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* 이 저자들은 동등하게 기여했습니다
이 프로토콜은 형광 유도 단일 세포 MALDI-2 질량 분석법에 microMS를 사용하여 1차 쥐 신경 세포의 분자 프로파일링을 향상시키는 방법을 설명합니다.
단세포 측정은 뇌의 풍부한 시공간화학적 이질성을 이해하는 데 매우 중요합니다. MALDI(Matrix-assisted laser/desorption ionization) 질량분석법(MS)은 개별 세포의 내인성 분자에 대한 표지 없는 고처리량 특성화가 가능합니다. 최근 레이저 유도 후 이온화(MALDI-2)를 통한 MALDI 질량 분석기 개발의 발전으로 다양한 지질 및 기타 저분자에 대한 검출 감도가 크게 향상되었습니다. 그러나 세포 분해능에서 MALDI-2를 사용한 대형 샘플의 MS 이미징은 대부분의 응용 분야에서 엄청나게 느립니다. 이 프로토콜에서는 일차 세포가 분리되어 전도성 슬라이드에 분산됩니다. 상대적인 세포 위치는 전체 슬라이드 형광 현미경 검사에 의해 결정된 후 현미경 검사 좌표를 MALDI-2 질량 분석기의 스테이지 좌표에 정확하게 일치시킵니다. 세포 위치만 대상으로 하는 표적 MS 분석은 전체 시료의 MS 이미징에 비해 분석물 커버리지가 높고 데이터 크기가 줄어든 고처리량 단일 세포 측정을 제공합니다. 단일 세포 준비, 전체 슬라이드 형광 이미징, 매트릭스 응용 분야 및 MALDI-2 질량 분석법에 필요한 중요한 단계를 설명합니다.
지질과 대사 산물은 세포 기능의 기본이며 막, 에너지원 및 신호 분자의 필수 구성 요소로 작용합니다 1,2. 그러나 이들의 구성과 풍부도는 개별 세포마다 크게 다를 수 있으며, 이는 세포 유형과 발달 및 기능 상태의 차이를 반영합니다 3,4,5. 이러한 차이를 분석하는 것은 생물학적 다양성을 이해하고 뚜렷한 세포 하위 집단을 식별하는 데 중요합니다. RNA 염기서열분석(sequencing)과 같은 단일 세포 측정 기법은 유용한 세포 특이적 전사체 프로파일을 제공합니다6. 그러나 이러한 전사체 수준 측정은 유전자 발현이 이러한 분석물의 실제 풍부함과 항상 상관관계가 있는 것은 아니기 때문에 지질 및 대사 산물의 실제 세포 양을 직접 반영하지는 않습니다. 따라서 지질과 대사 산물을 직접 측정하기 위한 특수 방법은 단일 세포와 그 집단의 화학적 조성을 종합적으로 분석하기 위해 필요합니다.
MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization) 질량 분석 이미징(MSI)은 in situ 7,8 내인성 생체 분자의 무표지 공간 매핑을 위해 선택되는 도구입니다. 일반적으로 MALDI의 경우 UV 레이저를 사용하여 유기 매트릭스와 공동 결정화된 얇은 샘플 층에서 물질을 제거하여 이온과 중성 분자의 기둥을 형성합니다. 그런 다음 형성된 이온은 MS 분석기로 분리되어 질량 분석기 내에서 검출됩니다. 최신 질량 분석기 스테이지의 정확한 위치를 감안할 때 레이저는 특정 샘플 영역을 대상으로 배치하거나 여러 영역에 걸쳐 래스터화하여 MSI에 의해 분자 이미지를 생성할 수 있습니다. 집중된 레이저 빔과 정확한 스테이지 이동으로 달성된 세포 또는 세포 내 공간 해상도(< 10μm)에서 MSI를 사용하여 개별 세포에 대한 화학 정보를 얻을 수 있습니다 9,10. 그러나 이 규모에서의 MSI 측정은 특히 표적 세포 밀도가 낮은 샘플의 경우 세포 사이의 빈 영역을 이미징하는 데 소요되는 시간으로 인해 비효율적입니다. 또한, 많은 분석물의 검출 가능성은 샘플링되는 부피가 적기 때문에 제한적입니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 당사는 고처리량 단일 세포 분석을 위한 이미지 유도 MALDI MS 접근법을 개발했습니다11,12. 이 접근 방식에서는 분산된 세포의 위치를 전체 슬라이드 형광 이미지에서 프로그래밍 방식으로 결정하고 질량 분석기 단계를 특정 매개변수(예: 크기 및 모양)를 가진 개별 세포가 있는 위치로 안내한 다음 MALDI 레이저를 사용한 방사선 조사를 통해 분석하는 데 사용됩니다. 이 표적 접근법을 사용하는 이전 연구는 이질적인 세포 집단에서 지질, 펩티드 및 기타 생체 분자를 특성화하는 데 사용되었습니다 5,13.
단일 세포의 질량 제한 특성을 감안할 때 이러한 샘플에서 검출된 분석물의 수는 일반적으로 조직에서 직접 관찰된 것보다 적습니다. 따라서 단일 세포 MS 분석에서 분석물 커버리지를 늘리려면 분석물 검출 감도를 높이는 것이 중요합니다. 이 검출 문제를 극복하는 데 도움이 되는 최근에 개발된 접근 방식 중 하나는 레이저 사후 이온화(MALDI-2)를 사용하는 MALDI로, 광범위한 분석물에 대한 감도를 향상시키는 것으로 나타났습니다 9,14,15,16. 그 결과, MALDI-2는 보다 포괄적인 단일 세포 데이터 세트를 생성하고 분리된 세포와 같이 질량이 제한된 샘플에서 더 깊은 분자 범위를 제공합니다.
이 방법의 목표는 수천 개의 개별 세포에서 지질 측정값을 얻는 것입니다. 이를 위해 고처리량 단일 세포 MALDI-2 질량 분석법을 가능하게 하고 일반적으로 정밀한 스테이지 제어를 통해 모든 프로브 기반 질량 분석 방식으로 확장할 수 있는 워크플로우를 설명합니다17. 이 워크플로우에서는 관심 있는 뇌 영역의 조직을 절개하고 파파인 해리 절차 후 조직에서 개별 세포를 얻습니다. 그런 다음 세포는 핵 염색으로 표지되고 기준점 마커가 에칭된 전도성 유리 슬라이드에 분산되어 접착될 수 있습니다. 다음으로, 형광 현미경을 사용하여 전체 슬라이드 이미지를 촬영합니다. 매트릭스는 승화에 의해 증착되어 단일 세포 MS 분석을 위해 반복 가능한 균질한 결정층과 높은 신호 대 잡음비를 생성합니다. 오픈 소스 소프트웨어인 microMS11을 사용하여 현미경 이미지에서 세포 위치의 상대 좌표를 매핑하고 세포가 증착된 유리 슬라이드에 새겨진 기준 마커를 사용하여 포인트 세트 등록에 의해 질량 분석기 스테이지 좌표와 정렬됩니다. 마지막으로, 이 정보를 사용하여 각 개별 세포에서 정밀한 표적 MS 스펙트럼을 획득하여 단일 실행(<1시간)으로 수천 개의 세포를 프로파일링할 수 있습니다12,13.
이 연구의 모든 동물 실험은 일리노이 제도 동물 관리 및 사용 위원회(23228)에서 승인한 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었으며 동물의 윤리적 대우 및 관리에 대한 국가 및 ARRIVE 표준을 엄격하게 준수합니다.
1. 재료 및 용액 준비
2. 일차 신경 세포의 준비
참고: 쥐의 해마 조직을 절개하여 파파인과 함께 개별 세포로 해리하고 저밀도로 전도성 유리 슬라이드에 증착합니다. 이러한 방식으로 세포를 분리하면 내인성 지질의 고처리량 단일 세포 질량 분석이 가능합니다.
3. 현미경 검사
참고: 침착된 세포의 위치를 결정하기 위해 각 슬라이드는 명시야/형광 현미경으로 이미지화됩니다. 형광 채널을 통해 Hoechst로 염색된 세포를 정확하게 찾을 수 있으며, 명시야 이미징은 형태학적 정보를 제공합니다. 타일 이미지 획득이 가능한 모든 현미경이 이 프로세스에 적합합니다.
4. 매트릭스 적용
참고: 일관되고 적절한 MALDI 매트릭스 적용은 고품질 단일 셀 데이터를 얻는 데 중요합니다. 상용 장치를 사용한 승화가 여기에 사용되는 반면, 매트릭스 적용은 또한 로봇 분무기(12), 에어브러시(21), 또는 수제의 승화 장치(22)를 사용하여 수행될 수 있다. 우리는 단일 세포 제제가 질량 분석 이미징에 일반적으로 사용되는 얇은 조직 절편보다 더 적은 매트릭스를 필요로 한다는 것을 발견했습니다. 배치 효과를 줄이려면 한 세션 동안 연구 중인 모든 슬라이드에 매트릭스를 적용하고 가능할 때마다 다른 그룹(예: 뇌 영역 또는 치료 대 대조군)의 세포를 동일한 슬라이드에 증착하는 것이 좋습니다. 매트릭스 선택은 기존 MALDI 및 MALDI-2 단일 세포 워크플로우 모두에서 매우 중요합니다. 단일 세포 MALDI의 경우 DHB23, 9-AA24 및 CHCA25 가 성공적으로 사용되었습니다. MALDI-2에서 당사와 다른 연구자들은 DHAP9에서 상당한 신호 향상을 관찰했으며, NEDC16 및 CHCA26 과 같은 매트릭스도 효과적으로 적용되었습니다.
5. 단일 세포 MALDI MS
참고: 단일 세포 MS 데이터는 오픈 소스 microMS 패키지를 사용하여 MALDI-2 timsTOF 기기(timsTOF flex)에서 획득하여 세포를 검출하고 질량 분석기를 안내합니다. 이를 위해서는 표적 세포의 광학 이미지 픽셀 위치가 질량 분석기 단계의 물리적 좌표로 변환되어야 합니다.
6. 데이터 처리
참고: 기존 상용 소프트웨어 패키지는 고처리량 단일 세포 질량 분석 데이터를 분석하는 데 적합하지 않습니다. 개별 스펙트럼을 시각화할 수 있지만 의미 있는 생물학적 통찰력을 추출하려면 특수 도구가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 단일 세포 MALDI-2 MS 데이터 분석을 용이하게 하는 무료로 사용 가능한 소프트웨어를 제공합니다. 업데이트된 워크플로우는 단일 셀 데이터를 오픈 소스 imzML 형식27로 직접 변환할 수 있도록 하여 SCiLS MVS 및 기타 공급업체 소프트웨어와의 호환성을 허용합니다. 고급 데이터 분석을 위해 전체 스크립트에는 Matplotlib(버전 3.7.3)에서 사용할 수 있는 지질 주석, 클러스터링 및 기타 시각화 도구에 대한 기능도 포함되어 있습니다. 원시 데이터의 파싱 및 읽기는 TIMSCONVERT 워크플로우28에 포함된 함수 세트인 pyTDFSDK 라이브러리에 의해 촉진됩니다.
형광 유도 단일 세포 MALDI-2 MS의 워크플로우 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 먼저, 표적 뇌 영역(그림 1A)에서 절개된 조직을 단일 세포로 해리하고 전도성 ITO 코팅된 현미경 슬라이드(그림 1B)에 증착합니다. 세포의 위치는 전체 슬라이드 형광 이미징(그림 1C)에 의해 결정된 후 MALDI 매트릭스 적용(그림 1D), microMS 지원 MALDI-2 MS 분석(그림 1E) 및 데이터 분석(그림 1F)에 의해 결정됩니다. 이 워크플로우를 사용하면 개별 세포 내에서 10ppm 미만의 질량 정확도로 추정되는 수십 개에서 수백 개의 지질을 식별할 수 있습니다(MALDI-2 timsTOF 사용).
질량 분석 이미징은 세포 준비 및 매트릭스 응용 분야의 품질을 평가하기 위해 작은 관심 영역에서 수행할 수 있습니다. 분산된 세포의 MALDI-2 이미징의 대표적인 결과가 그림 2A에 나와 있습니다. 이 이미지에서 사용자는 동일한 영역의 현미경 사진과 비교하여 분석물 확산 정도를 평가할 수 있습니다. 확산 정도에 따라 분석가는 레이저 빔 필드 크기와 거리 필터의 크기를 조정하여 진정한 단일 세포 획득을 보장할 수 있습니다. 단일 세포 MSI에서는 세포 해상도(1-5μm)를 얻기 위해 작은 레이저 크기와 래스터 너비를 사용하는 반면, 마이크로MS에는 더 큰 레이저 크기를 사용하여 이미징에 비해 신호 강도와 검출 가능한 지질의 수를 증가시킬 수 있습니다. MALDI-2로 얻은 신호 향상의 대표적인 결과는 그림 2B에 나와 있습니다. 콜레스테롤, PE 및 PC 종의 향상은 이전 문헌과 일치하는 것으로 관찰되었다14. 일반적으로 상대적으로 높은 레이저 출력(>50%)과 더 적은 수의 샷(약 10-200)을 사용할 때 최상의 MALDI-2 신호 향상을 얻습니다. 레이저 출력이 너무 낮으면 향상되지 않고 레이저 에너지가 너무 많으면 과도한 분석물 단편화가 발생하기 때문에 약간의 최적화가 필요합니다29. 단일 세포 분석의 경우, 공간 정합은 개별 세포의 정확한 표적화를 보장하기 위한 중요한 단계입니다. 정합을 검증하기 위해 알려진 지점에 블롭을 생성하고 microMS를 통해 기기 좌표를 내보내 슬라이드 주변에 작은 테스트 포인트 세트(~5)를 생성할 수 있습니다. 이러한 테스트 스폿을 선택했을 때 기기 스테이지를 올바르게 배치하는지 확인하면 후속 세포 표적화가 정확해질 수 있습니다.
MALDI MS를 사용하면 개별 뇌 영역 간 및 개별 영역 내의 세포 이질성을 프로파일링할 수 있습니다(그림 3). 차원 축소 기법은 지질 프로파일의 변동을 분석함으로써 세포를 별개의 클러스터로 효과적으로 분리하여 데이터 세트 전반에 걸쳐 지질 조성의 다양성을 강조합니다(그림 3A). 또한, 라이덴(Leiden) 클러스터링과 같은 클러스터링 기술의 적용은 선조체(striatum)와 피질(cortex)을 포함한 특정 뇌 영역 내에 세포의 고유한 하위 집단(subpopulation)이 존재함을 보여줍니다(그림 3B). 또한 각 클러스터의 지질 프로필을 서로 비교하여(그림 3C) 특정 지질을 마커로 사용하여 클러스터 특이적 동일성을 정의할 수 있습니다. 여러 지질 종은 특정 클러스터에서 현저하게 상향 또는 하향 조절되어 뚜렷한 기능적 역할 또는 상태를 암시하는 반면, 다른 종은 클러스터 간에 공유되지만 상대적인 신호 강도가 다릅니다. 강력한 다운스트림 데이터 분석을 보장하려면 대부분의 세포에서 신뢰할 수 있는 지질 검출을 달성하고 잠재적인 배치 효과를 평가하는 것이 필수적입니다. 그림 3D 는 별도의 ITO 코팅 슬라이드에 분산되어 있는 6개의 개별 피질 세포의 대표 스펙트럼을 보여줍니다. 개별 지질 프로필은 이질성을 나타내지만 지질은 모든 인수에서 일관되게 검출됩니다. 그림 3E 는 동일한 조건에서 준비 및 분석된 서로 다른 슬라이드의 피질 세포의 UMAP을 보여줍니다. 슬라이드 사이의 세포가 실질적으로 겹친다는 것은 배치 효과가 생물학적 해석에 큰 혼란을 일으키지 않는다는 것을 나타냅니다. 필요한 경우 ComBat30 과 같은 배치 보정 알고리즘을 적용하여 잔류 효과를 완화할 수 있습니다. 요약하면, 단일 세포 MALDI-2는 지질 바이오마커 식별을 위한 첨단 기술로, 세포 하위 집단에 대한 중요한 통찰력을 제공하고 뇌의 지역 및 기능적 다양성에 대한 이해를 향상시킵니다.
그림 1: scMALDI-2 MS의 일반 워크플로우 (A) 수동 조직 해부 및 뇌 영역 분리. (B) 파파인(Papain)이 조직을 단세포로 해리하고 전도성 ITO 코팅된 슬라이드에 세포를 증착합니다. (C) 핵 염색을 통한 전체 슬라이드 형광 현미경 검사(DAPI/Hoechst). (D) 샘플 슬라이드에 MALDI 매트릭스(DHAP) 승화. (E) 이미지 유도 단일 셀 MALDI-2 MS 측정. (F) 차원 축소, 클러스터링 및 통계 분석을 포함한 포괄적인 데이터 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 단일 세포 분석을 위한 MALDI-2 MS 최적화 및 이미징. (A) 일차 세포의 분산된 집단에 대한 MALDI-2 MSI 이미징. 화살표는 몇 개의 개별 셀을 나타냅니다. MSI와 작은 영역을 수행하면 분석가가 분석법 매개변수를 최적화하고 샘플 품질을 평가할 수 있습니다. (B) MALDI-2 및 MALDI MS 획득을 사용하여 얻은 결과 비교. 콜레스테롤, DAG(디아실글리세롤), PC(포스파티딜콜린) 및 PE(포스파티딜에탄올아민)를 포함한 다양한 지질의 신호 향상(MALDI 2 vs MALDI)은 MALDI-2 스펙트럼(위) 및 MALDI 스펙트럼(아래)을 보여줌으로써 강조되고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 뇌 기원 영역별로 착색된 분석된 세포의 MALDI-2 MS. (A) UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 분석에 의한 3개의 설치류 뇌 영역 내 단일 세포 지질 프로파일링. (B) 라이덴 클러스터링(Leiden clustering)을 거친 후 동일한 세포에 대한 UMAP 분석, 여기서 클러스터는 유사한 지질 조성을 가진 세포의 하위 집단에 해당합니다. 여기서 색상은 다양한 Leiden 데이터 클러스터를 보여줍니다. (C) 클러스터 간의 서로 다른 지질에 대한 강도 분포의 차이를 보여주는 바이올린 플롯. (D) 6개의 대표적인 개별 피질 세포의 스펙트럼을 2개의 개별 슬라이드에서 분석했습니다. (E) 두 개의 개별 슬라이드에서 분석된 피질 세포의 UMAP 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: SC-MALDI2_Analysis.py. 이 파일에는 단일 셀 MALDI-2 질량 분석 데이터를 처리하기 위해 개발된 일련의 기능이 포함되어 있습니다. 여기에는 원시 질량 분석 데이터를 읽고, 비닝을 수행하고, 주석 및 다운스트림 분석을 수행하는 방법이 포함됩니다. 로드하고 모든 데이터 전처리 및 분석을 수행하기 위한 셀 세트는 보충 파일 2에 제공됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: JOVE Analysis.ipynb. 이 파일에는 SC-MALDI2_Analysis.py의 사용자 지정 Python 함수에 로드하고 언급된 모든 데이터 전처리 및 분석을 수행할 셀 집합이 포함된 Jupyter Notebook이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
고처리량, 이미지 유도 단일 세포 MALDI MS는 단일 세포 규모에서 화학적 이질성을 이해하는 데 유용한 도구입니다. MALDI-2(laser-induced post-ionization)를 추가하면 더 깊은 분석물 커버리지를 얻을 수 있으며, 이는 분리된 포유류 세포와 같이 질량 및 부피가 제한된 샘플에 매우 중요합니다.
발표된 단세포 지질 및 대사산물 MS 워크플로우의 압도적 다수는 배양된 세포를 사용하지만, 당사의 접근 방식은 상대적으로 빠르게 분리되는 일차 세포에 적용됩니다. 배양된 세포는 배양 후 단 며칠 만에 대사 산물 및 지질 함량의 명백한 변화를 보여주기 때문에 이러한 구분은 매우 중요합니다23,31. 대부분의 경우 효소 세포 분리는 축삭돌기, 수상돌기 및 성상세포 돌기와 같은 미세한 세포 구조의 손실로 이어집니다. 따라서 관찰된 분석물 신호는 주로 cell soma에서 얻습니다. 그럼에도 불구하고, 세포유형 4 및 뇌 영역별 성공적인 분류는 달성된다12. 이는 서로 다른 세포에 고유한 많은 지질이 체내에 위치하고 있음을 시사합니다.
MALDI 매트릭스 응용 방법의 작은 차이는 결과 분석물 신호에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 상용 장치를 사용한 재현 가능한 매트릭스 승화를 기반으로 하는 워크플로우를 제시했으며, 이는 균일한 매트릭스 층, 높은 신호 대 잡음비 및 제한된 분석물 확산을 생성합니다. 그러나 로봇 분무기 또는 아티스트의 에어 브러시를 사용하는 매트릭스 응용 프로그램은 다른 접근 방식 중에서 사용할 수 있습니다. 접근법에 관계없이, 광학 매트릭스 대 분석물 비율을 달성하기 위해 표준 조직 MSI에 사용되는 것과 비교하여 단일 세포 제제에 더 낮은 매트릭스 밀도를 적용해야 합니다. 여기에 적용된 매트릭스 밀도는 조직 MSI에 사용되는 밀도의 약 절반입니다. 물론 이는 셀당 매트릭스의 양이 MSI보다 많다는 것을 의미하며, 이는 여기에 사용된 분리된 셀 접근 방식에서 향상된 분석물 추출 및 검출에 기여하는 데 도움이 됩니다.
상당한 최적화가 필요한 샘플의 경우, 그림 2A에서 볼 수 있듯이 단일 세포 해리의 작은 ROI에서 MSI를 수행하는 것이 최적화 프로세스의 일부로 수행될 수 있습니다. 또한 이 단계를 통해 분석가는 용매 기반 매트릭스 응용 접근법에서 분석물이 확산되는 정도를 평가할 수 있습니다.
단일 세포의 성공적인 이미지 유도 MALDI를 위해서는 고품질 형광 이미지, 재현 가능한 매트릭스 응용 분야 및 정밀한 스테이지 제어가 필요합니다. 이러한 실험은 더 큰 이미징 영역과 더 높은 분석물 수로 인해 경미한 등록 오류와 매트릭스 및 샘플 조건의 변동성을 허용하는 표준 MSI 워크플로우보다 더 까다롭습니다. 이러한 어려움에도 불구하고 당사는 기존 MALDI를 사용하여 단일 소기관을 성공적으로 표적으로 삼았습니다.
타일형 형광 이미지의 정확한 스티칭은 작은 오류가 복합적으로 발생하여 스테이지 제어에 영향을 미칠 수 있으므로 정합 정확도가 매우 중요합니다. 배치 효과(Batch effect)는 또한 동일한 슬라이드, 슬라이드 사이 및 제제 전반에 걸쳐 관찰되는 신호 변화와 함께 주요 문제를 제시합니다. 내부 표준물질 및 사분위수 정규화의 사용을 포함한 적절한 정규화 전략은 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 됩니다. 또한 ComBat30 과 같은 배치 보정 알고리즘을 사용하여 기술적 변동성을 줄이고 실제 생물학적 차이를 향상시킬 수 있습니다.
단일 세포에서 신뢰할 수 있는 분자 주석을 얻는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 종종, 물질의 양과 검출 민감도는 가장 풍부한 종을 제외한 모든 종의 탠덤 MS에 충분하지 않습니다. 개별 세포에서 직접 탠덤 MS를 검출할 수 없는 경우, 분석물 라이브러리를 생성하는 대체 접근법을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 조직 내 탠덤 MS 데이터는 동일한 뇌 영역과 세포 집단을 생성하는 데 사용되는 동물의 얇은 냉동 절편에서 얻을 수 있습니다. 조직에서 지질을 추출한 후 LC-MS를 사용하는 방법도 사용할 수 있습니다. 시료 전처리 전략과 MS 기술이 계속 개선됨에 따라 단일 세포에서 직접 관련 구조 정보를 얻을 수 있는 경우가 점점 더 많아지고 있습니다. 미래에는 이 워크플로우가 확장되어 단일 세포에서 탠덤 MS 데이터를 얻을 수 있게 되어 보조 LC-MS/MS 실험의 필요성이 없어질 것으로 예상됩니다. 우리는 또한 이 접근 방식이 고유한 세포 유형, 포유류 소기관, 분말 및 미세 플라스틱을 포함하여 생물학 및 그 이상의 미시적 규모의 수많은 샘플로 확장될 수 있을 것으로 예상합니다.
저자는 공개할 경쟁 이해관계가 없습니다.
S.W.C는 Peixin He and Xiaoming Chen PhD4 펠로우십과 University of Illinois Block Grant Fellowship의 지원에 감사를 표합니다. 이 작업은 또한 National Institute on Drug Abuse의 지원을 받았습니다. P30DA018310, National Institute on Aging(국립 노화 연구소)에서 수상 번호. R01AG078797, 그리고 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 소장실(Office of The Director)에 의해 수상 번호 S10OD032242.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2',5'-dihydroxyacetophenone | Sigma Aldrich | D107603 | DHAP, 97% purity |
Ammonium acetate | Sigma Aldrich | 238074 | ACS reagent, ≥97% |
Axio M2 Imager | Zeiss | N/A | N/A |
Biopsy punch, 2 mm | Fisher Scientific | 12-460-399 | integra miltex standard biopsy punch, 2mm |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | anhydrous, powder ≥97% |
Eppendorf Centrifuge | Sigma Aldrich | EP5405000441 | centrifuge 5425 with rotor FA-24x2 |
Gentamicin | Sigma Aldrich | G1272 | liquid, BioReagent |
Glass etching pen | Sigma Aldrich | Z225568 | carbide time, pkg of 1 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G7893 | ACS reagent, ≥99.5% |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
Hoechst 33258 Solution | Sigma Aldrich | 94403 | 1 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC) |
In line HEPA Filter | Sigma Aldrich | WHA67225001 | VACU-GUARD 60 mm disc, 0.45 PFTE housing |
ITO-Coated Microscopy Slides | Delta Technologies | CG-90IN-S115 | 70-100Ω resistance |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | anhydrous, ≥98% |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 208094 | anhydrous, ≥97% |
Microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich | HS4323K | tube capacity 1.5 mL, pack of 500 |
Papain dissociation system | Worthington Biochemical | LK003150 | one box, 5 single use vials |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458 | liquid, BioReagent |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | 529552 | Molecular biology grade |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | Reagent Plus |
Sodium biocarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | ACS reagent, ≥99.7% |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99% |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 221465 | ACS reagent, ≥97%, pellets |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | ACS reagent, ≥99% |
Sublimate | HTX | N/A | N/A |
timsTOF FleX MALDI-2 | Bruker | N/A | microGRID enabled |
Vacuum tubing | Thermo Scientific | 8701-0080 | Nalgene Non-phthalate PVC Tubing |
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