Fuente: Laboratorio del Dr. Jimmy Franco - Merrimack College

Cromatografía en columna es una de las técnicas más útiles para purificar compuestos. Esta técnica utiliza una fase estacionaria, que se embala en una columna, y una fase móvil que pasa a través de la columna. Esta técnica aprovecha las diferencias de polaridad entre compuestos, permitiendo que las moléculas suelen estar separado. ¹ las dos fases estacionarias más comunes para cromatografía en columna son gel de sílice (SiO₂) y alúmina (Al₂O₃), con más común utiliza fases móviles siendo solventes orgánicos. ² el solvent(s) para la fase móvil dependen de la polaridad de las moléculas de ser purificada. Más compuestos polares requieren típicamente más disolventes polares con el fin de facilitar el paso de las moléculas a través de la fase estacionaria. Una vez finalizado el proceso de purificación del solvente puede eliminarse de las fracciones recogidas utilizando un evaporador rotatorio para producir el material aislado.

La mezcla de muestra se coloca en la parte superior de la columna y absorbida en la parte superior de la fase estacionaria. Posteriormente, la fase móvil se aplica a la columna y utilizada a fin de eluir la mezcla a través de la fase estacionaria. Cromatografía de columna explota la polaridad de la molécula para separar los compuestos. La diferencia de polaridad conduce a variaciones en la tasa en la cual las moléculas viajan a través de la columna, que separa eficazmente los compuestos entre sí. La fase móvil se recoge en pequeñas fracciones en tubos de ensayo como elutes de la columna, permitiendo el aislamiento y purificación de los compuestos. Por último, el disolvente se elimina utilizando un evaporador rotatorio a la aislada, establecidos.

Versatilidad y comodidad de la cromatografía de columna ha hecho una de las técnicas más ampliamente utilizadas para purificar compuestos. A diferencia de la recristalización (otro había utilizado técnica de purificación) compuestos purificados con cromatografía de columna no debe ser sólida. Cromatografía de columna también es capaz de aislar a un número de compuestos de una mezcla. Otra de las ventajas de la cromatografía de columna es que muy poco se conoce acerca de las propiedades físicas del compuesto para poder utilizar este método de purificación, que esta técnica hace muy valioso al sintetizar o aislar compuestos novedosos, en la que poco se sabe sobre los establecidos.

Solvente

La tasa a la cual un compuesto atraviesa a través de la columna depende de la fase móvil se utiliza. Por lo general, el más polar el solvente más rápido los compuestos pasará a través de la columna. Solventes polares tienen una mayor afinidad por la fase sólida, limitando las interacciones entre los establecidos y la fase sólida, permitiendo que los compuestos a fin de eluir más rápidamente. Debe tenerse cuidado para asegurar que el sistema solvente elegido para la cromatografía de columna tiene la polaridad adecuada para crear separación entre los compuestos en la mezcla. La elección del disolvente es crucial para la exitosa separación mediante cromatografía en columna. Para identificar un óptimo sistema de solvente, se debe realizar una serie de experimentos de capa delgada cromatografía (TLC) antes de realizar el experimento de la cromatografía de columna. En algunos casos puede ser necesario utilizar un sistema binario de solvente.

Selección de un sistema de solventes

1. Identificar un sistema de solventes que produce un factor de retardo (R_f ) entre 0,2 – 0,3 para el compuesto deseado en una placa de TLC.
2. Empezar con acetato de etilo o diclorometano como fase móvil para el experimento de TLC.
   1. Si la R_f es mayor que 0.3, probar con menos disolvente polar, como hexano. Si la R_f es menor que 0.2, intenta añadir una pequeña cantidad de un disolvente polar como el metanol.
   2. El sistema solvente óptimo puede requerir una mezcla de dos solventes.
   3. Ser cuidado de no usar más del 10% metanol como fase móvil para una columna de sílice.

1. mezcla de Gel de silicona de

1. Verter el gel de sílice en un matraz Erlenmeyer. El peso del material de embalaje debe ser de aproximadamente 50 x de la muestra están separada. Si los compuestos se separaron tienen valores muy similares de R_f , puede requerir usar una mayor cantidad de sílice por muestra, que es el caso de este ejemplo.
   1. Lugar 10 g de sílice en el matraz de Erlenmeyer, ya que 50 mg de la muestra (45 mg de Fluorenona y 5 mg de tetraphenylporphyrin) están siendo aislados.
2. Añadir el sistema de solventes (hexano/diclorometano, 70%: 30%) en el erlenmeyer que contiene el gel de sílice. Agregue suficiente solvente para asegurarse de que todo el gel de sílice es bien solvatados. La silicona no se disolverá, pero la mezcla será visualmente perceptible cuando solvatados. Una vez que se ha añadido el disolvente agitar el matraz Erlenmeyer para asegurarse de que la sílice es bien solvatados.

2. preparación de la columna

1. Seleccione la columna de tamaño adecuado. Por lo general la columna se debe llenar a medio camino con mezcla de gel de silicona. Cuanto mayor sea la muestra ser purificado, el más grande la columna necesaria.
2. Conecte la parte inferior de la columna con un trozo de lana de vidrio. Con una varilla larga, asegúrese de que la lana se encuentra firmemente en la parte inferior de la columna justo por encima de la llave de paso.
3. Una vez que la lana esté firmemente en su lugar, aplicar una fina capa de arena sobre la lana de vidrio.
   Nota: Si la columna está equipada con una frita de vidrio encima de la llave de paso, debe omitirse este paso.
4. Abrazadera de la columna en posición vertical en un soporte de anillo.
5. Suavemente utilizando un embudo, vierta la mezcla preparada de gel de sílice en la columna. Puede que necesite añadir más disolvente para transferir la mezcla del matraz Erlenmeyer a la columna. Usando una pipeta, lave cualquier gel de silicona que se adhiere a los lados de la columna.
   1. Como el gel de sílice es colocar en la columna, golpee suavemente los lados de la columna para que el gel de sílice firmemente los paquetes y excluye cualquier burbuja de aire.
6. Abrir la llave de paso y deje que solvente drene en un erlenmeyer limpio hasta justo antes del gel de sílice y el solvente se reúnen frente. El gel de silicona nunca debe ir seco hasta que se complete el procedimiento.
7. Coloque una capa delgada de arena en la parte superior del gel de sílice (figura 1). Usando una pipeta, lave cualquier arena que puede haber pegado a los lados de la columna.
8. Drenar cualquier solvente adicional hasta que la arena está seca, pero no hasta la capa de gel de silicona.

Figura 1. La configuración adecuada para una cromatografía en columna el experimento antes de la adición de la muestra.

3. Añadir la muestra a la columna

1. Disolver la muestra en la menor cantidad de solvente (con el mismo disolvente que se utilizó para hacer la mezcla de gel de sílice).
2. Suavemente con una pipeta, añadir la muestra a la parte superior de la columna.
3. Una vez que la muestra se ha aplicado a la parte superior de la columna, abra la llave de paso y deje que el solvente drene a través de la capa de arena, pero no la capa de gel de silicona. Use una pequeña cantidad de solvente para lavar abajo cualquier muestra que puede haber se aferró a los lados de la columna. Este solvente adicional a través de la capa de la arena así como de drenaje.

4. liberador de la muestra a través de la columna

1. Muy suavemente con una pipeta, añadir 4 – 5 mL de disolvente de tal manera que no moleste a la capa de arena.
2. Colocar un embudo en la parte superior de la columna y muy despacio y suavemente llene el resto de la columna con el disolvente.
3. Abrir la llave de paso y deje que el solvente drene a través de la columna.
4. Comenzar a colectar la fase móvil como drena de la columna de tubos de ensayo.
   1. Tubos de ensayo deben colocarse en un bastidor de tubo de ensayo en una manera secuencial.
5. Agregar más solvente a la parte superior de la columna como sea necesario hasta que todos los compuestos deseados han eluida de la columna.

5. recuperación de los componentes

1. Si los compuestos son coloreados, entonces pueden ser visualmente identificados. Sin embargo, si los compuestos son incoloros, tendrán que identificarse mediante luz ulta-visible (UV) (si los compuestos contienen verbal) o con la tinción apropiada. La pureza de los compuestos puede ser verificada mediante cromatografía en capa fina.
2. Identificar los tubos de ensayo que contienen, establecidos de la deseada.
3. Combinar todas las fracciones que contienen el deseado aislado, establecidos en un matraz previamente tarado de (RB) de fondo redondo. Hacer esto para cada compuesto se aisló.
4. Evaporar el solvente colocando el frasco de RB en el rotavapor.
5. Una vez que se ha eliminado todo el disolvente, pesan el RB con el producto seco y restar el peso inicial del RB para obtener un rendimiento.

La muestra que contiene una mezcla de tetraphenylporphyrin (ATP, 5 mg) y Fluorenona (45 mg) se ha separado con éxito y cada compuesto ha sido aislado. El TPP primero eluida de la columna como una banda de púrpura-rojizo oscurezca y la Fluorenona posteriormente eluida de la columna como una banda amarillo ()figura 2). Las fracciones eluídas se recolectaron en tubos de ensayo e identificaron por sus colores característicos (figura 3). Las fracciones que contienen los compuestos aislados se fusionaron en RBs separados y el disolvente se eliminó usando un evaporador rotatorio para producir ATP altamente puro y Fluorenona. La pureza de los compuestos chromatographed se validó por la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). Compuestos se pueden además verificar punto de fusión, pero solamente si el punto de fusión para el deseado, establecidos se ha determinado previamente.

Figura 2. Como los compuestos de recorrer a través de la fase estacionaria empiezan a separar. En este experimento el TPP (banda de púrpura-rojizo oscuro) viaja a través de la columna un poco más rápido que la Fluorenona (banda amarilla).

Figura 3. Los compuestos responsables de la columna se recogen en tubos de ensayo. Los compuestos se separan en este experimento son coloreados, por lo que pueden ser identificados visualmente.

Resumen

Cromatografía en columna es un método conveniente y versátil para purificar compuestos. Este método separa compuestos basados en polaridad. Explotando las diferencias en la polaridad de las moléculas, cromatografía de columna suelen puede separar compuestos por la tasa a la cual los compuestos recorrer a través de la fase estacionaria de la columna. Una de las ventajas de la cromatografía en columna (especialmente en comparación con recristalización) es decir muy poco acerca de los compuestos deben ser conocidos antes del proceso de purificación. La otra ventaja al uso de cromatografía en columna es que puede utilizarse para purificar sólidos y aceites, mientras que la recristalización puede utilizarse para purificar sólidos. Esta técnica puede utilizarse también para aislar a varios compuestos de una mezcla.

Aplicaciones

Cromatografía en columna es uno de los métodos más convenientes y utilizados para purificar compuestos. Con frecuencia, reacciones sintéticas producen varios productos y cromatografía de columna puede utilizarse para aislar cada uno de los compuestos para la examinación adicional. Cromatografía de columna es sumamente valioso cuando sintetizando o aislar compuestos novedosos, ya que muy poco debe conocerse acerca de un compuesto y sus ' propiedades físicas antes del proceso de purificación.

La industria farmacéutica utiliza rutinariamente cromatografía en columna para purificar compuestos como parte de su proceso de desarrollo de drogas de etapa temprana. ³ a menudo en los investigadores de estas etapas preliminares se construir bibliotecas de compuestos alrededor de un compuesto de plomo y posteriormente utilizar la cromatografía en columna para purificar los compuestos recientemente sintetizados. ⁴ el uso y la versatilidad de esta técnica de purificación ha llevado a educadores a incorporar la técnica en el plan de estudios de pregrado. ^5,6

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5. Davies, D. R.; Johnson, T. M., Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography. Journal of Chemical Education,84 (2), 318 (2007).
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