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열 크로마토그래피

Overview

출처: 지미 프랑코 박사 연구소 - 메리맥 칼리지

컬럼 크로마토그래피는 화합물을 정화하는 데 가장 유용한 기술 중 하나입니다. 이 기술은 열에 포장된 고정 된 위상과 열을 통과하는 모바일 단계를 활용합니다. 이 기술은 화합물 사이의 극성의 차이를 악용하여 분자가 용이하게 분리 될 수 있게합니다. 1 컬럼 크로마토그래피를 위한 가장 일반적인 고정 단계는 실리카 젤(SiO2)및 알루미나(Al2O3)이며,가장 일반적으로 사용되는 이동상은 유기 용매이다. 2 이동상에 선택된 용매는 정제되는 분자의 극성에 의존한다. 전형적으로 더 많은 극성 화합물은 고정 된 단계를 통해 분자의 통과를 용이하게하기 위해 더 많은 극성 용매를 필요로한다. 정화 공정이 완료되면 절연 된 물질을 산출하기 위해 회전 증발기를 사용하여 수집 된 분획에서 용매를 제거 할 수 있습니다.

Principles

샘플 혼합물은 컬럼 의 상단에 배치되어 고정 된 단계의 상단에 흡수됩니다. 이어서, 이동상이 컬럼에 적용되고 고정된 단계를 통해 혼합물을 엘로우트하는 데 사용된다. 컬럼 크로마토그래피는 분자의 극성을 악용하여 화합물을 분리합니다. 극성의 차이는 분자가 컬럼을 통과하는 속도의 차이로 이어지며, 이는 화합물을 서로 효과적으로 분리합니다. 이동 단계는 컬럼을 벗겨낼 때 테스트 튜브의 작은 분획으로 수집되므로 화합물의 격리 및 정화를 허용합니다. 마지막으로, 용매는 리로이트 증발기를 사용하여 제거되어 절연 화합물을 산출한다.

컬럼 크로마토그래피의 다기능성과 편리함은 화합물정화에 가장 널리 사용되는 기술 중 하나입니다. 재결정화와는 달리(또 다른 일반적으로 사용되는 정제 기술) 컬럼 크로마토그래피로 정제된 화합물은 고체일 필요가 없다. 컬럼 크로마토그래피는 또한 혼합물에서 다수의 화합물을 격리할 수 있다. 컬럼 크로마토그래프의 또 다른 장점은 이 정화 방법을 사용하기 위해 화합물의 물리적 특성에 대해 거의 알 필요가 없다는 것입니다.

용매

컬럼을 통과하는 속도는 활용중인 이동 상에 크게 의존한다. 전형적으로, 용매가 많을수록 화합물이 컬럼을 통과할수록 더 빨라집니다. 극성 용매는 고체 상에 대한 더 큰 친화력을 가지며, 화합물(들)과 고체 상 사이의 상호 작용을 제한하여 화합물이 더 빠르게 엘루트할 수 있게 합니다. 컬럼 크로마토그래피를 위해 선택된 용매 시스템이 혼합물의 화합물 간의 분리를 만들기 에 적절한 극성을 가지고 있는지 확인하기 위해주의를 기울여야 합니다. 용매 선택은 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 최적의 용매 시스템을 식별하려면 열 크로마토그래피 실험을 수행하기 전에 일련의 얇은 층 크로마토그래피(TLC) 실험을 수행해야 합니다. 경우에 따라 이진 용매 시스템을 사용해야 할 수도 있습니다.

용매 시스템 선택

  1. TLC 플레이트에서 원하는 화합물에 대해 0.2-0.3 사이의 지체 계수(Rf)를 생성하는 용매 시스템을 식별한다.
  2. TLC 실험을 위한 이동 단계로 에틸 아세테이트 또는 디클로로메탄으로 시작합니다.
    1. R f가 0.3보다 크면 육산과 같은 극성 용매를 적게 사용해 보십시오. R f가 0.2 미만인 경우 메탄올과 같은 소량의 극성 용매를 추가해 보십시오.
    2. 최적의 용매 시스템은 두 개의 용매의 혼합물을 요구할 수 있다.
    3. 실리카 기둥의 이동 상으로 10% 이상의 메탄올을 사용하지 않도록 주의하십시오.

Procedure

1. 실리카 젤 슬러리

  1. 실리카 젤을 에를렌마이어 플라스크에 붓습니다. 포장 재의 무게는 분리되는 샘플의 약 50배여야 합니다. 분리되는 화합물이 매우 유사한 Rf 값을 가지고 있는 경우, 시료당 더 많은 양의 실리카를 사용해야 할 수 있으며, 이는 이 예의 경우이다.
    1. 에렌마이어 플라스크에 실리카 10g을 배치하면 50 mg의 샘플(플루오레네 45 mg, 테트라페닐포르피린 5 mg)가 분리되고 있기 때문에.
  2. 용매 시스템 추가(헥산/디클로로메탄, 70%: 30%) 실리카 젤을 함유한 에렌마이어 플라스크에. 모든 실리카 젤이 잘 솔레바닝되도록 충분한 용매를 추가합니다. 실리카는 녹지 않지만, 혼합물은 솔바드될 때 시각적으로 눈에 띄게 될 것입니다. 용매가 추가되면 모든 실리카가 잘 솔레바딩되도록 에를렌마이어 플라스크가 소용돌이치기 위해 날아다닌다.

2. 열 준비

  1. 적절한 크기의 열을 선택합니다. 일반적으로 컬럼은 실리카 젤 슬러리와 약 절반 정도 채워져야 합니다. 시료가 정결될수록 필요한 컬럼이 커지는 것입니다.
  2. 기둥의 바닥을 유리 양모 조각으로 연결합니다. 긴 막대를 사용하여, 양모가 스톱콕 바로 위에 있는 기둥의 바닥에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오.
  3. 울이 단단히 제자리에 있으면, 유리 울 위에 얇은 모래층을 바레게 발라주세요.
    참고: 컬럼에 스톱콕 위에 유리 프릿이 장착되어 있는 경우 이 단계를 생략해야 합니다.
  4. 수직 위치에 있는 열을 링 스탠드에 고정합니다.
  5. 깔때기를 사용하여, 부드럽게 기둥에 실리카 젤의 준비 슬러리를 부어. 에렌마이어 플라스크에서 기둥으로 슬러리를 전송하기 위해 용매를 추가해야 할 수 있습니다. 파이펫을 사용하여 컬럼 의 측면에 달라붙는 실리카 젤을 씻어 내보실 수 있습니다.
    1. 실리카 젤이 기둥에 침전되면 컬럼의 측면을 부드럽게 탭하여 실리카 젤이 단단히 포장되어 기포를 제외합니다.
  6. 스톱콕을 열고 용매가 실리카 젤과 용매 전면이 만나는 직전까지 깨끗한 Erlenmeyer 플라스크로 배출되도록 합니다. 실리카 젤은 절차가 완료될 때까지 건조해서는 안됩니다.
  7. 실리카 젤 위에 얇은 모래층을 놓습니다(도1). 파이펫을 사용하여 열 측면에 붙어있을 수있는 모래를 씻어 내보도록하십시오.
  8. 모래가 건조할 때까지 추가 용매를 배출하지만 실리카 젤 층까지는 빼내십시오.

Figure 1
그림 1. 시료를 첨가하기 전에 컬럼 크로마토그래피 실험에 대한 적절한 설정.

3. 컬럼에 샘플 추가

  1. 가능한 가장 적은 양의 용매로 샘플을 용해하십시오(실리카 젤 슬러리를 만드는 데 사용된 동일한 용매를 사용함).
  2. 파이펫을 사용하여 컬럼 상단에 샘플을 부드럽게 추가합니다.
  3. 샘플이 컬럼 의 상단에 적용되면 스톱콕을 열고 용매가 모래 층을 통해 배수하지만 실리카 젤 층은 배출 할 수 있습니다. 매우 적은 양의 용매를 사용하여 컬럼 의 측면에 달라 붙었을 수 있는 모든 샘플을 씻어내도록 합니다. 모래 층을 통해이 추가 용매를 배출.

4. 컬럼을 통해 샘플을 보례

  1. 파이펫을 사용하여 모래 층을 방해하지 않는 방식으로 4-5 mL의 용매를 매우 부드럽게 추가합니다.
  2. 깔때기를 열 상단에 놓고 열을 매우 천천히 채우고 열의 나머지 부분을 용매로 부드럽게 채웁니다.
  3. 스톱콕을 열고 용매가 열을 통해 배수되도록 합니다.
  4. 컬럼에서 테스트 튜브로 배출되는 이동 상수집을 시작합니다.
    1. 테스트 튜브는 순차적으로 테스트 튜브 랙에 배치해야합니다.
  5. 원하는 모든 화합물이 컬럼에서 용출될 때까지 필요에 따라 열 상단에 추가 용매를 추가합니다.

5. 선거구 민생 회복

  1. 화합물이 착색되면 시각적으로 식별 할 수 있습니다. 그러나 화합물이 무색인 경우, 울타 가시광선(UV) 광(화합물이 균주를 포함하는 경우) 또는 적절한 얼룩을 사용하여 식별되어야 합니다. 화합물의 순도는 얇은 층 크로마토그래피를 사용하여 확인할 수 있습니다.
  2. 원하는 화합물을 포함하는 테스트 튜브를 식별합니다.
  3. 원하는 절연 화합물(들)을 포함하는 모든 분획을 미리 계량된 라운드 바닥(RB) 플라스크로 병합합니다. 격리되는 각 화합물에 대해 이 작업을 수행합니다.
  4. 회전 증발기에 RB 플라스크를 배치하여 용매를 증발시다.
  5. 모든 용매가 제거되면 건조 된 제품으로 RB를 계량하고 RB의 초기 중량을 빼서 수율을 얻습니다.

Results

테트라페닐포르피린(TPP, 5 mg) 및 플루오렌(45 mg)의 혼합물을 함유한 시료가 성공적으로 분리되고 각 화합물이 분리되었다. TPP는 어두운 보라색 - 붉은 밴드로 열을 먼저 발동하고 형광은 이후 노란색 밴드 (그림2)로열을 발동했다. 용출된 분획은 시험관에서 수집되어 독특한색상(도 3)으로식별되었습니다. 격리된 화합물을 함유하는 분획은 별도의 RB로 병합되었고, 용매는 고순수 TPP 및 플루오레넨을 감당하기 위해 회전 증발기를 사용하여 제거되었다. 크로마토그래프 화합물의 순도는 핵 자기 공명(NMR) 분광법에 의해 검증되었다. 화합물은 또한 융점에 의해 검증될 수 있지만, 원하는 화합물에 대한 융점이 이전에 결정된 경우에만.

Figure 2
그림 2. 화합물이 고정 된 단계를 통과함에 따라 분리되기 시작합니다. 이 실험에서 TPP(짙은 보라색-붉은 밴드)는 플루오레넨(노란색 밴드)보다 약간 빠른 컬럼을 통과한다.

Figure 3
그림 3. 화합물은 컬럼을 벗겨내면서 시험관에서 수집됩니다. 이 실험에서 분리되는 화합물은 착색되므로 시각적으로 식별 할 수 있습니다.

Application and Summary

요약

컬럼 크로마토그래피는 화합물을 정화하는 편리하고 다재다능한 방법입니다. 이 방법은 극성에 따라 화합물을 분리합니다. 분자의 극성에 있는 다름을 이용함으로써, 컬럼 크로마토그래피는 화합물이 컬럼의 고정 단계를 통과하는 속도에 의해 화합물을 용이하게 분리할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피의 장점 중 하나 (특히 재결정화에 비해) 화합물에 대해 거의 정화 과정 전에 알려야한다는 것입니다. 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 또 다른 장점은 고체와 오일을 모두 정화하는 데 사용할 수 있으며, 재결정화는 고체를 정화하는 데만 사용될 수 있다는 것입니다. 이 기술은 또한 혼합물에서 화합물의 수를 격리하는 데 사용할 수 있습니다.

응용 프로그램

컬럼 크로마토그래피는 화합물을 정화하는 가장 편리하고 널리 사용되는 방법 중 하나입니다. 종종 합성 반응은 여러 제품을 생성하고 컬럼 크로마토그래피는 추가 검사를 위해 각 화합물을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 컬럼 크로마토그래피는 새로운 화합물을 합성하거나 격리할 때 매우 가치가 있으며, 정화 과정 이전에 화합물과 그 물리적 특성에 대해 거의 알 필요가 거의 없습니다.

제약 산업은 정기적으로 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 초기 단계 의 약물 개발 프로세스의 일환으로 화합물을 정화합니다. 3 종종 이러한 예비 단계에서 연구원은 납 화합물 주위 화합물의 라이브러리를 구성 합니다., 다음 나중에 컬럼 크로 마 그래피를 사용 하 여 새로 합성 된 화합물을 정화. 4 이 정화 기술의 광범위한 사용과 다양성은 교육자가 학부 커리큘럼에 기술을 통합하도록 촉구했습니다. 5,6

References

  1. Mayo, D. W.; Pike, R. M.; Forbes, D. C., Microscale organic laboratory : with multistep and multiscale syntheses. 5th ed.; J. Wiley & Sons: Hoboken, NJ; p xxi, 681 p (2011).
  2. Armarego, W. L. F.; Chai, C. L. L., Purification of laboratory chemicals. 5th ed.; Butterworth-Heinemann: Amsterdam; Boston; p xv, 609 p (2003).
  3. Silverman, R. B.; Holladay, M. W., The organic chemistry of drug design and drug action. Third edition / ed.; Elsevier/AP, Academic Press, is an imprint of Elsevier: Amsterdam ; Boston; p xviii, 517 pages (2014).
  4. Mortensen, D. S.; Perrin-Ninkovic, S. M.; Shevlin, G.; Elsner, J.; Zhao, J.; Whitefield, B. et. al. Optimization of a Series of Triazole Containing Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Kinase Inhibitors and the Discovery of CC-115. Journal of Medicinal Chemistry (2015).
  5. Davies, D. R.; Johnson, T. M., Isolation of Three Components from Spearmint Oil: An Exercise in Column and Thin-Layer Chromatography. Journal of Chemical Education,84 (2), 318 (2007).
  6. Taber, D. F.; Hoerrner, R. S., Column chromatography: Isolation of caffeine. Journal of Chemical Education, 68 (1), 73 (1991).

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Overview

1:01

Principles of Column Chromatography

3:06

Column and Sample Preparation

5:23

Separation of Compounds

6:24

Results

7:10

Applications

8:58

Summary

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