כרומטוגרפיה של עמודה
מקור: המעבדה של ד"ר ג'ימי פרנקו - מכללת מרימק
כרומטוגרפיה של עמודה היא אחת הטכניקות השימושיות ביותר לטיהור תרכובות. טכניקה זו משתמשת בשלב נייח, אשר ארוז בעמודה, ושלב נייד העובר דרך העמודה. טכניקה זו מנצלת את ההבדלים בקוטביות בין תרכובות, ומאפשרת להפריד בין המולקולות בקפדנות. 1 שני השלבים הניויים הנפוצים ביותר לכרומטוגרפיה של העמוד הם ג'ל סיליקה (SiO2)ואלומינה (Al2O3), כאשר השלבים הניידים הנפוצים ביותר הם ממיסים אורגניים. 2 הממסים שנבחרו לשלב הנייד תלויים בקוטביות של המולקולות המטוהרות. בדרך כלל יותר תרכובות קוטב דורשות יותר ממיסים קוטביים על מנת להקל על המעבר של המולקולות דרך השלב הנייח. לאחר השלמת תהליך הטיהור ניתן להסיר את הממס מהשברים שנאספו באמצעות מאייד סיבובי כדי להניב את החומר המבודד.
תערובת המדגם ממוקמת על החלק העליון של העמודה ונספגת על החלק העליון של השלב הנייח. לאחר מכן, השלב הנייד מוחל על העמודה ומשמש כדי לחמוק מהתערובת דרך השלב הנייח. כרומטוגרפיה של העמוד מנצלת את הקוטביות של המולקולה כדי להפריד בין התרכובות. ההבדל בקוטביות מוביל לשונות בקצב שבו המולקולות נעות דרך הטור, מה שמפריד ביעילות בין התרכובות זו לזו. השלב הנייד נאסף בשברים קטנים במבחנות כשהוא חומק מהעמודה, ובכך מאפשר בידוד וטיהור של התרכובות. לבסוף, הממס מוסר באמצעות מאייד סיבובי כדי להניב את התרכובות המבודדות.
הרבגוניות והנוחות של כרומטוגרפיה עמודה הפכו אותה לאחת הטכניקות הנפוצות ביותר לטיהור תרכובות. שלא כמו recrystallization (עוד טכניקת טיהור נפוץ) תרכובות מטוהר עם כרומטוגרפיה עמודה לא צריך להיות מוצק. כרומטוגרפיה עמודה הוא גם מסוגל לבודד מספר תרכובות מתערובת. יתרון נוסף של כרומטוגרפיה עמודה הוא כי מעט מאוד צריך להיות ידוע על המאפיינים הפיזיים של המתחם על מנת להשתמש בשיטת טיהור זו, מה שהופך טכניקה זו יקר מאוד בעת סינתזה או בידוד תרכובות רומן, שבו מעט ידוע על המתחם(ים).
הממס
הקצב שבו תרכובת עוברת דרך העמודה תלויה מאוד בשלב הנייד המנוצל. בדרך כלל, ככל שהממס קוטבי יותר, כך התרכובות יעברו מהר יותר דרך העמודה. ממיסים קוטביים יש זיקה גדולה יותר לשלב מוצק, הגבלת האינטראקציות בין התרכובות לבין השלב המוצק, ומאפשר את התרכובות לחמוק מהר יותר. יש לנקוט זהירות כדי להבטיח כי מערכת הממס שנבחר עבור הכרומטוגרפיה עמודה יש את הקוטביות המתאימה כדי ליצור הפרדה בין התרכובות בתערובת. בחירת הממס חיונית להפרדה מוצלחת באמצעות כרומטוגרפיה של עמודות. כדי לזהות מערכת ממס אופטימלית, יש לבצע סדרה של ניסויים כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) לפני ביצוע הניסוי כרומטוגרפיה עמודה. במקרים מסוימים ייתכן שיהיה צורך להשתמש במערכת ממס בינארית.
בחירת מערכת ממס
- זהה מערכת ממס המייצרת גורם פיגור (Rf ) בין 0.2-0.3 עבור המתחם הרצוי על צלחת TLC.
- התחל עם אתיל אצטט או דיכלורומתאן כשלב הנייד לניסוי TLC.
- אם ה- Rf גדול מ- 0.3, נסה פחות ממס קוטבי, כגון הקסאן. אם ה- Rf קטן מ- 0.2, נסה להוסיף כמות קטנה של ממס קוטבי כגון מתנול.
- מערכת הממס האופטימלית עשויה לדרוש תערובת של שני ממיסים.
- היזהר לא להשתמש ביותר מ 10% מתנול כמו השלב הנייד עבור עמוד סיליקה.
1. סיליקה ג'ל סלברי
- יוצקים את ג'ל הסיליקה לבקבוק ארלנמייר. המשקל של חומר האריזה צריך להיות בערך 50x מזה של המדגם המופרד. אם התרכובות המופרדות יש ערכי Rf דומים מאוד, אז זה עשוי לדרוש באמצעות כמות גדולה יותר של סיליקה לכל מדגם, שהוא המקרה בדוגמה זו.
- מניחים 10 גרם של סיליקה בבקבוק ארלנמאייר, שכן 50 מ"ג של מדגם (45 מ"ג פלואורנון ו 5 מ"ג של טטרפנילפורפירין) מבודדים.
- הוסף את מערכת הממס (hexane /dichloromethane, 70%: 30%) לבקבוק ארלנמאייר המכיל את ג'ל סיליקה. הוסף מספיק ממס כדי להבטיח כי כל ג'ל סיליקה הוא מפוף היטב. הסיליקה לא תתמוסס, אבל התערובת תהיה מורגשת חזותית כאשר פתיר. לאחר הממס נוספה מערבולת את בקבוק Erlenmeyer כדי להבטיח כי כל סיליקה הוא פתיר היטב.
2. הכנת הטור
- בחר את העמודה בגודל המתאים. בדרך כלל יש למלא את העמודה בערך באמצע הדרך עם רפת ג'ל סיליקה. ככל שהדגימה מטוהרת גדולה יותר, כך העמודה הנדרשת גדולה יותר.
- חבר את החלק התחתון של העמודה עם חתיכת צמר זכוכית. בעזרת מוט ארוך, ודאו שהצמר תקוע היטב בתחתית העמוד ממש מעל הסטופקוק.
- ברגע שהצמר נמצא במקומו, יש למרוח שכבה דקה של חול על צמר הזכוכית.
הערה: אם העמודה מצוידת בפריט זכוכית מעל הסטופקוק, יש להשמיט שלב זה. - מהדק את העמודה במיקום האנכי למעמד טבעת.
- בעזרת משפך, יוצקים בעדינות את הבוץ המוכן של ג'ל סיליקה לתוך העמוד. ייתכן שיהיה עליך להוסיף ממס נוסף כדי להעביר את העגמה מבקבוק Erlenmeyer לעמודה. באמצעות פיפטה, לשטוף את כל ג'ל סיליקה שנדבק לצדי העמוד.
- כאשר ג'ל הסיליקה מתיישב בעמודה, הקש בעדינות על צידי העמוד כדי להבטיח שג'ל סיליקה ייארז בחוזקה ולא יכלול בועות אוויר.
- פתח את stopcock ולאפשר ממס לנקז לתוך בקבוק Erlenmeyer נקי עד ממש לפני ג'ל סיליקה ואת חזית ממס נפגשים. ג'ל סיליקה לא צריך להתייבש עד ההליך הושלם.
- מניחים שכבה דקה של חול על גבי ג'ל הסיליקה(איור 1). באמצעות פיפטה, לשטוף כל חול שאולי נדבק לצדי העמוד.
- מסננים כל ממס נוסף עד שהחול יבש, אך לא לשכבת ג'ל הסיליקה.
איור 1. ההגדרה המתאימה לניסוי כרומטוגרפיה של עמודה לפני הוספת המדגם.
3. הוספת הדוגמה לעמודה
- להמיס את המדגם בכמות הקטנה ביותר של ממס אפשרי (באמצעות אותו ממס ששימש כדי להפוך את סיליקה ג'ל slurry).
- בעזרת פיפטה, הוסיפו בעדינות את הדגימה לראש העמודה.
- לאחר המדגם הוחל על החלק העליון של העמודה, לפתוח את stopcock ולאפשר ממס לנקז דרך שכבת החול אבל לא שכבת ג'ל סיליקה. השתמש בכמות קטנה מאוד של ממס לשטוף כל מדגם שאולי נצמד לצדי העמודה. לנקז ממס נוסף זה דרך שכבת החול גם כן.
4. ללוטן את המדגם דרך העמודה
- באמצעות פיפטה, בעדינות רבה להוסיף 4-5 מ"ל של ממס באופן כזה שאינו מפריע שכבת החול.
- מניחים משפך בחלק העליון של העמודה וממלאים לאט ובעדינות את שארית העמודה בממס.
- פתח את stopcock ולאפשר לממס לנקז דרך העמודה.
- התחל לאסוף את השלב הנייד כפי שהוא מתנקז מהעמוד לתוך מבחנות.
- מבחנות צריכות להיות ממוקמות בארון מבחנה באופן רציף.
- הוסף ממס נוסף לראש העמודה לפי הצורך עד שכל התרכובות הרצויות יתבהרו מהעמודה.
5. השבת הבוחרים
- אם התרכובות צבועות, אז הם יכולים להיות מזוהים חזותית. עם זאת, אם התרכובות חסרות צבע, יהיה יהיה לזהות אותם באמצעות אור ulta-גלוי (UV) (אם התרכובות מכילות הטיות) או עם הכתם המתאים. טוהר התרכובות ניתן לאמת באמצעות כרומטוגרפיה שכבה דקה.
- זהה את המבחנות המכילות את התרכובות הרצויות.
- מזג את כל השברים המכילים את התרכובות המבודדות הרצויות לבקבוקון עגול (RB) ששוקל מראש. עשה זאת עבור כל מתחם מבודד.
- לאדות את הממס על ידי הצבת בקבוקון RB על המאייד הסיבובי.
- לאחר כל הממס הוסר, לשקול את RB עם המוצר היבש ולהפחית את המשקל הראשוני של RB כדי להשיג תשואה.
המדגם המכיל תערובת של טטרפנילפורפירין (TPP, 5 מ"ג) ופלואורנון (45 מ"ג) הופרדו בהצלחה וכל תרכובת בודדה. ה-TPP חמקה תחילה מהטור כלהקה סגולה-אדמדמה כהה, והפלואורנון התחמק לאחר מכן מהטור כפס צהוב (איור2). השברים הנבהרים נאספו במבחנות וזוהו בצבעים הייחודיים שלהם(איור 3). השברים המכילים את התרכובות המבודדות מוזגו ל- RBs נפרדים והממס הוסר באמצעות מאייד סיבובי כדי להרשות לעצמו TPP ופלואורנון טהורים מאוד. טוהר התרכובות הכרומטוגרפיות אומת על ידי ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). תרכובות ניתן גם לאמת על ידי נקודת התכה, אבל רק אם נקודת ההיתוך עבור תרכובות הרצויות נקבעה בעבר.
איור 2. כאשר התרכובות עוברות דרך השלב הנייח הן מתחילות להיפרד. בניסוי זה TPP (להקה סגולה-אדמדם כהה) נוסע דרך הטור קצת יותר מהר מאשר פלואורנון (רצועה צהובה).
איור 3. כשהתרכובות חומקות מהעמוד הן נאספות במבחנות. התרכובות המופרדות בניסוי זה צבועות, כך שניתן לזהותן חזותית.
תקציר
כרומטוגרפיה של העמודים היא שיטה נוחה ורב-תכליתית לטיהור תרכובות. שיטה זו מפרידה בין תרכובות המבוססות על קוטביות. על ידי ניצול הבדלים בקוטביות של מולקולות, כרומטוגרפיה של העמודים יכולה להפריד בקלות תרכובות לפי הקצב שבו התרכובות עוברות דרך השלב הנייח של העמודה. אחד היתרונות של כרומטוגרפיה עמודה (במיוחד בהשוואה recrystallization) הוא כי מעט מאוד על תרכובות צריך להיות ידוע לפני תהליך הטיהור. היתרון השני בשימוש בכרומטוגרפיה של העמודות הוא שניתן להשתמש בו כדי לטהר הן מוצקים והן שמנים, בעוד שניתן להשתמש ב- recrystallization רק כדי לטהר מוצקים. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לבודד מספר תרכובות מתערובת.
יישומים
כרומטוגרפיה של עמודה היא אחת השיטות הנוחות ביותר בשימוש נרחב לטיהור תרכובות. לעתים קרובות, תגובות סינתטיות יפיקו מוצרים מרובים כרומטוגרפיה עמודה יכול לשמש כדי לבודד כל אחת מהתרכובות לבדיקה נוספת. כרומטוגרפיה של העמודים היא בעלת ערך רב בעת סינתזה או בידוד של תרכובות חדשניות, שכן מעט מאוד צריך לדעת על תרכובת ועל תכונותיה הפיזיות לפני תהליך הטיהור.
תעשיית התרופות משתמשת באופן שגרתי בכרומטוגרפיה של טורים כדי לטהר תרכובות כחלק מתהליך פיתוח התרופה בשלב מוקדם שלה. 3 לעתים קרובות בשלבים ראשוניים אלה חוקרים יבנו ספריות של תרכובות סביב תרכובת עופרת, ולאחר מכן להשתמש כרומטוגרפיה עמודה כדי לטהר את התרכובות המסונתזות החדשות. 4 השימוש הרב-תכליתיות הנרחבים בטכניקת טיהור זו גרמו למחנכים לשלב את הטכניקה בתוכנית הלימודים לתואר ראשון. 5,6
- Mayo, D. W.; Pike, R. M.; Forbes, D. C., Microscale organic laboratory : with multistep and multiscale syntheses. 5th ed.; J. Wiley & Sons: Hoboken, NJ; p xxi, 681 p (2011).
- Armarego, W. L. F.; Chai, C. L. L., Purification of laboratory chemicals. 5th ed.; Butterworth-Heinemann: Amsterdam; Boston; p xv, 609 p (2003).
- Silverman, R. B.; Holladay, M. W., The organic chemistry of drug design and drug action. Third edition / ed.; Elsevier/AP, Academic Press, is an imprint of Elsevier: Amsterdam ; Boston; p xviii, 517 pages (2014).
- Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield, B. et. al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry (2015).
- Davies, D. R.; Johnson, T. M., Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography. Journal of Chemical Education,84 (2), 318 (2007).
- Taber, D. F.; Hoerrner, R. S., Column chromatography: Isolation of caffeine. Journal of Chemical Education, 68 (1), 73 (1991).
Skip to...
Videos from this collection:
Now Playing
כרומטוגרפיה של עמודה
Organic Chemistry
358.4K Views
מבוא קטליזה
Organic Chemistry
34.1K Views
הרכבה של מערכת ריפלוקס לתגובות כימיות מחוממות
Organic Chemistry
166.3K Views
ביצוע תגובות מתחת לטמפרטורת החדר
Organic Chemistry
70.3K Views
העברת קווי שלנק של ממיסים
Organic Chemistry
41.5K Views
דיית נוזלים עם רכיבה על אופניים להפשרת משאבת הקפאה
Organic Chemistry
55.9K Views
הכנת ריאגנטים וציוד נטולי מים
Organic Chemistry
79.1K Views
טיהור תרכובות על ידי תיקון
Organic Chemistry
705.3K Views
הפרדת תערובות באמצעות משקעים
Organic Chemistry
157.2K Views
מיצוי נוזלי מוצק
Organic Chemistry
237.1K Views
אידוי סיבובי להסרת ממס
Organic Chemistry
212.3K Views
זיקוק שברים
Organic Chemistry
332.8K Views
גידול גבישים לניתוח עקיפה של קרני רנטגן
Organic Chemistry
32.3K Views
Performing 1D Thin Layer Chromatography
Organic Chemistry
288.4K Views
ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)
Organic Chemistry
246.7K Views
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved