ידי היפוך ו resuspend הכדור ב 180 μL של מדיום תרבות סטנדרטית טרייה. פיפטה 50 פעמים כדי לאפשר פירוק של הספירות.
3. הוסף 810 μL של מדיום תרבית סטנדרטי טרי, לספור את התאים, ולצלחת אותם מחדש כמתואר עבור נוירוספירות.
4. הוסף bFGF/PDGF-AA 10 ננוגרם/מ"ל כל יומיים.
5. כל 4-6 ימים (בהתאם לצפיפות התא), לשנות חצי המדיום כדלקמן:
6. העבר את כל השעיית התא לצינור 15 או 50 מ"ל.
7. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם.
8. הסר מחצית מנפח האחסון.
9. הוסיפו את אותה כמות של מדיום טרי, מערבבים בעדינות על ידי צנרת ומוסיפים גורמי גדילה.

5. ציפוי צלחת

1. ציפוי פולי-די, L-אורניתין/למינין: לפחות יומיים לפני ציפוי OPCs, להוסיף 50 מיקרוגרם / מ"ל פולי-D, פתרון L-ornithine, מדולל PBS, לכל באר (40 μL / well עבור 96-טוב צלחות) ודגרה ב RT לילה.
2. למחרת, להסיר את הנוזל לשטוף שלוש פעמים עם מים סטריליים מזוקקים.
3. תן לצלחות להתייבש ב-RT למשך הלילה. למחרת, להוסיף פתרון למינין מדולל PBS (5 מיקרוגרם / מ"ל; 40 μL / well עבור 96-טוב צלחות) ודגרה עבור 2 שעות ב 37 °C (37 °F).

6. זריעת תאים

1. כאשר האוליגוספירות מגיעות לקוטר של 100-150 מיקרומטר, הן מוכנות לניתוק ולזריעה על הלוחות מצופים פולי-די, L-אורניתין/למינין. כדי לעשות זאת, להעביר את ההשעיה התא כולו לצינור 15 או 50 מ"ל, וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 400 x g (כפי שצוין בשלב 4.1)
2. הסר את כל הנפח על ידי היפוך ו resuspend הכדור ב 180 μL של מדיום תרבות סטנדרטית טרייה. פיפטה 50 פעמים כדי לאפשר פירוק של הספירות.
3. הוסף 810 μL של מדיום תרבות סטנדרטי טרי וספור את התאים.
4. הסר את פתרון למינין מן בארות צלחת התאים ב 3,000 תא / ס"מ^{2 צפיפות} (100 μL / באר עבור לוחות 96-באר).

7. אינדוקציה של בידול OPC

1. לאחר 3 ימים, להסיר את המדיום כולו ולהוסיף את אותו נפח של מדיום בידול אוליגודנדרוציטים.
2. החליפו חצי מהמדיום כל 4 ימים והוסיפו תערובת בידול טרייה (T3/CNTF/NAC) כל יומיים.

8. אינדוקציה של בלוק בידול בתיווך דלקת

1. לאחר דיסוציאציה נוירוספירה וייצור אוליגוספירה (סעיף 4), להוסיף את תערובת ציטוקינים למדיום התרבות ולשמור על אוליגוספירה חשופה ציטוקינים עבור כל שלב היווצרות כדורים.
   הערה: אמצעי האחסון תלוי במספר התאים, שכן עבור הכדורים היוצרים תאים זרעים ב 10-50 תאים / μL.
2. אם צריך לשנות את המדיום, לשנות את כל הנפח ולהוסיף את תערובת ציטוקינים שוב.

9. אינדוקציה של מוות תאי מניעת חמצן-גלוקוז

1. ב-1 DIV (יומיים לאחר זריעת התא בצלחות רב-וול), מוציאים את המדיום ומשסכים אותו בצלחת רב-וולית חדשה.
2. הוסף מחצית מנפח האחסון (50 μL עבור לוחות 96-well) של OGD-בינוני (קבוצת OGD) או בינוני טרי (קבוצת ביקורת). חצי כמות הנפח משמשת להפחתת חילופי החמצן בין הנוזל לאוויר.
3. מקם את התרבויות הקבוצתיות של OGD בתא היפוקסיה אטום רווי ב-95% N₂ ו-5% CO₂. כדי להשיג רוויה של התא, לתת את תערובת הגז לזרום במשך 6 דקות ב 25 l /min לפני סגירת צינורות התא.
4. לדגור על התא ההיפוקסי באינקובטור במשך 3 שעות. יש להשאיר את קבוצת הביקורת ולוחות המכילים את המדיום שהוסרו ושמורים בשלב 9.1 באינקובטור.
5. הסר את הגלוקוז ללא גלוקוז (קבוצת OGD) או את המדיום החדש (קבוצת הביקורת) והוסף את המדיום שהוסר ושמובטח בשלב 9.1.

10. אימונוציטוכימיה

1. בנקודת הזמן הרצויה, לתקן את התאים עם קר 4% paraformaldehyde במשך 20 דקות ב RT.
2. לשטוף פעמיים עם PBS (10 דקות של דגירה עבור כל לשטוף ב RT).
3. דגירה 1 שעות ב RT עם פתרון חסימה (PBS Triton 0.3% המכיל 1% BSA ו 1% חמור / עז סרום רגיל).
4. דגירה עם תערובת נוגדנים ראשונית(טבלה 1),מדוללת בטריטון PBS 0.3%, לילה ב 4 °C (70 °F).
5. לשטוף פעמיים עם PBS (10 דקות של דגירה עבור כל לשטוף ב RT).
6. דגירה עם נוגדן משני(טבלה 1)פתרון מדולל ב- PBS טריטון 0.3% הוספת Hoechst 33258 במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
7. לשטוף פעמיים עם PBS (10 דקות של דגירה עבור כל לשטוף ב RT).

11. ניתוח HCS של כדאיות התא, הרכב שושלת היוחן ומוות תאים ספציפי לשושלת היוחוס

הערה: התמונות וזרימת העבודה המייצגות של HCS מוצגות באיור 2A,B.

1. בחר את אלגוריתם ניתוח ממודר מהתפריט הראשי של התוכנה (HCS Studio v 6.6.0) ובחר סריקה מהתפריט הראשי פיתוח צלחת אסאי /סריקה.
2. בחלון iDev, בחרו 'חדש' ולאחר מכן בחרו 'כלי מדידה בעוצמה כללית' מהתבנית 'פיתוח עוצמה'.
3. לחץ על צור בצד השמאלי של התפריט, בחירת המטרה 10x.
4. פעולה זו תפתח את תפריט קביעת תצורה של רכישה. בחלון זה, בחר את הפרמטרים הבאים: (א) מספר ערוצים: הראשון עבור הכתמת גרעין Hoechst (BGRFR_386) ואחד עבור כל סמן ספציפי לשושלת המשמש בתגובה (ב) לבחור תוכנה להתמקד בערוץ 1 ומרווח מיקוד אוטומטי כמו 1 (ג) לבחור את דגם הלוח מהרשימה.
5. מתפריט הרכישה, הסתכלו על איכות הכתמים בבארות שונות ובתחומים שונים ובחרו ידנית את זמן החשיפה על ידי בחירת זמן חשיפה קבוע בתפריט.
6. לאחר הגדרת הפרמטרים של הרכישות, בחר מיני סריקה בחלק העליון של התפריט ובחר עשרה שדות לבאר בשתי בארות לכל מצב ניסיוני. פעולה זו תאפשר את ההגדרה של כל פרמטר הניתוח בקבוצה משנה של שדות עבור הלוח כולו.
7. כאשר הסריקה המצומצמת מסתיימת, לחץ על הפרמטר קביעת תצורה של Assay כדי להגדיר את האלגוריתם של הניתוח.
8. לחץ על קביעת תצורה של קבוצות בצד השמאלי של החלון וגרור ושחרר את בארות המיני-סריקה. לחץ על לחצן הוסף במקטע המשנה קבוצות כדי לקבוע את תצורת הקבוצות השונות.
9. בצע את זרימת העבודה בצד שמאל של החלון צעד אחר צעד כדי לפתח את האלגוריתם כולו. בחר תחילה תמונת תהליך עבור כל ערוץ ולחץ על הסרת רקע וברמה הרצויה.
10. ראשית לזהות ולבחור את הגרעינים על ידי כתמים גרעיניים. לחץ על זיהוי אובייקט ראשי – ערוץ 1 כדי לבחור את הגרעינים האמיתיים ולהימנע מניתוח חפץ ופסולת. לשם כך, התקרבו לתמונה מייצגת של כתמים גרעיניים ובדקו אם הגרעינים מוקפים היטב בהיקף שנבנה על ידי התוכנה. ניתן לשנות את ערך הסף ולהחיל אלגוריתמי פילוח כדי לזהות טוב יותר גרעינים בודדים.
11. לאחר שהגרעין מוגדר כראוי, לחץ על השלב הבא: אמת אובייקט ראשי. בחר Object.BorderObject.Ch1 כדי להימנע מניתוח גרעינים בגבול כל תמונת שדה. בחר Object.Area.Ch1, ועל-ידי הזזת הפסים "נמוך" ו"גבוה" בהיסטוגרמה, הסר את כל הפסולת המזוהה או האובייקטים הגדולים המתאימים לצבירה או לממצאים.
12. בדוק את כל התמונות המייצגות מיני סריקה של כל תנאי הניסוי כדי להיות בטוח כי הפרמטרים שנבחרו להתאים עם כולם.
13. לחץ על זיהוי כתמים עבור כל ערוץ המתאים לסמני השושלת הספציפיים, ובחר בערכי הטבעת: רוחב = 3 ומרחק = 0. זה יאפשר זיהוי של פלואורסצנטיות ציטופלסמטית. על פי צפיפות התא, ערכים אלה יכולים להיות מותאמים. התוכנה תימנע באופן אוטומטי מההתופפות בין הטבעות הסמוכות.
14. בחר רמות הפניה בזרימת העבודה כדי לבנות את הניתוח. ההגדרה של רמות הייחוס תאפשר ספירה אוטומטית של גרעינים מרוכזים, בהתבסס על גודל הגרעין ועוצמת הכתמים הגרעיניים, ושל תאים חיוביים לסמן ספציפיים, המבוססים על הפלואורסצנטיות הציטופלסמטית שזוהתה על ידי הטבעת.
15. לחץ תחילה על Object.Area.Ch1. בתמונות הסריקה הקטנות, בחר גרעין מרוכז והזז את סרגל ה-"LOW" על ההיסטוגרמה כדי לבחור כ"מרוכז" בכל הגרעינים תחת גודל זה.
16. לחץ על Object.AvgIntensity.Ch1. בתמונות הסריקה הקטנות, בחר גרעין מרוכז והזז את סרגל ה"HIGH" על ההיסטוגרמות כדי לבחור כ"מרוכז "בכל הגרעינים מעל עוצמת הפלואורסצנטיות הזו.
17. לחץ על Object.RingAvgIntensity עבור כל ערוץ של סמנים ספציפיים שושלת. בחר בתמונות הסריקה הקטנות שלך תא חיובי והזז את סרגל "HIGH" על ההיסטוגרמות כדי לבחור כ"חיובי "את כל התאים מעל עוצמת פלואורסצנטיות זו.
18. בדוק את כל התמונות המייצגות מיני סריקה של כל תנאי הניסוי כדי להיות בטוח כי הפרמטרים שנבחרו להתאים עם כולם.
19. בתפריט העליון, בחר אפיון אוכלוסין ובחר אכלוס אירועים.
20. כאירוע מסוג 1, בחר ObjectAreaCh1 ברשימה הימנית ולאחר מכן לחץ על לחצן > וסוף סוף בחר ObjectAvgIntensityCh1. זה יאפשר זיהוי של גרעינים מרוכזים, כשילוב של שטח נמוך ועוצמה גבוהה.
21. באותו חלון, בטלו את הבחירה בכל מגבלות הסריקה.
22. לחץ על בחר תכונות לאחסון בתפריט העליון, כדי לבחור את הפרמטרים שיש לשמור בניתוח.
23. בחר תכונות Well ועבור מהרשימה השמאלית לימין רק את הפרמטרים הרצויים: (א) SelectedObjectCountPErValidField (ב) %EventType1ObjectCount (ג) %High_RingAvgIntensity (עבור כל ערוץ של סמני השושלת הספציפיים).
    הערה: ניתוח זה ייתן לקריאה את המספר הכולל של תאים, את אחוז הגרעינים המרוכזים ואת אחוז התאים החיוביים הספציפיים לשושלת היוחז עבור כל סמן מנותח במספר התא הכולל. אם אחוז השושלת השונות נחוץ רק בתאים חיים, האם ניתן לשמור על הערך "High_RingAvgIntensity" עבור הערוץ (מספר מוחלט של תאים חיוביים) ולחשב מחדש את האחוז על סך מספרי התאים לאחר חיסור אחוז התאים המתים.
    1. לחלופין, ניתן להסיר את התאים המתים מהניתוח הגדרת אותם פרמטרים המשמשים לזיהוי גרעינים מרוכזים (שלבים 11.14– 11.15) באימות הגרעינים (שלב 11.11).
24. בחר צלחת סריקה מהתפריט העליון הראשי ולחץ על סמל הצלחת בתפריט המשנה הגדרת סריקה בחלק העליון כדי לזהות את הבאר שיש לנתח.
25. כתוב את שם הניסוי ואת התיאור ולאחר השלמת כל ההגדרות, הקש על סמל ההפעלה.

השלב הראשון של התרבות עשוי להשתנות משך הזמן, בהתאם לצפיפות הזריעה והאם הספירות הן ממוצא עוברי או מבוגר. יתר על כן, אוליגוספירות מציגות הכפלה מופחתת של האוכלוסייה בהשוואה לנוירוספירות(איור 1B). יתר על כן, ייצור כדורים מרקמות מבוגרות הוא איטי יותר וזה עלול לקחת 2-3 שבועות כדי ליצור אוליגוספירות לעומת העובר שעשוי לקחת 1-2 שבועות, בהתאם לצפיפות הזריעה.

לאחר הזרע, ניתן לעקוב אחר כל שלב הבידול של התרבויות באמצעות נוגדנים ספציפיים לשושלת היוחז. מאז המטרה של פרוטוקול זה היא ללמוד את השלב הסופי של הבידול, הרכב התרבות ב 0 DIVs אינו מוצג. עם זאת, במהלך שלב התרבות הראשון, התאים יהיו עדיין קינון חיובי, המייצגים מבשרי עצבים, ורוב התאים הם גם NG2-חיובי (OPCs)¹¹. תאים חיוביים ל- CNPase, המתאימים לשלב preOL, יהיו ניתנים לזיהוי 3-6 ימים לאחר אינדוקציה של בידול בתיווך T3, בעוד שתאים חיוביים ל- MBP יופיעו בין 6 ל - 12 DIVs (OLs בוגרים; ראה איור 2C עבור הרכב התרבויות בסוף שלב הבידול).

ניתוח HCS מאפשר זיהוי של כל תא בודד בתרבות באמצעות הכתמים הגרעיניים וניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות בערוצים הנותרים(איור 2A,B). הרכב התרבות בסוף שלב הבידול (12 DIVs) משתנה בהתאם לשאלה אם התרבויות הן ממוצא עוברי או מבוגר, עם תרבויות עובריות מגיבות יותר לבידול בתיווך T3 ומגיעות לאחוז גבוה יותר של OLs בוגר¹².

לאורך כל תהליך התרבות, כ-40%-50% מהתאים הם אסטרוציטים (תאים חיוביים ל-GFAP), בעוד שאחוז קטן (פחות מ-0%-10%) הם תאי עצב (תאים חיוביים לבטא-III-טובולין; איור 2C). הרכב התרבות עשוי להשתנות של 10% בין הכנות תרבותיות שונות. תרביות למבוגרים ולעובר שונות זו מזו לתשואה של ייצור OLs בוגר בסוף שלב הבידול, עם תאים עובריים המציגים אחוז גבוה של OLs בוגרים, אחוז נמוך של מבשרים סביב 30%-40% של אסטרוציטים. מצד שני, תרבויות למבוגרים מציגות יותר אסטרוציטים (סביב 45%-55%) ותאים פחות מובחנים לאחר 12 DIVs של אינדוקציה בידול.

כדי לאפשר לתוכנה לזהות את התאים ולספק ניתוח לא משוחד נכון של הרכב התרבות, חשוב שצפיפות הזריעה נכונה, תוך הימנעות מחפיפה בין תאים סמוכים. כאשר OPCs נגזרים NSC הם זרע בצפיפות גבוהה, הם נוטים לצבור מהר מאוד, המוביל את כל פני השטח של הבאר להיות תפוס על ידי אסטרוציטים לאחר כמה ימים. יתר על כן, OLs בוגר עם צורת עכביש-רשת אופיינית שלהם לא יהיה גלוי בשל השטח המוגבל(איור 3A,B).

בלוק ההבחנה בתיווך דלקת ניתן לשחזור על ידי מבחנה זו וייצור ירידה חזקה preOLs ו OLs בוגר זוהה על ידי CNPase ו MBP כתמים הן בתרביות עובריות והן בתרבויות מבוגרות. עלייה במספר OPCs מתרחשת גם בתרבויות למבוגרים(איור 4A,B). הרכב תערובת ציטוקינים נבחר מניסויי in vivo במודל חולדה של טרשת נפוצה¹³, ונבדק כמודל במבחנה עבור בלוק בידול בתיווך דלקת המתרחש במחלה זו.

בעוד OPCs עוברי ומבוגרים מראים את אותה פגיעות לחשיפה ציטוקינית דלקתית, רק תרביות שמקורן בעובר רגישות לרעילות OGD (איור 5A,B),המציגות עלייה במוות התאים ובפגיעה בבידול בשל הפרופיל המטבולי השונה שלהם¹⁴.

איור 1: אוליגודנדרוציטים מקדים של תאי גזע עצביים, מערך תרבות תאים ופרוטוקול בידול. (א)ערכת ההליך הניסיוני. (B)תמונות מייצגות של נוירוספירות ב- 2, 5 ו - 7 DIVs, וגרף המציג את הכפלת האוכלוסייה של נוירוספירות ואוליגוספירות. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C) תמונות מייצגות של OPCs שמקורם באוליגוספירה המציגות את שלבי הבידול השונים, החל מתאים קנין ו- NG2 חיוביים ב- 0 DIV (מבשר עצבי / OPCs), דרך תאים חיוביים CNPase ב - 6 DIVs (preOLs) ו- CNPase / MBP תאים חיוביים כפולים בסוף שלב הבידול (12 DIVs; OLs בוגרים). תאים חיוביים GFAP (אסטרוציטים) ואחוז קטן של תאים חיוביים בטא-III-טובולין (נוירונים) נמצאים לאורך כל התרבות. סרגלי קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימות עבודה של ניתוח סינון תוכן גבוה המבוססות על תאים וקריאה צפויה של בידול. (A)תמונות מייצגות של רכישת HCS של באר שלמה (צלחת 96-well) ושדה יחיד מבודד שנרכש עם מטרה של פי 10 של תרבות 12 DIVs של OPCs שמקורם ב- NSC. (B)HCS מנתח שלבי זרימת עבודה כולל תצוגה חזותית של גרעין (אובייקטים), זיהוי ובניית טבעת גרעין כדי לזהות את הכתמים הציטופלסמיים ואת זיהוי הסמן. (C)גרף המציג את הרכב התרבות הצפוי בסוף שלב הבידול (12 DIVs). סמנים עבור OPCs (PDGFαR, NG2), preOLs (CNPase, APC), OLs בוגר (MBP), אסטרוציטים (GFAP) נוירונים (β-III-טובולין) מוצגים עבור תרבויות עובריות ומבוגרות. אחוזים מעוגלים עבור כל סמני תא נכללים בגרף, שים לב כי זהו ניסוי מייצג ואחוזים עשויים להיות שונים על 5%-10%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: נציג תמונות הקרנה בעלות תוכן גבוה של תרבות בצפיפות גבוהה. (A)תמונה מייצגת של תמונת באר (96-well צלחת) שנרכשה על ידי המטרה 10x ומסומנת לביטוי MBP בסוף שלב הבידול (12 DIVs). (B)נציג שחולץ תמונת שדה המדגישה את נוכחותם של תאים מצטברים וגרעיני חפיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ההשפעה הצפויה של טיפול בציטוקינים על תרביות OPC שמקורן בעובר ובמבוגרים. (A)גרף המציג את אחוז השונות של תרביות OPC שמקורן בעובר ובמבוגרים בהשוואה לתרבויות סטנדרטיות, כולל כימות OPCs (NG2), preOLs (CNPase) ו- OLs בוגרים (MBP) בסוף שלב הבידול (12 DIVs). (B)תמונות מייצגות של תרבויות למבוגרים בסוף שלב הבידול (12 DIVs) שטופלו בתערובת רכב או ציטוקינים ומסומנות עבור NG2 או CNPase / MBP. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ההשפעה הצפויה של חשיפה ל-OGD על תרביות OPC שמקורן בעובר. (A)גרף המציג את אחוז הגרעינים המרוכזים המכומתים על-ידי HCS מבוססי תאים בתרבויות בעלות שליטה (ctrl) ו- OGD. (B)תמונות מייצגות של אובייקטים מעובדים HCS המדגישים את הגרעינים המרוכזים המזוהים (חצים לבנים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: רשימת נוגדנים ראשוניים ומשניים.

האופי המורכב של תהליכי מיאלינציה/רמיאלינציה ואירועים דמיאלינטיים הופכים את התפתחותן של מערכות במבחנה לניבוי מאתגרת ביותר. מערכות סינון התרופות במבחנה הנפוצות ביותר הן בעיקר קווי תאים אנושיים או תרביות OL טהורות ראשוניות, עם שימוש גובר בתרבויות משותפות מורכבות יותר או במערכות אורגנוטיפיות¹⁵. גם אם מערכות כאלה יחד עם טכנולוגיות תוכן גבוה, תרביות OL טהורות נשארות שיטת הבחירה בעת פיתוח פלטפורמות סינון¹⁶.

התרבות המעורבת הספונטנית המתוארת כאן מייצגת מערכת הפריה חוץ גופית שימושית, שלוקחת בחשבון את כל המשתנים העיקריים: בידול OPC פיזיולוגי בתיווך T3, הפרעות פתולוגיות לתהליך, רכיבים תאיים אחרים והבדלים הקשורים לגיל. ההליך מכיל מספר משתנים הנובעים ממקור התאים (גיל החיה) ומיווצרות הכדורידים והמניפולציה. למעשה, צעד קריטי הוא צפיפות התא של NSCs זורע לאחר הבידוד מן הרקמה, כי במצב אופטימלי כדור אחד צריך לנבוע מתא מתרבה יחיד. מאז שראינו כי NSCs מבודדים נוטים לצבור וכי הם צריכים גורמים paracrine מופרש משלהם, זריעת אותם בטווח של 10-50 תאים / μL, בבקבוק t25 או t75, היא הפשרה הטובה ביותר כדי למנוע צבירת תאים אבל עדיין מאפשר לתאים לתקשר על ידי גורמים מפרישים.

המגבלות העיקריות של הטכניקה היא היעדר מיאלינציה אקסונית פונקציונלית ואינטראקציה ישירה עם נוירונים, שכן השיטה לוקחת בחשבון רק את בידול OPC עד לשלב של OLs בוגרים: CNPase / MBP כפול תאים חיוביים עם מורפולוגיה רשת עכביש. למטרה זו, OPCs ראשי תרבות על גרעיני שורש שרירי שריר מבודד הוא עדיין המתודולוגיה העיקרית¹⁷. עם זאת, האפשרות להבדיל תאים אלה מבעלי חיים בכל גיל היא נקודה בסיסית בתהליך התרגומי, שכן היא מאפשרת בדיקה של תרכובות וגירויים מזיקים על תאים מבודדים מעידן העניין. כפי שתואר כאן, למעשה, NSCs ניתן לבודד הן מן העובר והן את המוח הבוגר. מאז מיאלינציה התפתחותית remyelination בבגרות לשתף את אותה מטרה, כלומר, כדי להגיע אקסון עירום וליצור את נדן המיאלין, זה היה במקור שיער כי שני התהליכים היו זהים בכל היבט, יצירת מה שנקרא השערת recapitulation¹⁸. עם זאת, כעת ברור כי שני התהליכים לא יכולים להיחשב שווים וכי הבדלים הקשורים לגיל מהותי בתא קיימים ויש לקחת בחשבון בעת בחירת מודל במבחנה המתאימה ביותר לשאלה הניסיונית¹⁹. OPCs למבוגרים שמקורם ב- NSCs, למעשה, מראים הבדלים חזקים בבידול פיזיולוגי מונחה TH ופגיעות לגירויים מזיקים^14,20, כמו גם OPCs^{ראשיים 21,22}. יש גם הטרוגניות של OPCs ואוכלוסיית OLs ברקמות מבוגרות, של רלוונטיות מסוימת עבור^{תנאים פתולוגיים 23}. פרוטוקולים לבידוד OPCs ראשוני מרקמות בוגרות זמינים²⁴ ויש לשקול כאשר השאלה הניסיונית מופנית למולקולות הפועלות על remyelination בבגרות.

ההבחנה של OPCs מ- NSCs מאפשרת את הייצוג במבחנה של תהליך הבידול כולו, ממבשר לא מובחן ועד OL בוגר. תהליך זה דומה למצב in vivo, שבו TH הוא המניע העיקרי של התהליך, הפועל באמצעות קולטנים גרעיניים ספציפיים, והוא מאפשר הפרעה ניסיונית עם מנגנון זה כדי לחקות תנאים פתולוגיים בתצוגה תרגומית¹³.

המאפיין הבסיסי הסופי של המודל הוא נוכחות מתמדת של אסטרוציטים בכל התרבות. אמנם זה עושה את התרבות קשה יותר לנתח, הרכב התא המורכב שלה מהווה יתרון מובהק. האופן שבו אסטרוציטים תורמים לתגובה לאירועים מזיקים בתרבויות עצביות מעורבות²⁵ ידוע באופן נרחב, והיעדר מרכיב עיקרי זה של מערכת החזותיות הופך את מערכת ההקדמה לצפויה ותרגום גרועה. מצד שני, עבור מאפיין זה, תרבויות שמקורן במל"ל יש את החיסרון של להיות פחות אחיד מאשר מערכות מסוג תא אחד, וזה עלול להוביל לניתוח מוטה. עם זאת, טכניקת HCS המבוססת על תאים מאפשרת ניתוח של התרבות כולה ושל כל אוכלוסיות התאים, ומסירה גם את האקראיות של שדות מייצגים לניתוח. בהנחה שתרבית התאים המשמשת לניסוי היא באיכות זריעה אמינה, ה- HCS ייתן תמונה מלאה של תנאי הניסוי, ויפיק נתונים חזקים סטטיסטית ומספר ניתוחים אוטומטיים המבוססים על פלואורסצנטיות.

לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הליך הבידוד וההבחנה של OPCs שמקורם ב- NSC ממוחו העוברי והמבוגר. הפרוטוקול כולו אורך כ -30 יום, בהתאם לגיל בעלי החיים ולמטרות הניסיוניות. בפרט, היווצרות ספירות ממקור מבוגר עשוי לקחת זמן כפול בהשוואה לאלה העובר, באותה צפיפות זריעה. הזמן של 15 ימים (מ -3 עד 12 DIVs) לאחר זריעה על משטח 2D עבור אינדוקציה בידול הוא, עם זאת, זמן קבוע בכל התנאים. הפרוטוקול המלא מאפשר לחקור את כל תהליך הבידול בתיווך TH בסביבה תאית מורכבת, הפרעה באמצעות מנגנונים פתולוגיים ספציפיים (כלומר, ציטוקינים דלקתיים ו- HI) ובדיקה של אסטרטגיות חדשות שמטרתן להתגבר על נושאים אלה. הצימוד של מודל התרבות בטכניקת HCS מייצר פלטפורמת סינון חזקה וניתנת לתרגום.

למחברים אין מה לחשוף.

נתמך על ידי אשכולות הטכנולוגיה הלאומיים של MIURהצגת IRMI (CTN01_00177_888744) ואזור אמיליה-רומאניה, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.

תודה מיוחדת לקרן IRET על אירוח העבודה הניסיונית.