Fluorescence-Guided Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization with Laser-Induced Postionization Mass Spectrometry of Individual Rat Neural Cells

이 프로토콜은 형광 유도 단일 세포 MALDI-2 질량 분석법에 microMS를 사용하여 1차 쥐 신경 세포의 분자 프로파일링을 향상시키는 방법을 설명합니다.

단세포 측정은 뇌의 풍부한 시공간화학적 이질성을 이해하는 데 매우 중요합니다. MALDI(Matrix-assisted laser/desorption ionization) 질량분석법(MS)은 개별 세포의 내인성 분자에 대한 표지 없는 고처리량 특성화가 가능합니다. 최근 레이저 유도 후 이온화(MALDI-2)를 통한 MALDI 질량 분석기 개발의 발전으로 다양한 지질 및 기타 저분자에 대한 검출 감도가 크게 향상되었습니다. 그러나 세포 분해능에서 MALDI-2를 사용한 대형 샘플의 MS 이미징은 대부분의 응용 분야에서 엄청나게 느립니다. 이 프로토콜에서는 일차 세포가 분리되어 전도성 슬라이드에 분산됩니다. 상대적인 세포 위치는 전체 슬라이드 형광 현미경 검사에 의해 결정된 후 현미경 검사 좌표를 MALDI-2 질량 분석기의 스테이지 좌표에 정확하게 일치시킵니다. 세포 위치만 대상으로 하는 표적 MS 분석은 전체 시료의 MS 이미징에 비해 분석물 커버리지가 높고 데이터 크기가 줄어든 고처리량 단일 세포 측정을 제공합니다. 단일 세포 준비, 전체 슬라이드 형광 이미징, 매트릭스 응용 분야 및 MALDI-2 질량 분석법에 필요한 중요한 단계를 설명합니다.

지질과 대사 산물은 세포 기능의 기본이며 막, 에너지원 및 신호 분자의 필수 구성 요소로 작용합니다 ^1,2. 그러나 이들의 구성과 풍부도는 개별 세포마다 크게 다를 수 있으며, 이는 세포 유형과 발달 및 기능 상태의 차이를 반영합니다 ^3,4,5. 이러한 차이를 분석하는 것은 생물학적 다양성을 이해하고 뚜렷한 세포 하위 집단을 식별하는 데 중요합니다. RNA 염기서열분석(sequencing)과 같은 단일 세포 측정 기법은 유용한 세포 특이적 전사체 프로파일을 제공합니다⁶. 그러나 이러한 전사체 수준 측정은 유전자 발현이 이러한 분석물의 실제 풍부함과 항상 상관관계가 있는 것은 아니기 때문에 지질 및 대사 산물의 실제 세포 양을 직접 반영하지는 않습니다. 따라서 지질과 대사 산물을 직접 측정하기 위한 특수 방법은 단일 세포와 그 집단의 화학적 조성을 종합적으로 분석하기 위해 필요합니다.

MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization) 질량 분석 이미징(MSI)은 in situ ^7,8 내인성 생체 분자의 무표지 공간 매핑을 위해 선택되는 도구입니다. 일반적으로 MALDI의 경우 UV 레이저를 사용하여 유기 매트릭스와 공동 결정화된 얇은 샘플 층에서 물질을 제거하여 이온과 중성 분자의 기둥을 형성합니다. 그런 다음 형성된 이온은 MS 분석기로 분리되어 질량 분석기 내에서 검출됩니다. 최신 질량 분석기 스테이지의 정확한 위치를 감안할 때 레이저는 특정 샘플 영역을 대상으로 배치하거나 여러 영역에 걸쳐 래스터화하여 MSI에 의해 분자 이미지를 생성할 수 있습니다. 집중된 레이저 빔과 정확한 스테이지 이동으로 달성된 세포 또는 세포 내 공간 해상도(< 10μm)에서 MSI를 사용하여 개별 세포에 대한 화학 정보를 얻을 수 있습니다 ^9,10. 그러나 이 규모에서의 MSI 측정은 특히 표적 세포 밀도가 낮은 샘플의 경우 세포 사이의 빈 영역을 이미징하는 데 소요되는 시간으로 인해 비효율적입니다. 또한, 많은 분석물의 검출 가능성은 샘플링되는 부피가 적기 때문에 제한적입니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 당사는 고처리량 단일 세포 분석을 위한 이미지 유도 MALDI MS 접근법을 개발했습니다^11,12. 이 접근 방식에서는 분산된 세포의 위치를 전체 슬라이드 형광 이미지에서 프로그래밍 방식으로 결정하고 질량 분석기 단계를 특정 매개변수(예: 크기 및 모양)를 가진 개별 세포가 있는 위치로 안내한 다음 MALDI 레이저를 사용한 방사선 조사를 통해 분석하는 데 사용됩니다. 이 표적 접근법을 사용하는 이전 연구는 이질적인 세포 집단에서 지질, 펩티드 및 기타 생체 분자를 특성화하는 데 사용되었습니다 ^5,13.

단일 세포의 질량 제한 특성을 감안할 때 이러한 샘플에서 검출된 분석물의 수는 일반적으로 조직에서 직접 관찰된 것보다 적습니다. 따라서 단일 세포 MS 분석에서 분석물 커버리지를 늘리려면 분석물 검출 감도를 높이는 것이 중요합니다. 이 검출 문제를 극복하는 데 도움이 되는 최근에 개발된 접근 방식 중 하나는 레이저 사후 이온화(MALDI-2)를 사용하는 MALDI로, 광범위한 분석물에 대한 감도를 향상시키는 것으로 나타났습니다 ^9,14,15,16. 그 결과, MALDI-2는 보다 포괄적인 단일 세포 데이터 세트를 생성하고 분리된 세포와 같이 질량이 제한된 샘플에서 더 깊은 분자 범위를 제공합니다.

이 방법의 목표는 수천 개의 개별 세포에서 지질 측정값을 얻는 것입니다. 이를 위해 고처리량 단일 세포 MALDI-2 질량 분석법을 가능하게 하고 일반적으로 정밀한 스테이지 제어를 통해 모든 프로브 기반 질량 분석 방식으로 확장할 수 있는 워크플로우를 설명합니다¹⁷. 이 워크플로우에서는 관심 있는 뇌 영역의 조직을 절개하고 파파인 해리 절차 후 조직에서 개별 세포를 얻습니다. 그런 다음 세포는 핵 염색으로 표지되고 기준점 마커가 에칭된 전도성 유리 슬라이드에 분산되어 접착될 수 있습니다. 다음으로, 형광 현미경을 사용하여 전체 슬라이드 이미지를 촬영합니다. 매트릭스는 승화에 의해 증착되어 단일 세포 MS 분석을 위해 반복 가능한 균질한 결정층과 높은 신호 대 잡음비를 생성합니다. 오픈 소스 소프트웨어인 microMS¹¹을 사용하여 현미경 이미지에서 세포 위치의 상대 좌표를 매핑하고 세포가 증착된 유리 슬라이드에 새겨진 기준 마커를 사용하여 포인트 세트 등록에 의해 질량 분석기 스테이지 좌표와 정렬됩니다. 마지막으로, 이 정보를 사용하여 각 개별 세포에서 정밀한 표적 MS 스펙트럼을 획득하여 단일 실행(<1시간)으로 수천 개의 세포를 프로파일링할 수 있습니다^12,13.

이 연구의 모든 동물 실험은 일리노이 제도 동물 관리 및 사용 위원회(23228)에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었으며 동물의 윤리적 대우 및 관리에 대한 국가 및 ARRIVE 표준을 엄격하게 준수합니다.

1. 재료 및 용액 준비

1. 1.5 mM CaCl₂, 4.9 mM KCl, 0.2 mM KH₂PO₄ , 11 mM MgCl₂ , 0.3 mM MgSO₄ , 138 mM NaCl , 27.7 mM NaHCO₃ , 0.8 mM Na₂HPO₄ 및 25 mM HEPES로 변형 된 Gey의 평형 염 용액 (mGBSS)을 준비합니다. 3M NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다. 1L의 mGBSS를 준비하고 사용할 때까지 4°C에서 보관하는 것이 좋습니다.
2. 준비된 mGBSS 용액을 채워 50mL 주사기를 준비하고 경심 관류를 위해 얼음 위에 놓습니다. 해부된 쥐 한 마리당 주사기 1개를 준비한다.
3. Worthington Papain Dissociation System 프로토콜에 따라 파파인 용액의 부분 표본을 준비합니다. 이 시스템에는 아래와 같이 4개의 바이알이 포함되어 있으며, 바이알 4는 이 프로토콜에 사용되지 않습니다.
   바이알 1: 중탄산염 및 페놀 레드를 함유한 멸균 Earle's Balanced Salt Solution(EBSS)
   바이알 2: L-시스테인과 EDTA가 함유된 파파인
   바이알 3: 데옥시리보뉴클레아제 I (DNase)
   바이알 4: 소 혈청 알부민을 함유한 오보뮤코이드 프로테아제 억제제
   1. 파파인 바이알(바이알 2)에 EBSS(바이알 1) 5mL를 넣고 37°C 수조에 10분 동안 넣어 파파인을 녹입니다.
   2. DNase 바이알(바이알 3)에 EBSS(바이알 1) 500μL를 넣고 부드럽게 혼합합니다. 희석된 DNase 바이알(바이알 3) 250μL를 파파인 바이알(바이알 2)에 추가합니다. 이 제제에는 20 units/mL 파파인, 0.005% DNase, 0.5mM EDTA 및 1mM L-시스테인의 최종 농도가 포함되어 있습니다.
   3. 후속 해리를 위해 이 준비된 파파인 용액의 분취량 250μL를 동결합니다(~20 분취량 생성). 이 용액에 100 units/mL 페니실린 G, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 100 μg/mL 겐타마이신과 같은 항생제를 보충하십시오. 이는 사용자의 응용 프로그램에 맞게 수정할 수 있습니다.
4. 150mM 아세트산 암모늄 용액을 준비하고 4°C에서 보관하십시오. 제조된 mGBSS 용액에 글리세롤을 희석하여 33% 글리세롤 용액을 준비합니다.
5. 텅스텐 카바이드 또는 다이아몬드 팁이 있는 인그레이빙 펜 또는 CO₂ 레이저 조각기를 사용하여 ITO(Indium Tin Oxide) 코팅 현미경 슬라이드에 듀시알을 에칭합니다. ITO 유리 슬라이드의 전도성 측면에서 슬라이드 주변을 따라 20-40개의 X자형 기준 마커를 에칭하여 크로스 플랫폼(예: 현미경 및 질량 분석기) 공간 등록을 가능하게 합니다.
   알림: 샘플 또는 그 영역을 둘러싼 하나의 연결된 라인이 에칭되지 않도록 주의하면 영역과 유리 슬라이드 어댑터 사이의 표면 전도성이 방해됩니다.

2. 일차 신경 세포의 준비

참고: 쥐의 해마 조직을 절개하여 파파인과 함께 개별 세포로 해리하고 저밀도로 전도성 유리 슬라이드에 증착합니다. 이러한 방식으로 세포를 분리하면 내인성 지질의 고처리량 단일 세포 질량 분석이 가능합니다.

1. 동물을 해부하기 전에 준비된 파파인 용액의 분취액을 해동하고 CO₂ 가 용기 내부의 공기를 이동시킬 수 있도록 입구 및 출구 튜브가 있는 용기에 넣습니다. 이 시스템을 37°C로 설정된 수조에 넣고 Worthington Papain Dissociation System 패키지에 포함된 pH 색상 차트를 사용하여 용액이 색상으로 표시된 대로 적절한 pH가 될 때까지 CO₂ 흐름을 계속합니다. 목표 pH는 7.2에서 7.4 사이입니다.
   알림:_CO2 를 효소 용액에 거품을 일으키지 마십시오., 이는 DNase의 변성 및 생물학적 활성의 손실을 초래할 수 있습니다. 뚜껑에 두 개의 튜브가 붙어 있는 50mL 원심분리 튜브를 사용하여 CO₂ 가 바닥에서 튜브를 채우고 상단 배출 튜브에서 빠져나갈 수 있도록 합니다.
2. 기관, 지역 및 연방 지침에 따라 IACUC 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다. 여기에서 2-3개월 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 CO₂ 질식에 의해 사용되고 희생됩니다.
3. 쥐를 얼음처럼 차갑게(4°C) mGBSS 용액으로 경심 관류하여 혈관계에서 혈액을 제거하고 동물의 몸을 빠르게 냉각시킵니다. 이 절차의 한 예는 We et ^al.18의 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.
4. 외과적으로 뇌를 쥐로부터 분리하여 관심 있는 뇌 영역이 손상되지 않도록 합니다. 이러한 분리에 대해 이전에 발표된 개요는 개별 단계⁽¹⁹)의 일부에 대한 보다 상세한 내용을 제공한다.
5. 조직 다지기 또는 조직 큐브를 사용하여 뇌의 단면(~2mm 두께)을 잘라 샘플에 영역(해마, 피질 또는 선조체)을 노출시킵니다.
6. 2mm 생검 펀치를 사용하여 관심 뇌 영역을 샘플링하고 조직 덩어리를 파파인 용액 바이알에 넣습니다.
7. 이 조직과 파파인 용액을 37°C에서 30-90분 동안 지속적인 교반(예: 전기 로커)으로 배양합니다.
   참고: 효소 처리 기간은 뇌 영역, 동물 균주, 연령 및 원하는 세포 출력(예: 말단이 있는 뉴런 및 성상세포와 말단이 없는 세포의 최대 수율)에 따라 최적화되어야 합니다. 쥐 해마 조직의 경우 60-90분이 일반적입니다. 더 짧은 처리는 일부 말단을 보존하지만 많은 세포를 해리되지 않은 클러스터에 남길 수 있는 반면, 더 긴 처리는 수율을 향상시킬 수 있지만 세포 손상을 증가시킬 수 있으므로 live/dead 분석(예: LIVE/DEAD viability/cytotoxicity kit)을 사용한 평가가 필요합니다. 비교 연구의 경우 처리는 표본 유형 간에 일관되어야 합니다.
8. 조직과 파파인이 든 바이알을 얼음 위에 올려 식히고 효소 활동을 억제합니다. P100 조절 용량 피펫에 부착된 절단 피펫 팁을 사용하여 대부분의 조직이 시각적으로 분해될 때까지 조직을 분쇄합니다. 과도한 세포 손상을 방지하기 위해 해리 중에 기포를 형성하지 마십시오.
   참고: 격렬한 분쇄는 높은 세포 수율을 초래합니다. 그러나 대부분의 프로세스를 유지하지는 않습니다. 완만한 분쇄는 세포에 더 많은 과정을 제공하지만 더 많은 해리되지 않은 세포를 생성합니다. 다양한 크기의 피펫 팁 및 기타 방법도 사용할 수 있으며 이상적인 해리 결과를 위해 최적화할 수 있습니다²⁰.
9. 해리된 세포를 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 상층액을 제거하고 1mL의 mGBSS에 펠렛을 재현탁합니다. Hoechst 33342 핵 염색제를 최종 농도 1 μg/mL로 첨가합니다.
10. 세포 현탁액 100-500μL를 에칭된 ITO 유리 슬라이드에 피펫팅하고 세포가 침전되어 슬라이드에 부착될 수 있도록 약 5분 이상 방치합니다.
    1. 세포 현탁액의 희석은 경험적으로 결정되어야 합니다. 광학 현미경을 사용하여 슬라이드에 세포 방울을 추가하여 대략적인 밀도를 측정하고 거기에서 희석하여 세포 사이에 충분한 거리(즉, MALDI 빔 크기보다 충분히 큼)가 있는지 확인합니다. 이 희석은 첫 번째 슬라이드에서 수행 할 수 있으며 후속 슬라이드에 대해 필요에 따라 희석을 조정할 수 있습니다.
11. 1) 인라인 기체 HEPA 필터가 있는 튜빙, 2) 50mL 여과 플라스크에 장착된 튜빙, 3) 피펫 팁이 부착된 두 번째 여과 플라스크 주입구에 연결된 튜빙(예: 100μL)이 포함된 진공 시스템을 사용하여 슬라이드에서 세포 현탁액을 부드럽게 흡입합니다. 나중에 사용하기 위해 도금된 세포를 보관하는 경우 흡입된 현탁액을 33% 글리세롤 용액으로 1-2분 동안 교체하고 제거합니다.
    참고: 이 단계는 셀 안정성을 보장합니다. 한쪽에서 글리세롤 용액을 분배하고 다른 쪽에서 부드럽게 흡입하는 것이 세포 구조를 유지하는 데 최적입니다. 첫 번째 샘플을 준비하는 동안 도립 현미경을 사용하여 여기에 설명된 모든 단계를 항상 육안으로 모니터링하십시오.
12. 증착 된 영역에 100-500 μL의 아세트산 암모늄을 바르고 약 1 분 동안 그대로 둔 다음 슬라이드를 청소하기 위해 흡입하십시오. 슬라이드에 소금이나 글리세롤이 없는지 확인하기 위해 필요에 따라 반복합니다.

3. 현미경 검사

참고: 침착된 세포의 위치를 결정하기 위해 각 슬라이드는 명시야/형광 현미경으로 이미지화됩니다. 형광 채널을 통해 Hoechst로 염색된 세포를 정확하게 찾을 수 있으며, 명시야 이미징은 형태학적 정보를 제공합니다. 타일 이미지 획득이 가능한 모든 현미경이 이 프로세스에 적합합니다.

1. 이전에 수행하지 않은 경우 2-3mL의 150mM 아세트산 암모늄으로 슬라이드를 헹굽니다. 이 단계는 현미경 관찰 및 MALDI 매트릭스 적용을 방해할 수 있는 글리세롤 및 염 결정을 제거하는 데 중요합니다. N₂ 의 부드러운 흐름 아래에서 드라이 슬라이드하거나 자연 건조하십시오.
2. 현미경 스테이지에 슬라이드를 로드합니다. 슬라이드 전체에 고르게 분포된 최소 10개의 지지점을 사용하여 현미경의 초점을 맞춥니다.
3. DAPI(여기: 335-383nm, 방출: 420-470nm) 및 명시야 이미징에 적합한 필터를 사용하여 전체 슬라이드에 걸쳐 5x-10x 배율로 타일식 형광 이미지를 얻어 기준 마커(1.5단계에서 생성됨)가 캡처되도록 합니다.
   참고: 일반적으로 5배 확대 정도면 충분하며, 특히 많은 슬라이드를 이미지화해야 하는 경우에는 더욱 그렇습니다. 더 미세한 세포 형태를 분석하기 위해 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용할 수 있으며, 그 대가로 이미징 시간이 2차적으로 길어지고 파일 크기가 증가합니다.
4. ZEN(Zeiss)과 같은 현미경 소프트웨어를 사용하여 타일링 이미지를 스티칭합니다. 이 단계의 오류가 최종 등록 단계로 전파되어 부정확한 대상 지정이 발생하므로 정확한 스티칭이 중요합니다. 확인하려면 수직으로 인접한 타일이 오프셋되지 않았는지 확인합니다. 또한 타일 겹침이 큰(20%-30%) 바둑판식 이미지를 가져오는 것이 좋습니다.
5. 현미경 소프트웨어에서 각 이미지를 bigTIFF 파일로 처리하고 내보냅니다. 이미지화된 영역이 상대적으로 작고 최종 이미지 크기가 2GB 미만인 경우 표준 TIFF 파일 형식을 대신 사용합니다.

4. 매트릭스 적용

참고: 일관되고 적절한 MALDI 매트릭스 적용은 고품질 단일 셀 데이터를 얻는 데 중요합니다. 상용 장치를 사용한 승화가 여기에 사용되는 반면, 매트릭스 적용은 또한 로봇 분무기⁽¹²), 에어브러시⁽²¹), 또는 수제의 승화 장치⁽²²)를 사용하여 수행될 수 있다. 우리는 단일 세포 제제가 질량 분석 이미징에 일반적으로 사용되는 얇은 조직 절편보다 더 적은 매트릭스를 필요로 한다는 것을 발견했습니다. 배치 효과를 줄이려면 한 세션 동안 연구 중인 모든 슬라이드에 매트릭스를 적용하고 가능할 때마다 다른 그룹(예: 뇌 영역 또는 치료 대 대조군)의 세포를 동일한 슬라이드에 증착하는 것이 좋습니다. 매트릭스 선택은 기존 MALDI 및 MALDI-2 단일 세포 워크플로우 모두에서 매우 중요합니다. 단일 세포 MALDI의 경우 DHB²³, 9-AA²⁴ 및 CHCA²⁵ 가 성공적으로 사용되었습니다. MALDI-2에서 당사와 다른 연구자들은 DHAP⁹에서 상당한 신호 향상을 관찰했으며, NEDC¹⁶ 및 CHCA²⁶ 과 같은 매트릭스도 효과적으로 적용되었습니다.

1. 20mg의 2,5-디하이드록시아세토페논(DHAP)을 1.5mL의 아세톤에 용해시킵니다. 승화 챔버의 홀더에 슬라이드를 놓고 승화 장치에 놓습니다.
2. 용해된 매트릭스 용액을 세라믹 웨이퍼에 피펫하고 아세톤이 증발하도록 합니다. 승화 챔버를 닫아 밀봉합니다.
3. 냉각수 챔버에 얼음물 슬러시를 채우고 챔버 위에 놓습니다.
4. 진공 청소기를 켜고 시스템이 5분 동안 평형을 이루도록 합니다. 시스템의 압력은 40mbar 미만이어야 합니다.
5. 챔버를 200°C로 5분 동안 가열하여 승화를 시작합니다.
6. 얼음물 수조를 제거하고 온도를 25°C로 높인 다음 챔버 위에 방열판을 놓습니다. 결로를 방지하기 위해 시스템을 5분 동안 실온으로 예열합니다.
   알림: 얼음물 수조를 담고 있는 용기를 비우고 뜨거운 물을 채워 방열판 역할을 할 수 있습니다.
7. 시스템을 천천히 환기시키고 챔버를 열고 슬라이드를 제거합니다.

5. 단일 세포 MALDI MS

참고: 단일 세포 MS 데이터는 오픈 소스 microMS 패키지를 사용하여 MALDI-2 timsTOF 기기(timsTOF flex)에서 획득하여 세포를 검출하고 질량 분석기를 안내합니다. 이를 위해서는 표적 세포의 광학 이미지 픽셀 위치가 질량 분석기 단계의 물리적 좌표로 변환되어야 합니다.

1. 명시야 채널과 형광 채널이 모두 있으므로 microMS를 열고 Image Group 옵션을 사용하여 bigTIFF 현미경 이미지를 데시메이트합니다.
2. Blob Options 도구를 사용하여 대상 셀에 대해 선택할 최적의 매개 변수를 식별합니다. 다음 매개 변수를 조정하십시오: 최대 및 최소 블롭 크기를 선택하여 찾을 블롭의 크기를 선택합니다. 얼룩 검출을 위해 형광 채널을 임계값하는 방법을 결정하는 임계값 설정; 그리고 원형도(circularity)는 식별된 세포가 고려를 위해 얼마나 원형이어야 하는지를 결정합니다. 여기에 제시된 데이터의 경우 다음 매개변수 값을 사용했습니다: max circularity: none; 최소 원형도 : 0.6; 임계값: 75; 최소 크기 : 20; 최대 크기: 없음.
3. Blob 찾기 옵션을 사용하여 Blob을 찾고 팝업 창을 사용하여 Blob 목록을 원하는 이름으로 저장합니다.
4. 거리 필터 도구를 사용하여 각 세포가 서로 떨어져 있어야 하는 특정 거리를 선택합니다(이 데이터의 경우 5배 형광 현미경을 사용하여 35픽셀의 거리 필터를 사용함). 이는 세포가 단일 세포 분석을 수행할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있는지 확인하기 위한 것입니다. 이 숫자는 픽셀 단위이므로 현미경이 이상적인 숫자를 결정하기 위해 픽셀에서 μm로의 변환을 알고 있어야 합니다. 레이저 프로브 직경의 크기에 약 20-30μm를 더한 값을 사용하여 등록 오류를 고려합니다.
5. MTP 슬라이드 어댑터 II를 사용하여 슬라이드를 기기에 로드합니다. microMS가 있는 컴퓨터로 돌아가서 원격 데스크톱 응용 프로그램을 사용하여 질량 분석기 컴퓨터에 액세스합니다.
6. 기기를 처음 사용하는 경우 기기의 X-Y 위치를 확인합니다. 이렇게 하려면 Tools and Instrument Settings(도구 및 계측기 설정)로 이동합니다. 팝업 창에는 X 및 Y 위치와 함께 좌표 집합이 표시됩니다. 기기의 Slide Adapter II 형상에서 이러한 특정 점을 각각 선택하고 microMS 창에서 X 및 Y 위치를 업데이트합니다.
7. 질량 분석기의 카메라 및 스테이지 컨트롤을 사용하여 슬라이드에서 쉽게 식별할 수 있는 위치로 이동하고 기기 좌표를 복사합니다. microMS에서 현미경 이미지에서 해당 위치를 찾아 해당 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 팝업 창 텍스트 위치에 좌표를 입력합니다. 모든 좌표를 가장 가까운 정수로 반올림하고 X와 Y 좌표를 공백으로 구분합니다(예: 39595 -23232).
8. 5.7단계를 반복합니다. 전체 슬라이드에 걸쳐 최소 12개의 기준 마커를 등록합니다. 세 개의 등록 포인트가 추가되면 원 중 하나가 빨간색으로 바뀌어 등록에서 가장 벗어난 위치임을 나타냅니다. 이 경우 Shift + 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 현재 등록 포인트를 삭제하고 다시 시도하십시오.
9. File(파일)에서 Save(저장)로 이동한 다음 Registration(등록)으로 이동하여 등록(.msreg) 파일을 저장합니다.
10. 슬라이드에 블롭이 표시된 상태에서 File, Save, Instrument Positions로 이동하여 측량기 위치(.xeo) 파일을 저장합니다. 원격 데스크톱 소프트웨어를 사용하여 이 .xeo 파일을 기기 컴퓨터로 전송합니다.
11. 생성된 사용자 정의 .xeo 파일의 텍스트를 기기의 MTP Slide Adapter II .xeo 파일로 복사하고 저장합니다. 이렇게 하면 이 지오메트리 파일이 셀의 위치로 업데이트됩니다.
12. 자동화 탭을 클릭하고 새로 만들기...를 선택하여 자동 실행을 시작합니다. 표시된 샘플 영역을 드래그하여 셀을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 분석 목록에 추가합니다. 자동화 실행을 저장하고 Start Automatic Run(자동 실행 시작)을 클릭하여 획득을 시작합니다. 실행 시간은 세포 수, 레이저 샷 및 레이저 주파수를 포함한 다양한 요인에 따라 다르지만 일반적으로 MALDI 모드(10kHz 레이저 반복률)에서 약 5-10개의 셀을 분석할 수 있으며 MALDI-2 모드(1k Hz 레이저 반복률)에서 초당 1-5개의 셀을 분석할 수 있습니다.

6. 데이터 처리

참고: 기존 상용 소프트웨어 패키지는 고처리량 단일 세포 질량 분석 데이터를 분석하는 데 적합하지 않습니다. 개별 스펙트럼을 시각화할 수 있지만 의미 있는 생물학적 통찰력을 추출하려면 특수 도구가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 단일 세포 MALDI-2 MS 데이터 분석을 용이하게 하는 무료로 사용 가능한 소프트웨어를 제공합니다. 업데이트된 워크플로우는 단일 셀 데이터를 오픈 소스 imzML 형식²⁷로 직접 변환할 수 있도록 하여 SCiLS MVS 및 기타 공급업체 소프트웨어와의 호환성을 허용합니다. 고급 데이터 분석을 위해 전체 스크립트에는 Matplotlib(버전 3.7.3)에서 사용할 수 있는 지질 주석, 클러스터링 및 기타 시각화 도구에 대한 기능도 포함되어 있습니다. 원시 데이터의 파싱 및 읽기는 TIMSCONVERT 워크플로우²⁸에 포함된 함수 세트인 pyTDFSDK 라이브러리에 의해 촉진됩니다.

1. Supplementary File 1에 제공된 파일을 Jupyter Notebook과 동일한 작업 경로에 복사하여 사용자 지정 Python 라이브러리 SC_MALDI2_Analysis 초기화한 다음 첫 번째 코드 셀의 키보드에서 Shift + Enter를 누릅니다. 이렇게 하면 나중에 이러한 함수를 호출하여 데이터를 처리하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 수집된 데이터(Bruker .d 파일)의 경로를 복사합니다. 나중에 이러한 파일 경로를 구문 분석하여 각 샘플에 대한 메타데이터를 설정할 수 있도록 각 파일의 폴더와 이름을 설명적으로 지정하는 것이 좋습니다. Bruker .d 파일 가져오기 를 실행하고 목록 코드 셀에 저장합니다. 그러면 로드된 .d 파일의 총 수가 출력됩니다.
3. Processing the raw data and saving to imzML이라는 제목의 코드 셀을 실행합니다. 이렇게 하면 제공된 각 Bruker .d 파일을 읽고, 데이터에 대한 피크 피킹을 수행한 다음, 각 피크 주변의 20ppm의 데이터를 .d 파일 내부에 작성된 .imzML 파일에 저장합니다.
   1. 저장된 데이터를 찾으려면 첫 번째 .d 파일의 위치를 열면 imzML 및 기타 메타데이터가 이 경로에 저장됩니다. 이 단계에서 저장된 imzML 파일을 SCiLS Lab MVS와 같은 공급업체 소프트웨어로 가져올 수 있습니다. 고급 데이터 분석을 위해 스크립트를 계속 따르십시오.
4. 이전에 저장된 imzML 파일 코드 셀에서 Loading을 실행하여 저장된 imzML 데이터를 로드합니다. 이렇게 하면 저장된 데이터가 변수 data에 로드됩니다.
5. 데이터 범주화 및 데이터 저장 매트릭스 셀을 실행하여 공통 m/z 축을 따라 모든 데이터를 범주화하고, 낮은 존재비(<0.1%)에 있는 기능을 제거하고, 노이즈(100 상대 강도)보다 작은 값을 제거합니다. 그런 다음 이 함수는 각 Bin 내의 각 피크 m/z 값의 평균을 구하여 데이터를 다시 구간화합니다. 결과 데이터 행렬은 datacube_array로 저장되고, 행렬과 연결된 m/z bin은 valid_mz_bins로 저장되며, 각 bin의 개수는 count로 저장됩니다.
6. 데이터에 주석을 달려면 Exporting peaks for LIPID MAPS 주석 셀을 실행합니다. 이렇게 하면 데이터 매트릭스 내의 모든 m/z 피크가 클립보드에 복사됩니다. 이것을 빈 텍스트 파일에 붙여넣고 저장하여 LIPID MAPS에 업로드하십시오.
7. lipidmaps.org 연 다음 MS Data Bulk Search 및 Search LMSD 를 선택하여 생물학적으로 관련된 지질 종을 검색합니다. 텍스트 파일을 선택하여 피크 목록을 업로드하고 적절한 부가물(예: [M+H]+, [M+Na]⁺ 및 [M+K]⁺)을 선택합니다. 질량분석기에 적합한 질량 허용 오차를 선택하고(+/- 0.01m/z를 선택함) 관심 있는 모든 지질 등급을 선택한 다음 검색을 누르십시오. .tsv 파일을 다운로드합니다.
8. 메타데이터 셀에 대한 단일 셀 경로에서 Loading을 실행하여 스펙트럼 메타데이터를 로드합니다. 파일 경로 구조에 따라 여기에서 분할 코드를 변경합니다.
9. Data Preprocessing 및 Lipid Annotation 셀을 실행하여 데이터를 전처리합니다. 이렇게 하면 lipidMAPS tsv 파일을 사용하여 데이터 세트에 10ppm 오류로 주석을 달고, lipidMAPS 결과에서 홀수 사슬 지질을 제거하고, 나머지 데이터를 정규화하고, 특정 임계값을 통과하지 않는 특징 또는 세포를 제거합니다. 이렇게 하면 새로 처리된 데이터 세트가 data2로 저장되고 업데이트된 스펙트럼 메타데이터가 updated_cell_types로 저장됩니다.
10. 데이터 분석은 scanpy에 의해 수행됩니다. 단일 세포에 대한 UMAP 및 클러스터링 분석을 실행하여 관심 있는 데이터를 선택하고(여기서는 MALDI-2, M2 데이터만 선택함) 데이터 세트를 스케일링한 다음 쉽게 분석할 수 있도록 scanpy AnnData 개체에 로드합니다.
    참고: 여기서는 데이터 세트에 대해 Leiden 클러스터링 및 차원 축소(UMAP)를 수행하고, 원본 데이터 클래스와 UMAP의 클러스터를 모두 시각화하고, 클러스터 중에서 통계적으로 가장 유의한 기능 중 일부를 scanpy의 rank_genes_groups_dotplot 함수를 사용하여 요약했습니다.

형광 유도 단일 세포 MALDI-2 MS의 워크플로우 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, 표적 뇌 영역(그림 1A)에서 절개된 조직을 단일 세포로 해리하고 전도성 ITO 코팅된 현미경 슬라이드(그림 1B)에 증착합니다. 세포의 위치는 전체 슬라이드 형광 이미징(그림 1C)에 의해 결정된 후 MALDI 매트릭스 적용(그림 1D), microMS 지원 MALDI-2 MS 분석(그림 1E) 및 데이터 분석(그림 1F)에 의해 결정됩니다. 이 워크플로우를 사용하면 개별 세포 내에서 10ppm 미만의 질량 정확도로 추정되는 수십 개에서 수백 개의 지질을 식별할 수 있습니다(MALDI-2 timsTOF 사용).

질량 분석 이미징은 세포 준비 및 매트릭스 응용 분야의 품질을 평가하기 위해 작은 관심 영역에서 수행할 수 있습니다. 분산된 세포의 MALDI-2 이미징의 대표적인 결과가 그림 2A에 나와 있습니다. 이 이미지에서 사용자는 동일한 영역의 현미경 사진과 비교하여 분석물 확산 정도를 평가할 수 있습니다. 확산 정도에 따라 분석가는 레이저 빔 필드 크기와 거리 필터의 크기를 조정하여 진정한 단일 세포 획득을 보장할 수 있습니다. 단일 세포 MSI에서는 세포 해상도(1-5μm)를 얻기 위해 작은 레이저 크기와 래스터 너비를 사용하는 반면, 마이크로MS에는 더 큰 레이저 크기를 사용하여 이미징에 비해 신호 강도와 검출 가능한 지질의 수를 증가시킬 수 있습니다. MALDI-2로 얻은 신호 향상의 대표적인 결과는 그림 2B에 나와 있습니다. 콜레스테롤, PE 및 PC 종의 향상은 이전 문헌과 일치하는 것으로 관찰되었다¹⁴. 일반적으로 상대적으로 높은 레이저 출력(>50%)과 더 적은 수의 샷(약 10-200)을 사용할 때 최상의 MALDI-2 신호 향상을 얻습니다. 레이저 출력이 너무 낮으면 향상되지 않고 레이저 에너지가 너무 많으면 과도한 분석물 단편화가 발생하기 때문에 약간의 최적화가 필요합니다²⁹. 단일 세포 분석의 경우, 공간 정합은 개별 세포의 정확한 표적화를 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 정합을 검증하기 위해 알려진 지점에 블롭을 생성하고 microMS를 통해 기기 좌표를 내보내 슬라이드 주변에 작은 테스트 포인트 세트(~5)를 생성할 수 있습니다. 이러한 테스트 스폿을 선택했을 때 기기 스테이지를 올바르게 배치하는지 확인하면 후속 세포 표적화가 정확해질 수 있습니다.

MALDI MS를 사용하면 개별 뇌 영역 간 및 개별 영역 내의 세포 이질성을 프로파일링할 수 있습니다(그림 3). 차원 축소 기법은 지질 프로파일의 변동을 분석함으로써 세포를 별개의 클러스터로 효과적으로 분리하여 데이터 세트 전반에 걸쳐 지질 조성의 다양성을 강조합니다(그림 3A). 또한, 라이덴(Leiden) 클러스터링과 같은 클러스터링 기술의 적용은 선조체(striatum)와 피질(cortex)을 포함한 특정 뇌 영역 내에 세포의 고유한 하위 집단(subpopulation)이 존재함을 보여줍니다(그림 3B). 또한 각 클러스터의 지질 프로필을 서로 비교하여(그림 3C) 특정 지질을 마커로 사용하여 클러스터 특이적 동일성을 정의할 수 있습니다. 여러 지질 종은 특정 클러스터에서 현저하게 상향 또는 하향 조절되어 뚜렷한 기능적 역할 또는 상태를 암시하는 반면, 다른 종은 클러스터 간에 공유되지만 상대적인 신호 강도가 다릅니다. 강력한 다운스트림 데이터 분석을 보장하려면 대부분의 세포에서 신뢰할 수 있는 지질 검출을 달성하고 잠재적인 배치 효과를 평가하는 것이 필수적입니다. 그림 3D 는 별도의 ITO 코팅 슬라이드에 분산되어 있는 6개의 개별 피질 세포의 대표 스펙트럼을 보여줍니다. 개별 지질 프로필은 이질성을 나타내지만 지질은 모든 인수에서 일관되게 검출됩니다. 그림 3E 는 동일한 조건에서 준비 및 분석된 서로 다른 슬라이드의 피질 세포의 UMAP을 보여줍니다. 슬라이드 사이의 세포가 실질적으로 겹친다는 것은 배치 효과가 생물학적 해석에 큰 혼란을 일으키지 않는다는 것을 나타냅니다. 필요한 경우 ComBat³⁰ 과 같은 배치 보정 알고리즘을 적용하여 잔류 효과를 완화할 수 있습니다. 요약하면, 단일 세포 MALDI-2는 지질 바이오마커 식별을 위한 첨단 기술로, 세포 하위 집단에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 뇌의 지역 및 기능적 다양성에 대한 이해를 향상시킵니다.

그림 1: scMALDI-2 MS의 일반 워크플로우 (A) 수동 조직 해부 및 뇌 영역 분리. (B) 파파인(Papain)이 조직을 단세포로 해리하고 전도성 ITO 코팅된 슬라이드에 세포를 증착합니다. (C) 핵 염색을 통한 전체 슬라이드 형광 현미경 검사(DAPI/Hoechst). (D) 샘플 슬라이드에 MALDI 매트릭스(DHAP) 승화. (E) 이미지 유도 단일 셀 MALDI-2 MS 측정. (F) 차원 축소, 클러스터링 및 통계 분석을 포함한 포괄적인 데이터 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 단일 세포 분석을 위한 MALDI-2 MS 최적화 및 이미징. (A) 일차 세포의 분산된 집단에 대한 MALDI-2 MSI 이미징. 화살표는 몇 개의 개별 셀을 나타냅니다. MSI와 작은 영역을 수행하면 분석가가 분석법 매개변수를 최적화하고 샘플 품질을 평가할 수 있습니다. (B) MALDI-2 및 MALDI MS 획득을 사용하여 얻은 결과 비교. 콜레스테롤, DAG(디아실글리세롤), PC(포스파티딜콜린) 및 PE(포스파티딜에탄올아민)를 포함한 다양한 지질의 신호 향상(MALDI 2 vs MALDI)은 MALDI-2 스펙트럼(위) 및 MALDI 스펙트럼(아래)을 보여줌으로써 강조되고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 뇌 기원 영역별로 착색된 분석된 세포의 MALDI-2 MS. (A) UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 분석에 의한 3개의 설치류 뇌 영역 내 단일 세포 지질 프로파일링. (B) 라이덴 클러스터링(Leiden clustering)을 거친 후 동일한 세포에 대한 UMAP 분석, 여기서 클러스터는 유사한 지질 조성을 가진 세포의 하위 집단에 해당합니다. 여기서 색상은 다양한 Leiden 데이터 클러스터를 보여줍니다. (C) 클러스터 간의 서로 다른 지질에 대한 강도 분포의 차이를 보여주는 바이올린 플롯. (D) 6개의 대표적인 개별 피질 세포의 스펙트럼을 2개의 개별 슬라이드에서 분석했습니다. (E) 두 개의 개별 슬라이드에서 분석된 피질 세포의 UMAP 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: SC-MALDI2_Analysis.py. 이 파일에는 단일 셀 MALDI-2 질량 분석 데이터를 처리하기 위해 개발된 일련의 기능이 포함되어 있습니다. 여기에는 원시 질량 분석 데이터를 읽고, 비닝을 수행하고, 주석 및 다운스트림 분석을 수행하는 방법이 포함됩니다. 로드하고 모든 데이터 전처리 및 분석을 수행하기 위한 셀 세트는 보충 파일 2에 제공됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: JOVE Analysis.ipynb. 이 파일에는 SC-MALDI2_Analysis.py의 사용자 지정 Python 함수에 로드하고 언급된 모든 데이터 전처리 및 분석을 수행할 셀 집합이 포함된 Jupyter Notebook이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

고처리량, 이미지 유도 단일 세포 MALDI MS는 단일 세포 규모에서 화학적 이질성을 이해하는 데 유용한 도구입니다. MALDI-2(laser-induced post-ionization)를 추가하면 더 깊은 분석물 커버리지를 얻을 수 있으며, 이는 분리된 포유류 세포와 같이 질량 및 부피가 제한된 샘플에 매우 중요합니다.

발표된 단세포 지질 및 대사산물 MS 워크플로우의 압도적 다수는 배양된 세포를 사용하지만, 당사의 접근 방식은 상대적으로 빠르게 분리되는 일차 세포에 적용됩니다. 배양된 세포는 배양 후 단 며칠 만에 대사 산물 및 지질 함량의 명백한 변화를 보여주기 때문에 이러한 구분은 매우 중요합니다^23,31. 대부분의 경우 효소 세포 분리는 축삭돌기, 수상돌기 및 성상세포 돌기와 같은 미세한 세포 구조의 손실로 이어집니다. 따라서 관찰된 분석물 신호는 주로 cell soma에서 얻습니다. 그럼에도 불구하고, 세포^{유형 4} 및 뇌 영역별 성공적인 분류는 달성된다¹². 이는 서로 다른 세포에 고유한 많은 지질이 체내에 위치하고 있음을 시사합니다.

MALDI 매트릭스 응용 방법의 작은 차이는 결과 분석물 신호에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 상용 장치를 사용한 재현 가능한 매트릭스 승화를 기반으로 하는 워크플로우를 제시했으며, 이는 균일한 매트릭스 층, 높은 신호 대 잡음비 및 제한된 분석물 확산을 생성합니다. 그러나 로봇 분무기 또는 아티스트의 에어 브러시를 사용하는 매트릭스 응용 프로그램은 다른 접근 방식 중에서 사용할 수 있습니다. 접근법에 관계없이, 광학 매트릭스 대 분석물 비율을 달성하기 위해 표준 조직 MSI에 사용되는 것과 비교하여 단일 세포 제제에 더 낮은 매트릭스 밀도를 적용해야 합니다. 여기에 적용된 매트릭스 밀도는 조직 MSI에 사용되는 밀도의 약 절반입니다. 물론 이는 셀당 매트릭스의 양이 MSI보다 많다는 것을 의미하며, 이는 여기에 사용된 분리된 셀 접근 방식에서 향상된 분석물 추출 및 검출에 기여하는 데 도움이 됩니다.

상당한 최적화가 필요한 샘플의 경우, 그림 2A에서 볼 수 있듯이 단일 세포 해리의 작은 ROI에서 MSI를 수행하는 것이 최적화 프로세스의 일부로 수행될 수 있습니다. 또한 이 단계를 통해 분석가는 용매 기반 매트릭스 응용 접근법에서 분석물이 확산되는 정도를 평가할 수 있습니다.

단일 세포의 성공적인 이미지 유도 MALDI를 위해서는 고품질 형광 이미지, 재현 가능한 매트릭스 응용 분야 및 정밀한 스테이지 제어가 필요합니다. 이러한 실험은 더 큰 이미징 영역과 더 높은 분석물 수로 인해 경미한 등록 오류와 매트릭스 및 샘플 조건의 변동성을 허용하는 표준 MSI 워크플로우보다 더 까다롭습니다. 이러한 어려움에도 불구하고 당사는 기존 MALDI를 사용하여 단일 소기관을 성공적으로 표적으로 삼았습니다.

타일형 형광 이미지의 정확한 스티칭은 작은 오류가 복합적으로 발생하여 스테이지 제어에 영향을 미칠 수 있으므로 정합 정확도가 매우 중요합니다. 배치 효과(Batch effect)는 또한 동일한 슬라이드, 슬라이드 사이 및 제제 전반에 걸쳐 관찰되는 신호 변화와 함께 주요 문제를 제시합니다. 내부 표준물질 및 사분위수 정규화의 사용을 포함한 적절한 정규화 전략은 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 됩니다. 또한 ComBat³⁰ 과 같은 배치 보정 알고리즘을 사용하여 기술적 변동성을 줄이고 실제 생물학적 차이를 향상시킬 수 있습니다.

단일 세포에서 신뢰할 수 있는 분자 주석을 얻는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 종종, 물질의 양과 검출 민감도는 가장 풍부한 종을 제외한 모든 종의 탠덤 MS에 충분하지 않습니다. 개별 세포에서 직접 탠덤 MS를 검출할 수 없는 경우, 분석물 라이브러리를 생성하는 대체 접근법을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 조직 내 탠덤 MS 데이터는 동일한 뇌 영역과 세포 집단을 생성하는 데 사용되는 동물의 얇은 냉동 절편에서 얻을 수 있습니다. 조직에서 지질을 추출한 후 LC-MS를 사용하는 방법도 사용할 수 있습니다. 시료 전처리 전략과 MS 기술이 계속 개선됨에 따라 단일 세포에서 직접 관련 구조 정보를 얻을 수 있는 경우가 점점 더 많아지고 있습니다. 미래에는 이 워크플로우가 확장되어 단일 세포에서 탠덤 MS 데이터를 얻을 수 있게 되어 보조 LC-MS/MS 실험의 필요성이 없어질 것으로 예상됩니다. 우리는 또한 이 접근 방식이 고유한 세포 유형, 포유류 소기관, 분말 및 미세 플라스틱을 포함하여 생물학 및 그 이상의 미시적 규모의 수많은 샘플로 확장될 수 있을 것으로 예상합니다.

저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.

S.W.C는 Peixin He and Xiaoming Chen PhD4 펠로우십과 University of Illinois Block Grant Fellowship의 지원에 감사를 표합니다. 이 작업은 또한 National Institute on Drug Abuse의 지원을 받았습니다. P30DA018310, National Institute on Aging(국립 노화 연구소)에서 수상 번호. R01AG078797, 그리고 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 소장실(Office of The Director)에 의해 수상 번호 S10OD032242.