Source : Laboratoire du Dr Jimmy Franco - Merrimack College

Chromatographie sur colonne est l’une des techniques plus utiles pour la purification de composés. Cette technique utilise une phase stationnaire, ce qui est emballée dans une colonne, et une phase mobile qui traverse la colonne. Cette technique exploite la différence de polarité entre composés, ce qui permet des molécules à séparer simpliste. ¹ les deux phases stationnaires plus courantes pour chromatographie sur colonne sont le gel de silice (SiO₂) et alumine (Al₂O₃), avec le plus couramment utilisé des phases mobiles en solvants organiques. ² le point choisi pour la phase mobile dépendent de la polarité des molécules étant purifié. Les composés polaires plus exigent généralement des solvants polaires plus afin de faciliter le passage des molécules à travers la phase stationnaire. Une fois achevé le processus de purification le solvant peut être retiré des fractions collectées à l’aide d’un évaporateur rotatif à céder le matériel isolé.

Le mélange de l’échantillon est placé sur le dessus de la colonne et absorbé sur la partie supérieure de la phase stationnaire. Par la suite, la phase mobile est appliquée à la colonne et utilisée pour éluer le mélange à travers la phase stationnaire. Chromatographie sur colonne exploite la polarité d’une molécule pour séparer les composés. La différence de polarité mène aux variations du taux auquel les molécules traversent la colonne qui sépare efficacement les composés entre eux. La phase mobile est recueillie en petites fractions dans des éprouvettes comme il élué au large de la colonne, permettant ainsi l’isolement et la purification des composés. Enfin, le solvant est supprimé à l’aide d’un évaporateur rotatif pour donner les composés isolés.

Polyvalence et la commodité de la chromatographie sur colonne a fait une des techniques plus couramment utilisés pour la purification de composés. Contrairement à la recristallisation (autre couramment utilisé la technique de purification) composés purifiés par chromatographie sur colonne n’ont pas à être solide. Chromatographie sur colonne est également capable d’isoler un certain nombre de composés d’un mélange. Un autre avantage du chromatographe de colonne est que très peu de choses doit être connu sur les propriétés physiques du composé afin d’utiliser cette méthode de purification, ce qui rend cette technique très utile lorsque la synthèse ou d’isoler de nouveaux composés, dont on connaît mal les composés.

Solvant

Le taux auquel un composé parcourt la colonne dépend fortement de la phase mobile utilisée. En règle générale, la plus polaire le solvant le plus rapidement les composés passeront au travers de la colonne. Les solvants polaires ont une plus grande affinité pour la phase solide, en limitant les interactions entre les composés et la phase solide, permettant les composés éluer plus rapidement. Attention il faut s’assurer que le système de solvant choisi pour la chromatographie sur colonne a la polarité appropriée pour créer la séparation entre les composés dans le mélange. Le choix du solvant est crucial à une séparation réussie à l’aide de la chromatographie sur colonne. Pour identifier un système optimal de solvant, une série d’expériences de chromatographie (TLC) de couche mince se fasse avant d’effectuer l’expérience de chromatographie sur colonne. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’utiliser un système de solvants binaire.

Sélection d’un système de solvants

1. Identifier un système de solvants qui produit un facteur de retard (R_f ) entre 0,2 et 0,3 pour le composé désiré sur une plaque de TLC.
2. Commence par l’acétate d’éthyle ou dichlorométhane comme phase mobile pour l’expérience de TLC.
   1. Si la R_f est supérieure à 0,3, essayez moins solvant polaire, comme l’hexane. Si la R_f est inférieure à 0,2, essayez d’ajouter une petite quantité d’un solvant polaire comme le méthanol.
   2. Le système de solvant optimal peut exiger un mélange des deux solvants.
   3. Être prudent méthanol de ne pas utiliser plus de 10 % comme phase mobile pour une colonne de silice.

1. le Gel de silice lisier

1. Verser le gel de silice dans un erlenmeyer. Le poids de l’emballage doit être à peu près 50 fois celui de l’échantillon étant séparé. Si les composés séparés ont des valeurs de R_f très semblables, il peut exiger à l’aide d’une grande quantité de silice par échantillon, c’est le cas dans cet exemple.
   1. Placer 10 g de silice dans l’erlenmeyer, étant donné que 50 mg d’échantillon (45 mg de fluorénone et 5 mg de tétraphénylporphyrine) sont être isolé.
2. Ajouter le système de solvant (hexane/dichlorométhane, 70 % : 30 %) dans l’erlenmeyer contenant le gel de silice. Ajouter suffisamment de solvant pour s’assurer que le gel de silice est bien solvaté. La silice se dissout pas, mais le mélange sera visuellement perceptible quand solvatés. Après avoir ajouté le solvant agiter l’erlenmeyer pour s’assurer que toute la silice est bien solvatés.

2. préparation de la colonne

1. Sélectionnez la colonne de taille appropriée. Généralement, la colonne doit être remplie à mi-chemin avec du lisier de gel de silice. Plus l’échantillon étant purifiée, plus la colonne requis.
2. Branchez le bas de la colonne avec un morceau de laine de verre. En utilisant une longue tige, assurez-vous que la laine soit solidement logée dans le bas de la colonne, juste au-dessus du robinet d’arrêt.
3. Une fois que la laine est fermement en place, appliquer une mince couche de sable sur la laine de verre.
   Remarque : Si la colonne est équipée de fritte de verre au-dessus du robinet d’arrêt, cette étape devrait être supprimée.
4. Fixer la colonne en position verticale à une position de l’anneau.
5. À l’aide d’un entonnoir, verser doucement le coulis préparé de gel de silice dans la colonne. Vous devrez peut-être ajouter le solvant supplémentaire pour transférer la boue de l’erlenmeyer à la colonne. À l’aide d’une pipette, rincer tout gel de silice qui se colle aux parois de la colonne.
   1. Comme le gel de silice s’installe dans la colonne, tapoter délicatement les côtés de la colonne pour que le gel de silice emballe hermétiquement et exclut les bulles d’air.
6. Ouvrir le robinet et laisser solvant s’écouler dans un erlenmeyer jusqu'à juste avant le gel de silice et le solvant avant de répondre. Le gel de silice ne devrait jamais aller sec jusqu'à ce que la procédure est terminée.
7. Étalez une fine couche de sable sur le dessus du gel de silice (Figure 1). À l’aide d’une pipette, rincer tout sable qui peut avoir coincé aux côtés de la colonne.
8. Drain de solvants supplémentaires jusqu'à ce que le sable est sec, mais pas jusqu'à la couche de gel de silice.

La figure 1. Le programme d’installation approprié pour une chromatographie sur colonne expérimenter avant l’addition de l’échantillon.

3. ajouter l’échantillon à la colonne

1. Dissoudre l’échantillon dans la plus petite quantité de solvant possible (en utilisant le même solvant qui servait à fabriquer le lisier de gel de silice).
2. À l’aide d’une pipette, ajouter doucement l’échantillon vers le haut de la colonne.
3. Une fois que l’échantillon a été appliqué à la partie supérieure de la colonne, ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la couche de sable mais pas la couche de gel de silice. Une très petite quantité de solvant permet d’arroser tout échantillon qui peut-être se sont accrochés aux parois de la colonne. Drainer ce solvant supplémentaire par le biais de la couche de sable aussi bien.

4. à élution de l’échantillon dans la colonne

1. À l’aide d’une pipette, ajouter très doucement de 4 à 5 mL de solvant d’une façon qui ne perturbe pas la couche de sable.
2. Placez un entonnoir au sommet de la colonne et très lentement et doucement remplir le reste de la colonne avec le solvant.
3. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler à travers la colonne.
4. Commencer à percevoir la phase mobile, tel qu’il s’écoule de la colonne dans des éprouvettes.
   1. Tubes de test devraient être placés dans un tube à essai rack de manière séquentielle.
5. Ajouter solvant supplémentaire vers le haut de la colonne si nécessaire jusqu'à ce que tous les composés désirés ont élué de la colonne.

5. récupérer les constituants

1. Si les composés sont colorés, puis ils sont visuellement reconnaissables. Toutefois, si les composés sont incolores, ils devront être identifiés à l’aide d’ulta-visible (UV) ultra-violette (si les composés contiennent la conjugaison) ou avec la tache appropriée. La pureté des composés peut être vérifiée à l’aide de la chromatographie sur couche mince.
2. Identifier les tubes qui contiennent les composés désirés.
3. Fusionner toutes les fractions qui contiennent les composés isolés désiré dans un ballon (RB) préalablement pesé. Procéder ainsi pour chaque composé étant isolé.
4. Laisser évaporer le solvant en plaçant le ballon RB sur l’évaporateur rotatif.
5. Une fois la totalité du solvant a été supprimé, peser le RB avec produit séché et soustraire le poids initial de la RB pour obtenir un rendement.

L’échantillon contenant un mélange de tétraphénylporphyrine (PPT, 5 mg) et de la fluorénone (45 mg) ont été séparé avec succès et chaque composé a été isolé. Le PPT élué tout d’abord la colonne comme une bande de pourpre-rougeâtre foncée et la fluorénone élué par la suite la colonne comme une bande jaune ()Figure 2). Les fractions éluées ont été recueillies dans des éprouvettes et identifiées par leurs couleurs distinctives (Figure 3). Les fractions contenant les composés isolés ont été fusionnées dans RBs distincts et le solvant a été supprimé à l’aide d’un évaporateur rotatif PPT extrêmement pur et fluorénone. La pureté des composés chromatographiés a été validée par la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN). Composés peuvent en outre être vérifiées par point de fusion, mais seulement si le point de fusion pour le composé désiré a été défini précédemment.

Figure 2. Comme les composés traversent la phase stationnaire, qu'ils commencent à se séparer. Dans cette expérience le PPT (bande rougeâtre-pourpre sombre) traverse la colonne un peu plus vite que la fluorénone (bande jaune).

La figure 3. Comme les composés éluer au large de la colonne, ils sont recueillis dans des éprouvettes. Les composés étant séparées dans cette expérience sont colorés, donc ils peuvent être identifiés visuellement.

Résumé

Chromatographie sur colonne est une méthode pratique et polyvalente pour la purification de composés. Cette méthode sépare composés basés sur la polarité. En exploitant les différences dans la polarité des molécules, chromatographie sur colonne peut séparer simpliste de composés par la vitesse à laquelle les composés traversent la phase stationnaire de la colonne. Un des avantages de la chromatographie sur colonne (surtout comparé à la recristallisation) est que très peu sur les composés doivent être connus avant le processus de purification. L’autre avantage de la chromatographie sur colonne, c’est qu’il peut être utilisé pour purifier les solides et les huiles, tandis que la recristallisation ne peut servir à purifier les solides. Cette technique permet également d’isoler un certain nombre de composés d’un mélange.

Applications

Chromatographie sur colonne est une des méthodes plus pratiques et largement utilisés pour la purification de composés. Souvent, les réactions synthétiques produira plusieurs produits et par chromatographie sur colonne peut être utilisé pour isoler chacun des composés pour un examen plus approfondi. Chromatographie sur colonne est extrêmement précieuse lors de synthèse ou d’isoler de nouveaux composés, comme très peu de choses doit être connu sur un composé et ses "propriétés physiques avant le processus de purification.

L’industrie pharmaceutique utilise régulièrement la chromatographie sur colonne pour purifier les composés dans le cadre de son processus de développement de drogue stade précoce. ³ souvent dans ces chercheurs d’étapes préliminaires va construire des bibliothèques de composés autour d’un composé de plomb, puis ensuite utiliser par chromatographie sur colonne pour purifier les composés nouvellement synthétisées. ⁴ l’utilisation extensive et la polyvalence de cette technique de purification a incité les enseignants à intégrer la technique dans les programmes de premier cycle. ^{5, 6}