Marmosetlerde yumurtalık döngüsündeki evreyi belirlemek için kan örneklemesi ve hormon ölçümü

Bu protokol, yumurtalık döngüsü aşamasını belirlemek için progesteron/estradiol ve koryonik gonadotropin düzeylerini ölçmek için kan ve idrar örneklemesini tanımlar. Hormon seviyeleri, yumurtlamanın zamanlamasını tahmin etmek ve belirlemek için kullanılır ve yumurtalık döngüsünü ve oosit büyümesini düzenlemek için hormonlar enjekte edilir.

Ortak marmosetler küçük Yeni Dünya maymunlarıdır. Biyolojik mekanizmalarının çoğu insanlarınkine benzer olduğundan, marmosetler sinirbilim, rejeneratif tıp ve geliştirme gibi çeşitli alanlarda tıbbi ve insan biyolojisi araştırmaları için potansiyel olarak yararlıdır. Bununla birlikte, birçok temel deney ve prosedür için yöntemleri tanımlayan literatür eksikliği vardır. Burada, marmosetlerdeki seks hormonlarının (progesteron, estradiol ve koryonik gonadotropin) seviyelerini belirlemek için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu hormonların ölçümü, marmosetlerde tipik olarak 26-30 gün olan yumurtalık döngüsündeki aşamanın tahmin edilmesini sağlar; Oositlerin/zigotların doğru zaman noktasında toplanması ve genetiği değiştirilmiş marmosetlerin üretilmesi için konakçı dişilerin hazırlanması için doğru belirleme şarttır.

Ek olarak, seks hormonu seviyelerinin ölçümü endokrinoloji, etoloji, erken gelişim ve üreme biyolojisi çalışmaları için yararlıdır. Bu protokol, femoral venden kan örneklemesi, hormon ölçümü için plazmanın ayrılması, idrar ve plazma kullanılarak koryonik gonadotropin seviyelerinin ölçülmesi, döngüyü kısaltmak ve senkronize etmek için bir prostaglandin F2α analoğu enjeksiyonları kullanılarak yumurtalık döngüsünün sıfırlanması ve folikül uyarıcı hormon ve koryonik gonadotropin enjekte ederek foliküler büyüme ve yumurtlamanın teşvik edilmesi yöntemlerinin ayrıntılı bir tanımını sağlar. Bu protokoller kullanılarak, oositlerin / zigotların zamanında toplanması için yumurtalık döngüsündeki aşamalar belirlenebilir.

Ortak marmoset (Callithrix jacchus), insanlarınkine benzer birçok özelliğe sahip küçük bir Yeni Dünya maymunudur ve yumurtalık döngüsünün süresi 26-30 gündür ^1,2. Genetiği değiştirilmiş marmosetlerin erken gelişimi ve üretimi üzerine yapılan çalışmalar, yumurtalık döngüsünün belirli aşamalarında oosit ve zigotların toplanmasını gerektirir. Bu nedenle, evrenin doğru bir şekilde belirlenmesi çok önemlidir ve progesteron (P4) ve estradiol (E2) hormonlarının kan seviyelerinin ölçülmesiyle tahmin ^{edilebilir2,3}. Bu hormonlar, implantasyon için gerekli olan endometriyal büyümeyi teşvik eder. P4, yumurtlamadan hemen sonra yumurtalıklarda oluşan korpus luteumdan üretilir. E2, beyindeki hipotalamus-hipofiz kompleksinden folikül uyarıcı hormona (FSH) yanıt olarak yumurtalık folikülleri tarafından salgılanır. Folikül olgunlaştıkça E2 seviyeleri artar ve yumurtlamadan önce zirve yapar³. Yüksek E2 seviyeleri, insanlarda hipotalamus-hipofiz kompleksi yoluyla luteinize edici hormonun (LH) darbeli salınımına neden olur; bu LH dalgalanması yumurtlamaya neden olur. Bununla birlikte, marmosetlerde, LH geni evrim sırasında dejenerasyona uğramıştır ve yumurtlama, bunun yerine LH'lere benzer bir yapıya sahip olan koryonik gonadotropinin (CG) hipofiz bezinden salınmasıyla indüklenir ^4,5.

Yumurtalık döngüsü hormon enjeksiyonları ile kontrol edilebilir. İnsanlarda FSH enjeksiyonları, yumurtalık FSH reseptörlerine etki eder ve östrojen sentezini ve folikül büyümesini teşvik etmek için kullanılır⁶. Foliküler fazın sonunda LH'nin yerine insan CG (hCG) enjeksiyonu, insanlarda yumurtlamayı uyarmak için kullanılır⁷. CG enjeksiyonları ayrıca insan infertilitesini tedavi etmek için de kullanılır, çünkü CG hamileliğin erken döneminde korpus luteumu uyarır ve bu da P4 üretiminin artmasına neden olur. Prostaglandin F2α (PGF2α) enjeksiyonları yumurtalık döngüsünü^{sıfırlar 8}. Evcil sığırlarda, PGF2α enjeksiyonu, luteal fazı kısaltmak ve üreme yönetimi için kızgınlık döngüsünü senkronize etmek için kullanılır.

Marmosetler ve insanlar benzer biyolojik mekanizmalara sahip olsalar da, onları ideal model hayvanlar haline getirseler de, sık kullanılan birçok teknik için temel yöntemleri tanımlayan literatür eksikliği vardır. Kan örneklemesi en sık kullanılan tekniklerden biridir ^9,10,11,12. Ancak, yeni başlayanlar bazen damarı bulmakta zorlanırlar. Bu nedenle, bu çalışmada femoral ven bölgesinin anatomik analizleri yapılmıştır. Anatomik gözlemlere dayanarak, bu protokol femoral üçgenin proksimal bölgesini veniponksiyon için kolay bir bölge olarak tanıtır.

Marmosetleri içeren tüm yöntemler yüksek etik ve refah standartları kullandı ve Ulusal Çocuk Sağlığı ve Gelişimi Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Burada kullanılan hayvanlar, günde 12 saat ışık alan tek barınaklı veya çift barınaklı (bir dişi ve bir erkek) idi.

1. Femoral venin kan örneklemesi

1. 1 mL'lik bir şırınga hazırlayın (kısa tipin kullanımı kolaydır) 25 G'lık bir iğne bıçak tarafı yukarı bakacak şekilde takılı. Kanın tıkanmasını önlemek için, şırıngaya 200 μL seyreltilmemiş heparin sodyum çözeltisi çekerek şırıngayı heparine edin. Şırınganın içini birkaç kez yukarı ve aşağı çekerek eşit şekilde kaplayın; Ardından, heparin çözeltisini şırıngadan çıkarın.
   NOT: Genellikle yeni bir şırıngaya geçmek gerektiğinden, birkaç ek heparinize şırınga hazırlayın.
2. Emici pamuklu ve alkollü bezler hazırlayın. Kan örneklemesi için marmosetin yerleştirileceği alanı aydınlatmak için ayarlanabilir bir lamba açın.
3. Piyasada bulunan emniyet cihazını (420 x 85 x 85 mm, Şekil 1A) hazırlayın (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın). Cihazın içine bir marmoset yerleştirmek için, marmosetleri sabitleyen sünger kayış ile tutma kısmını açın. Marmoseti yukarı bakacak şekilde emniyet cihazına yerleştirin.
   NOT: Marmosetler genellikle kısıtlama cihazlarında sakindir, bu da kısıtlama alıştırma veya eğitim ihtiyacını ortadan kaldırabilir.
4. Marmoseti yakalayın; marmoseti silindirik parçaya yerleştirin; ve sünger kayışı aşağı bastırarak sabitleyin. Kanın alınacağı bacağı üst üste yerleştirin (Şekil 1A). Baskın olmayan elinizi kullanarak bacakları tutun; Sabitlemek için orta ve yüzük parmaklarını her bacağın içine yerleştirin ve diğer parmakları sabitlemek için her bacağın dışına yerleştirin.
   NOT: Marmosetleri çekerken ısırık eldivenleri önerilir. Bir kısıtlama cihazı yoksa, anestezi altında veya marmoseti kısıtlayan başka bir kişiyle kan alma işlemini gerçekleştirin.
5. Femoral venin uyluğun tabanına yakın bir yerde görünüp görünmediğini kontrol edin. Değilse, nabız atan arteri bulmak için palpe edin ve damarın içinden geçip geçmediğini kontrol etmek için bir dönüm noktası olarak kullanın (Şekil 1B-D).
   NOT: Görünürlüğü artırmak için masa aydınlatması ve saç tıraşı önerilir. Görünürlük, alkollü bezlerle ovuşturularak da artırılabilir. Üçgen içindeki lenf bezleri genellikle damara yakın bulunur ve toplardamar olarak koyu mavi bir renk gösterir. Bunların nasıl ayırt edileceği Temsili Sonuçlar bölümünde açıklanmıştır.
6. Alkollü bir bez kullanarak delinme bölgesini dezenfekte edin. İğne bıçağını yukarı bakacak şekilde 15°-20° açıyla yerleştirin. Kan alma sırasında iğnenin kan damarından kaymasını önlemek için, örneğin şırıngayı tutan eli diğer yandan dinlendirerek sabitleyin.
7. Negatif basınç uygulamak için pistonu yavaşça geri çekin (Şekil 1E). İğne ucunu ileri doğru itin. Şırıngaya kan girdikten sonra, gerekli hacim (500-700 μL) toplanana kadar iğne ucunun konumunu koruyun.
   1. Şırıngaya kan girmediğinde, delinme bölgesini değiştirin. İğneyi çekerken kan çıkarsa, delinme bölgesine 3 dakika boyunca baskı uygulayarak kanamayı durdurun. Kanamayı durdurduktan sonra damar delinmesini yeniden başlatın.
   2. Çekme işlemi sırasında şırıngaya çekilen kanın akışı durursa, iğne ucunu yavaşça ileri doğru itin ve ardından kan damarını bulmak için geri çekin. Bu, şırıngaya kan akışını geri yükleyebilir. Değilse, iğneyi dışarı çekin ve yeni bir şırınga kullanarak damar delme işlemi yapın.
      NOT: Aynı taraftan kan almanın zor olduğu durumlarda uyluğu diğer bacağınızda kullanın.
8. Küçük parmağınızı kullanarak delinme bölgesine hafifçe bastırırken iğneyi dikkatlice dışarı çekin. Ardından, emici bir pamuklu çubuk kullanarak, kanamayı durdurmak için delinme bölgesine hemen 3 dakika boyunca baskı uygulayın. Kan ve heparini karıştırmak için şırıngayı ters çevirin.
   NOT: Arteriyel kan alındığında soğurken daha uzun süre (5 dakika) basınç uygulayın ve bazen ölümcül bir sonuçla sonuçlanabilen hematom oluşumunu önlemek için kanamanın durduğunu dikkatlice onaylayın.
9. Kanamanın durduğunu onayladıktan sonra, sünger kayışı çıkarın, bir elinizle hayvanın belini tutun ve hayvanı, hayvanın koltuk altını arkadan başka bir elinizle tutabilecek şekilde döndürün.
10. Marmoseti kafesine geri koyun. Stresi azaltmak ve tekrarlanan kan örneklemesini kolaylaştırmak için marmosete en sevdiği yiyecekleri (örneğin bisküvi, marshmallow veya pandispanya) sağlayın. Ara sıra hematom oluşumunu kontrol edin.
    NOT: Hematom erken evrede bulunduğunda, hematomun ilerlemesini önlemek için basınçlı bir bandaj uygulayın. Uzun bir süre sonra bulunduğunda, femoral arterin bağlanması ve kan transfüzyonu ile hematomun cerrahi olarak çıkarılması gerekebilir ^9,13.
11. Hemolizi önlemek için iğneyi şırıngadan çıkarın. Ardından, toplanan kanı 1.5 mL'lik bir mikrotüpün iç duvarı boyunca yavaşça dışarı atın.
    NOT: Toplanan kan, P4 / E2 seviyelerini ölçmek için plazma ayrılmasından önce 24 saate kadar 4 ^°C'de saklanabilir.

2. Plazmanın ayrılması ve hormonal seviyelerin belirlenmesi

1. Kanı 1.5 mL'lik bir tüpte 1.100 × g'da 4 ^{° C'de}5 dakika santrifüj edin.
2. Ayrılan plazmayı (süpernatant) 1.5 mL'lik tüpten yeni bir tüpe / bardağa aktarın ve kan hücrelerinin (tortu) dahil edilmesini dikkatlice kaçının.
3. P4 ve E2 seviyelerini bir ELISA kiti veya otomatik analizör kullanarak ölçün. Plazma miktarı otomatik analizör için yeterli değilse, bir numune seyreltme çözeltisi kullanın.
   NOT: Otomatik analizör kullanılarak yapılan ölçüm için, sadece bir P4 seviyesini belirlemek için >175 μL plazma gereklidir ve hem P4 hem de E2'yi belirlemek için >250 μL plazma gereklidir.

3. Yumurtlama ve hamileliği tespit etmek için idrar CG ölçümü

NOT: Marmosetlerdeki CG seviyeleri, hem yumurtlama hem de hamilelik için bir immünokromatografik kit testi kullanılarak ölçülebilir. Yumurtlama durumunda yumurtlamadan 0-2 gün önce olumlu bir sonuç alınabilir. Hamilelik durumunda, hamileliğin 15-20. gününden yaklaşık 100. gününe kadar pozitif bir sonuç tespit edilir. Test az miktarda (90 μL) idrar gerektirir (bir damla idrar ~ 30 μL'dir).

1. Tepsi yöntemi: Aynı kafeste ikiden fazla hayvan varsa, hedef marmoseti (veya diğer hayvanları) bir gün önce başka bir kafese taşıyın. Aydınlatmadan bir gece önce veya daha önce kafesin altına temiz bir tepsi yerleştirin. Gece boyunca mesaneden idrar boşaltılmaz. Bu nedenle, idrar genellikle aydınlatmadan kısa bir süre sonra mesaneden salınır.
   NOT: Sabahları aydınlatmadan önce odaya girmek, kohortun uyku döngüsünü bozabilir. İdrar genellikle ışıktan yaklaşık 30 dakika sonra toplanabilir.
2. Sıkma yöntemi: Yıkanmış tepsileri idrar toplama için hazırlayın. Marmosetin mesanesini bulduktan sonra, parmaklarınızın tüm uzunluğunu kullanarak önden ve her iki yandan dikkatlice sıkın (Şekil 1F). Sabahları odayı aydınlatmadan hemen önce idrarı toplayın.
   NOT: Mesanede idrar olmaması nedeniyle idrar toplama işlemi başarısız olursa bir süre bekleyin ve tekrar deneyin. Aşırı güç kullanmamaya dikkat edin çünkü bu hayvana zarar verir.
3. Toplandıktan hemen sonra, idrar örneğini immünokromatografik test kitinin kuyusuna yerleştirin. Sonucu, üreticinin talimatlarına göre 10 dakika sonra okuyun.

4. Oosit, zigot ve embriyoların toplanması için yumurtalık döngüsü aşamasının kontrolü ve belirlenmesi

1. Germinal vezikül (GV) yumurtalıklardan oosit toplanması
   1. Luteal fazın sonunda yumurtalık döngüsünü sıfırlamak için 150 μL salin¹⁴ (Şekil 2) içinde seyreltilmiş 3 μL 0.263 mg / mL kloprostenol (sentetik bir PGF2α analogu) intramüsküler enjeksiyonu uygulayın (ör., luteal fazın başlamasından ≥ 10 gün sonra).
      NOT: Seyreltilmiş kloprostenol +4 ° C'de en az birkaç hafta stabil kaldığından, seyreltilmiş çözeltinin daha büyük bir hacimde yapılması uygun olabilir.
   2. Ertesi gün (1. gün), P4 seviyesinin düştüğünü kontrol ederek foliküler fazın başladığını onaylayın.
      NOT: Kloprostenol enjeksiyonunun 24 saat içinde P4 seviyelerini (genellikle <10 ng / mL) önemli ölçüde azalttığı bildirilmiştir³.
   3. 1. günden itibaren, FSH'yi (25 IU, kas içi) her 2 günde bir toplam 5x (1, 3, 5, 7 ve 9. günler) enjekte edin. 10. günde, öğleden sonra hCG (75 IU, kas içi) enjekte edin.
   4. Literatüre göre anestezi altında foliküler aspirasyon ile 11. günde yumurtalıklardan GV'leri toplayın^15,16.
      NOT: Bazen yumurtlama beklenenden daha erken gerçekleşir. Bu nedenle, CG seviyelerinin 8. günden itibaren kontrol edilmesi önerilir. CG testi pozitifse, bu gün GV toplaması yapın.
2. Metafaz II (MII) oositleri, zigotları ve erken embriyoların toplanması
   1. Adım 4.1.1'de açıklandığı gibi cloprostenol kullanarak yumurtalık döngüsünü sıfırlayın.
   2. Ertesi gün (1. gün), P4 seviyesinin düştüğünü kontrol ederek foliküler fazın başladığını onaylayın.
   3. Zigot ve embriyoların toplanması için, 6. günden itibaren çiftleşme için dişi marmosetleri erkek marmosetlerle birlikte barındırın.
   4. 7. günden itibaren, kadınların kan P4 / E2 seviyelerini ve idrar CG seviyelerini kontrol edin. CG'nin saptanması, birkaç gün içinde (genellikle ertesi gün) yumurtlamanın bir göstergesidir. Bir önceki güne göre P4 düzeylerinin arttığı ve E2 düzeylerinin azaldığı gün, yumurta kanallarından^MII oositleri veya embriyonik gün 0 (E0) zigotları toplayın ^17,18.
   5. Embriyo toplama için, literatürde anlatıldığı gibi, hedeflenen aşamaya bağlı olarak uygun zaman noktasında yumurta kanallarından (E1-E3, 1-8 hücreli)^17,18 veya uterustan (E5-E10, 8 hücreli blastosist)19,20,21,22 yıkama işlemi gerçekleştirin.

Bu çalışmada kullanılan hayvanlarla ilgili detaylar Tablo 1'de listelenmiştir.

Femoral venin anatomik analizleri
Femoral venin anatomik analizleri, ötenazi uygulanan 2 yaşında bir erkek ortak marmoset (I 7713M) kullanılarak yapıldı. Femoral venler ve arterler femoral üçgende bulunur. Femoral üçgen, karın duvarı ile uyluk kasları arasındaki sınırlarda oluşur (Şekil 1B-D). Uyluğun tabanında, ters üçgenin ortasından büyük bir damar geçer ve bir arter damarın dışına paralel olarak uzanır. Alt bölgede, damarlar ve arterler incelir ve üst üste biner, arterler damarların üstünde yer alır (Şekil 1D).

Kan örneklemesi için damar hedeflenmelidir, çünkü arteriyel bir yaralanma femoral arter hematomuna neden olabilir, bu da kanama şiddetli olduğunda kardiyovasküler şoka yol açabilir¹³. Üçgendeki damarın herhangi bir yerinden ve distal bölgesinden kan alınabilmesine rağmen, damarın büyük boyutu ve arter ile görünüşte çok az örtüşmesi nedeniyle femoral üçgenin proksimal bölgesinden damar delinmesi önerilir. Ek olarak, proksimal bölgedeki damar yüzeyseldir ve bir iğne kullanarak kolay konum sağlar. Nabız attığı için, femoral üçgendeki arter bazen görsel olarak veya palpasyonla tanımlanır ve ven sadece medial olarak uzanır. Böylece, arter nabzının gözlenmesi, damarın yerini tahmin etmeye yardımcı olur.

Ayrıca, damarı gösteren mavi bir renklenme genellikle üçgenin tepesindeki cilt altında görülür (Şekil 1B,C). Bununla birlikte, üçgendeki lenf düğümleri genellikle damara yakın bulunur ve koyu mavi bir renk gösterir, bu nedenle görünümleri benzerdir. Neyse ki, hareketlilikleri ile ayırt edilebilirler: damar sabittir ve lenf düğümleri hareketlidir. Bu nedenle, atardamarın nabzı ve damarın mavi rengi, damarı bulmak için kullanılan iki ana ipucudur, ancak bunları görselleştirmek için saçları tıraş etmek gerekebilir.

Yumurtalık döngüsündeki aşamanın belirlenmesi
P4 ve E2 seviyeleri, foliküler ve luteal fazların süresini araştırmak için altı dişi marmosette (1 ila 3 yaş arasında) izlendi. Sonuçlar, foliküler ve luteal fazlar için sırasıyla ortalama 11.58 gün (dört marmosetten n = 6) ve 16.8 gün (üç marmosetten n = 5) gösterdi (Tablo 2). Aşağıda, altı marmosetten birinin (I6751F, 3 yaşında) P4 ve E2 dinamikleri ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu hayvanda kan örneklemesi ve hormon ölçümleri 38 gün boyunca birkaç günde bir yapılmıştır (Tablo 3).

Luteal faz (1-10 gün)
Ölçümün başlangıç günü 1. gün olarak belirlendi. P4 seviyesine (21 ng / mL) dayanarak, hayvan muhtemelen luteal fazdaydı. 1 ila 10. günler arasında (≥21 ng / mL) yüksek bir P4 seviyesi gözlendi, bu da luteal fazı düşündürdü. 12. günde, keskin bir şekilde 4 ng / mL'ye düştü. Bu önemli azalma, lutealden foliküler faza geçişi gösterdi. E2 seviyesinin 10. günden (241 ng/mL) 12. güne (189 ng/mL) düşmesi de bu geçişi destekledi.

Foliküler faz (12-22 gün)
Foliküler faza geçtikten sonra, P4 seviyesi 19. güne kadar düşük (4-6 ng/mL) kaldı ve daha sonra 19. günden 24. güne kadar hafifçe arttı (19. gün, 6 ng/mL; 22. gün, 8 ng/mL; 24. gün, 9 ng/mL). Buna karşılık, E2 seviyesi 19. günden (94 ng / mL) 22. güne (322 ng / mL) önemli ölçüde artmış ve daha sonra 22. günden 24. güne (158 ng / mL) düşmüştür. Artan P4 ve azalan E2 seviyelerine dayanarak, yumurtlamanın foliküler fazdan luteal faza geçiş yaparak 22 ve 24. günler arasında meydana geldiği tahmin edildi.

Luteal faz (24-36 gün)
Yumurtlamadan sonra, P4 seviyesi 36. güne kadar yüksek kaldı ve daha sonra 38. günde 3 ng / mL'ye düştü. Bu nedenle, lutealden foliküler faza geçişin 36-38. günler arasında gerçekleşmesi muhtemeldir. Bu geçişle tutarlı olarak, E2 seviyesi bu dönemde azaldı (36. gün, 2517 ng / mL; 38. gün, 73 ng / mL).

Yumurtlama zamanlamasının tahmini ve belirlenmesi

İdrar CG düzeyi ile ovulasyon tarihi arasındaki ilişkiyi incelemek için yedi marmoset (No. 1-7) hazırlandı. Yumurtlama döngüsünü sıfırlamak için kloprostenol enjekte edildi (0. gün). Daha sonra 7. günden itibaren kan P4/E2 düzeyleri ve idrar CG düzeyleri izlendi. Aydınlatmadan hemen sonra idrar toplandı. Kan örneklemesi esas olarak sabahları yapıldı. Yumurtlamanın, E2 seviyesinin bir önceki güne göre büyük ölçüde düştüğü zaman meydana geldiği varsayılmıştır¹⁷. O gün, yumurtalıkların yüzeyinde foliküler yırtılma ve yumurta kanallarında zigot/oosit varlığı gözlendi (Tablo 4).

KG ilk olarak 7. ila 11. günlerde tespit edildi (7. gün, N = 1; 8. gün, N = 2; 9. gün, N = 1; 10. gün, N = 2; 11. gün, N = 1) (Tablo 4). E2 seviyelerindeki büyük düşüş (yumurtlamanın göstergesi) ilk CG sinyalinden 0-3 gün sonra gözlendi. İlk CG tespitinden E2 azalmasına kadar geçen süre, ilk CG tespiti daha erken olduğunda büyük görünüyordu (Şekil 3A). Örneğin, bir hayvan (No. 1), 7. gündeki ilk CG tespitinden 3 gün sonra E2 sinyalinde bir düşüş gösterdi (Tablo 4). Buna karşılık, ilk CG tespitinin birlikte ortaya çıkması ve E2 sinyalinin düşmesi, 10. günde bir hayvanda (No. 2) gözlendi. Bu nedenle, beş hayvandan birinde ilk CG tespiti ve yumurtlama aynı gün gözlenmesine rağmen, yumurtlama, CG'nin ilk tespitinden sonraki birkaç gün içinde meydana geldi.

Marmoset CG için immünokromatografik test kiti, test için idrar kullanmak üzere tasarlanmıştır. CG seviyesinin incelenmesi genellikle kan plazması kullanılarak P4 / E2 seviyelerinin belirlenmesine eşlik eder. CG testi için idrar yerine kan plazmasının kullanılması faydalı olacaktır. Bunu test etmek için, yukarıdaki deneylerde P4 / E2 seviyesi ölçümünden sonra kalan kan plazması incelendi. Yukarıdaki deneylerin yapıldığı günlerden herhangi birinde dört hayvandan kan plazması ve idrar toplandı (inceleme günleri Tablo 4'te çift yıldızla [**] gösterildi). İdrar kullanarak, dört hayvandan ikisi pozitif sonuçlar gösterdi (skor 5 ve 3) ve diğer ikisi negatif sonuçlar gösterdi (skor 1). Kan plazması esas olarak idrarla aynı sonuçları gösterdi (Şekil 3B). Daha güçlü sinyal kan plazması kullanılarak elde edildi. Bu nedenle, kan plazması kullanılırken, idrar için ayarlanan 10 dakikadan önce karar verilmelidir.

Resim 1: Marmosetlerden kan alınması. (A) Kan alımı için bir tutucu kullanılır. (B) Marmoset üst uyluk. (C) Femoral üçgen ve kan damarları. Üçgendeki femoral arter sıklıkla görülebilir ve nabız atar. Femoral venin mavi rengi bazen üçgenin proksimal bölgesinde (flebotomi bölgesi olarak gösterilir) görülebilir. Lenf düğümleri de mavi bir renk gösterir. Ancak lenf bezleri deriye yapışık olduğu için lenf bezleri hareketlidir. (D) Ötenazi yapılan hayvanın uyluğunun anatomik görünümü. Arter, ven ve flebotomi bölgesi endikedir. Aynı hayvan B-D'de gösterilmiştir. (E) Bir sınırlayıcı kullanarak kan alma. Marmosetin bacaklarının tutuş pozisyonu ve alınan kan gösterilir. (F) Bir marmosetten idrar toplama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Marmosetlerde yumurtalık döngüsü sırasında P4, E2 ve CG seviyelerinin tipik modelleri. FSH, hCG ve PGF2α enjeksiyonlarının zaman noktaları belirtilmiştir. Kesikli çizgiler PGF2α enjeksiyonundan sonra beklenen hormonal paterni gösterir. Kısaltmalar: P4 = progesteron; E2 = östradiol; CG = koryonik gonadotropin; FSH = folikül uyarıcı hormon; hCG = insan koryonik gonadotropini; PGF2α = prostaglandin F2α. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Yumurtlama oluşumunu tahmin etmek için CG seviyesinin belirlenmesi. (A) CG tespitinin ilk günü (skor > 1) ile yumurtlamaya kadar geçen süre (E2 düşüşü) arasındaki olası ilişki. (B) Kan plazması, immünokromatografik CG testleri için kullanılabilir. Her puanın temsili bir sonucu (üstte). Skor, numune yüklemesinden 10 dakika sonra belirlendi. Skor 2, 5 dakika içinde hiçbir bandın olmadığını, ancak 10 dakika içinde bir bandın ortaya çıktığını temsil eder. İdrar alındıktan kısa bir süre sonra kan alımı yapıldı. Dört marmoset ( Tablo S4'te No. 1, 2, 3, 5) incelendi. Burada kullanılan örnekler Tablo 4'te çift yıldız olarak belirtilmiştir. Kan plazması, E2 ölçümü için kullanılan seyreltme tamponu ile %50'ye seyreltildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan hayvanlar. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Foliküler ve luteal fazların süresi. Faz, P4 seviyesine göre belirlendi (foliküler faz P4 ≤ 8, luteal faz P4 > 8). Ölçümler arasında faz değişimi gözlendiğinde, ölçüm tarihleri arasındaki orta nokta değişim noktası olarak belirlenmiştir. İki değişim noktası arasındaki süre foliküler veya luteal fazlar olarak kabul edildi. Tek bir fazın süresinin ölçülmesini sağlamak için, iki fazı kapsadığı durumlar da dahil olmak üzere, aynı fazda uzun (≥7 gün) aralıklı veya ≥6 günlük aralıkların iki katı olan veriler analizler için kullanılmamıştır. Sadece aynı aşamada iki ölçüm yapıldığında veriler kullanılmıştır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Bir marmosette 38 gün boyunca P4 ve E2 ölçümlerinin sonuçları.Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 4: Yumurtlama günlerinin belirlenmesi ve tahmini. Yumurtalıklarda kanama yerleri veya yırtılma bölgeleri gözlenirse yumurtlama izlerinin mevcut olduğu düşünülmüştür. Oosit/zigot, E2 damlasının düştüğü gün yumurta kanallarından elde edilen oosit/zigotun evrelerini gösterir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Damarın yerinin belirlenmesi kan alımında en kritik adımdır. Anatomik gözlemlere dayanarak, bu protokol femoral üçgendeki proksimal alanı marmosetlerde kan alımı için kolay bir bölge olarak tanıtmaktadır. Bu bölge kullanılarak büyük bir damardan kan örneği alınması kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu protokolü kullansanız bile, bazen bir arterde yaralanma meydana gelir. Bir arteri yaralarken, hematomu önlemek için >5 dakika boyunca basınç uygulayarak kanamanın tamamen durdurulması önerilmektedir. Ayrıca basınç uygularken delinme bölgesini buz küpü kullanarak soğutmak da etkilidir. Hematomlar heparin ile tedavi edilebilir (ör., Tensolvet 5.000 IE jel). Çoğu hematom, heparin ve 0.05 mL meloksikam (0.5 mg / mL, p.o.) ile art arda 3-4 gün sonra kaybolur. Arter, uyluğun proksimal bölgesindeki damara lateral olarak uzanır. Distal alanda, damar ve arter birbirine daha yakın görünüyordu ve arter venin ventralinde yer alacak şekilde daha büyük ölçüde örtüşüyordu. Bu konumsal ilişkiye dayanarak, uyluğun proksimal bölgesinden kan örneklemesi muhtemelen arteriyel yaralanma riskini azaltır.

Ek olarak, proksimal bölgedeki femoral ven kalındır ve yüzeysel olarak yerleşiktir, bu da bir iğne kullanılarak kolay yerleşim sağlar. Bununla birlikte, distal bölgeden kan örneklemesi, proksimal bölgeleri sağlam bırakma avantajına sahiptir ve kan örneklemesi sırasında damar hasar görse bile, aynı bacağın proksimal bölgesinden hemen tekrarlanan damar delinmesine izin verir. Bunun nedeni, hasarlı bölgenin distal bölgesinin genellikle hemen veniponksiyon için kullanılamamasıdır. Bununla birlikte, kan alma başarısız olduğunda, diğer bacaktaki proksimal bölgeden tekrarlanan örnekleme yapılabilir.

Marmosetlerde dolaşan kan hacmi ~ 25 mL'dir (70 mL / kg)²³. 350 g'lık bir marmoset, toplam kan hacminin %7,5'ine eşdeğer olan 2 mL kan örneklemesinden kurtulmak için 1 hafta gerektirir⁶. Femoral venlerden 500-700 μL kan zorlanmadan toplanabilir. Tekrarlanan numune alımı gerektiğinde, daha az miktarda kan toplanması ve otomatik analizör için bir seyreltme tamponu kullanılması önerilir.

Anestezi genellikle kan örneklemesi için kullanılmasa da, yeni başlayanlar için anestezi uygulanmış hayvanlardan kan örneklemesi uyanık hayvanlardan çok daha kolay olabilir. Bununla birlikte, kan örneklemesi için anestezi kullanılırken dikkatli olunmalıdır, çünkü anestezi kan bileşenlerinin ölçülen değerlerini etkileyebilir. Yumurtalık döngüsündeki evreyi belirlemek için yapılan hormonal ölçümlerle ilgili olarak, alfaxalone'un beklenmedik şekilde daha yüksek P4²⁴ seviyeleri ile sonuçlandığı bildirilmiştir. Bu, anti-P4 antikorunun bir P4 türevi olan alfaksolona çapraz reaktivitesinden kaynaklandı.

P4 ve E2'nin (steroid hormonları) yapıları insanlar ve marmosetler arasında aynıdır. Bu nedenle, insan P4 ve E2 için ticari ELISA kitleri, marmoset P4 ve E2 için mevcuttur. İnsan kan hormonu ölçümü için dış kaynak kullanımı hizmetleri de mevcuttur. Buna karşılık, FSH, CG ve İnhibin gibi polipeptit hormonları için amino asit dizilerinde küçük farklılıklar vardır. Bu polipeptit hormonları için, bir kit hem insanlar hem de fareler gibi diğer evrimsel uzak türler için kullanılabilirse, marmosetler için de işe yarayacaktır. İnhibin B ölçümü için, bir İnsan / Fare / Sıçan İnhibin B (Beta B alt birimi) Enzim İmmünoassay Kiti kullanılabilir.

P4 seviyesindeki bir artış, yumurtlamanın (foliküler fazdan luteal faza geçiş) ayırt edici bir özelliğidir. Bireyler arasındaki farklılıklar, yumurtlama tarihini tek başına P4 seviyesinden belirlemeyi zorlaştırsa da, >8 ng / mL'lik bir P4 seviyesi, yumurtlama oluşumunun kaba bir göstergesi olarak kullanılabilir. Yumurtlama tarihinin daha güvenilir bir göstergesi, E2 seviyesi ^3,17'deki bir azalmadır. Yumurtlayan oositler / zigotlar gerçekten de E2 düşüşünün olduğu gün yumurta kanallarında gözlenmiştir (Tablo 4). Böylece, E2 ölçümü, kesin yumurtlama tarihini belirlememizi sağlar. Hormonal seviyelerin yanı sıra, PGF2α uygulamasından sonraki gün sayısı ile ilgili bilgiler yumurtlama gününün bir göstergesidir (Tablo 4). Benzer şekilde, P4 ve E2 seviyelerinin kombine kullanımı, P4 seviyelerinin önemli ölçüde azaldığı ve E2 seviyelerinin en düşük olduğu foliküler faza geçişin zamanlamasını belirlemeye yardımcı olur.

Marmosetlerde, yumurtlamayı indüklemek için LH yerine CG hipofiz bezinden salınır. Ek olarak, CG, embriyolar endometriyuma bağlandığında ve implante edildiğinde trofoblast hücrelerinden atılır. Marmosetler fonksiyonel bir LH geninden yoksun olduğundan, yumurtlamayı uyarmak için LH yerine CG hipofiz bezinden salınır⁵. Bir çalışma, yumurtlamanın göstergesi olan E2 ve CG zirvelerinin aynı gün gözlendiğini bildirmiştir¹². Başka bir çalışma, ortalama olarak, E2 zirvelerinin (PGF2α uygulamasından 8.6 gün sonra) CG zirvelerinden (PGF2α uygulamasından 9.3 gün sonra) önce geldiğini ^{bildirmiştir.25}, bu da yumurtlamanın CG zirvelerine ulaşmadan önce meydana gelebileceğini gösterir. CG, E2'den farklı olarak, zirveden hemen önce nabız salınır. CG'nin nabız salınımı, ortalama olarak, zirveden ~ 1 gün önce başlar. Bununla birlikte, CG seviyesinin ilk tespitinden E2 seviyesindeki düşüşe kadar geçen sürede büyük bir değişiklik gözlenmiştir (Şekil 3A ve Tablo 4). Ek olarak, CG'nin ilk olarak hem sabah hem de öğleden sonra örneklerinde tespit edildiği bildirilmektedir²⁵.

Bildiğimiz kadarıyla, marmosetlerde günün belirli bir saatinde meydana gelen yumurtlama raporu yoktur. Ek olarak, marmosetler genellikle aynı anda iki veya üç oosit salgılar, bu nedenle tüm oositlerin salındığı belirli bir süre olabilir. Artmış CG seviyeleri yumurtlamadan önce meydana geldiğinden, CG ölçümü yumurtlama tarihinin önceden tahmin edilmesini sağlar. Bu tür bilgiler, yumurtlama gününde MII oositlerinin veya 0. gün embriyolarının toplanması için özellikle yararlıdır. Bu nedenle, kan P4/E2 seviyelerinin ve CG seviyelerinin kombinatoryal ölçümü yararlıdır (Şekil 3B). İnsanlar da dahil olmak üzere çoğu primat türünde, doğumdan sonra bir süre yumurtlama gerçekleşmez. Bununla birlikte, doğum sonrası yumurtlama, doğumdan ~ 10 gün sonra marmosetlerde meydana gelir. Sonuç olarak, bir sonraki teslimat genellikle önceki teslimattan ~ 155 gün sonra gözlemlenir. Bu ardışık gebelik, ikizlerin doğumu ile birlikte, marmosetlerde yüksek düzeyde doğurganlık ile sonuçlanır.

Hormonal dalgalanmalar bireyler arasında farklılık gösterir ve bazılarının sabit bir döngüsü yoktur. Bazı dişi marmosetler, yumurtlama eksikliğini gösteren sürekli düşük P4 / E2 seviyeleri gösterir. Yumurtlama döngüsünün olmaması, baskın üreme dişilerinin olgunlaşmamışlığına, sağlık sorunlarına, strese veya yumurtlama inhibisyonuna bağlanabilir^26,27. Hormonal seviyeleri ölçen 21 marmosetten (>2 yaşındaki) üçü, yazarın tesisinde düzenli bir yumurtlama döngüsünün olmadığını gösterdi. Nedenlerinin anlaşılması ve uygun tedavilerin geliştirilmesi, hayvanların deneylerde daha etkin kullanılmasını sağlayacaktır. Uzamış luteal fazı ~ 1 ay olan ve buna bağlı yüksek P4 düzeyi olan bireylerde^{gözlenmiştir 2}. Yazarın tesisinde, aynı kişilerde uzun süreli bir luteal faz tekrarlanır. 21 marmosetten ikisi bu anormalliği gösterdi. İki hayvandan biri, hayvanın uzun süreli luteal faz sırasında hamile olma olasılığı dışında tek evdi. Diğeri, radyasyon tedavisi ile muhtemelen infertil bir erkekle eşleştirilir ve bu nedenle uzun süreli luteal faz sırasında hamile kalması olası değildir. Uzun süreli bir luteal fazda bile, PGF2α uygulaması P4 seviyesini düşürür ve yumurtalık döngüsünü sıfırlar. Cinsiyet hormonlarının ölçülmesi ve yumurtlama döngüsü durumunun anlaşılması, hayvanların deneylerde ve üremede etkin kullanımına yardımcı olur.

Bireylerden kan örneklemesi sadece yumurtlama tarihi tahmini için değil, aynı zamanda tanı amaçlı serolojik testler için de kullanılmaktadır. Benzer şekilde, hormon seviyelerinin ölçümü sadece yumurtlama gününü tahmin etmek için değil, aynı zamanda sosyal etkileşim, çocuk gelişimi ve hastalıkları incelemek için de kullanılır. Gelecekte, genetiği değiştirilmiş marmosetler yapmak için iPS hücrelerinden yumurtalıklar ve testisler gelişmesi beklenmektedir. Normal gelişim için uygun hormonal seviyeler önemli olmalıdır. Burada açıklanan protokol, marmosetlerde iPS hücresinden türetilmiş gonadlar yapmak için cinsel hormonların ölçümü ve kontrolü için faydalı olacaktır.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto ve Mikiko Horigome'ye bu protokolün oluşturulmasında ve marmosetlerin günlük bakımında verdikleri destek için teşekkür ederiz; El yazması hakkındaki yorumları için Takayuki Mineshige; Yukiko Abe ve Aiba laboratuvarı üyeleri, zigot toplama tekniklerini paylaştıkları için; CIEA, 40 yılı aşkın bir süredir geliştirdikleri marmosetler, konutlar ve deneyler hakkındaki bilgileri paylaştığı için. Bu araştırma, JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 ve JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 ve 22K18356 (KAKENHI) hibe numaraları altında AMED, JST ve KAKENHI tarafından desteklenmiştir.