Method Article
* These authors contributed equally
يحدد هذا البروتوكول استخدام microMS لقياس الطيف الكتلي MALDI-2 أحادي الخلية الموجه بالفلورة ، مما يتيح التنميط الجزيئي المعزز للخلايا العصبية الأولية للفئران.
تعد قياسات الخلية المفردة أمرا بالغ الأهمية لفهم عدم التجانس الكيميائي المكاني الغني للدماغ. قياس الطيف الكتلي بالليزر / التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI) قادر على توصيف الجزيئات الداخلية في الخلايا الفردية الخالية من الملصقات وعالية الإنتاجية. توفر التطورات الحديثة في تطوير مطياف الكتلة MALDI مع ما بعد التأين الناجم عن الليزر (MALDI-2) حساسية محسنة بشكل كبير للكشف عن مجموعة متنوعة من الدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. ومع ذلك ، فإن تصوير التصلب العصبي المتعدد للعينات الكبيرة باستخدام MALDI-2 بدقة خلوية بطيء للغاية بالنسبة لمعظم التطبيقات. في هذا البروتوكول ، يتم عزل الخلايا الأولية وتشتيتها على شرائح موصلة. يتم تحديد مواقع الخلايا النسبية عن طريق الفحص المجهري الفلوري كامل الشريحة ، متبوعا بتسجيل مشترك دقيق لإحداثيات الفحص المجهري لإحداثيات المرحلة لمطياف الكتلة MALDI-2. يوفر تحليل MS المستهدف لمواقع الخلايا فقط قياسات عالية الإنتاجية وحيدة الخلية مع تغطية تحليلية عالية وحجم بيانات أقل مقارنة بتصوير MS للعينة بأكملها. نصف الخطوات الحاسمة اللازمة لإعداد الخلية الواحدة ، والتصوير الفلوري للشريحة الكاملة ، وتطبيق المصفوفة ، وقياس الطيف الكتلي MALDI-2.
تعتبر الدهون والمستقلبات أساسية للوظيفة الخلوية وتعمل كمكونات أساسية للأغشية ومصادر الطاقة وجزيئات الإشارات1،2. ومع ذلك ، يمكن أن يختلف تكوينها ووفرة اختلافها بشكل كبير بين الخلايا الفردية ، مما يعكس الاختلافات في أنواع الخلايا والحالات التنمويةوالوظيفية 3،4،5. يعد تحليل هذه الاختلافات أمرا بالغ الأهمية لفهم التباين البيولوجي وتحديد مجموعات الخلايا الفرعية المتميزة. توفر تقنيات قياس الخلية المفردة ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، ملفات تعريف نسخ مفيدة خاصة بالخلية6. ومع ذلك ، فإن هذه القياسات على مستوى النسخ لا تعكس بشكل مباشر الكميات الخلوية الفعلية للدهون والمستقلبات ، حيث لا يرتبط التعبير الجيني دائما بالوفرة الفعلية لهذه التحليلات. لذلك ، هناك حاجة إلى طرق متخصصة للقياسات المباشرة للدهون والمستقلبات للتحليل الشامل للتركيب الكيميائي للخلايا المفردة وأعدادها.
يعد التصوير اللطيفي الكتلي (MSI) لامتصاص / تأين الليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) أداة مفضلة لرسم الخرائط المكانية الخالية من الملصقات للجزيئات الحيوية الداخلية في الموقع7،8. عادة ، مع MALDI ، يتم استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لاستئصال المواد من طبقة عينة رقيقة متبلورة مع مصفوفة عضوية ، وتشكيل عمود من الأيونات والجزيئات المحايدة. ثم يتم فصل الأيونات المتكونة بواسطة محلل MS واكتشافها داخل مطياف الكتلة. نظرا لتحديد المواقع الدقيقة لمراحل مطياف الكتلة الحديثة ، يمكن وضع الليزر لاستهداف مناطق عينة معينة أو تنقيطه عبر المناطق لإنشاء صور جزيئية بواسطة MSI. يمكن استخدام MSI بدقة مكانية خلوية أو تحت خلوية (< 10 ميكرومتر) ، والتي يتم تحقيقها باستخدام شعاع ليزر مركز وحركة مرحلية دقيقة ، للحصول على معلومات كيميائية حول الخلايا الفردية9،10. ومع ذلك ، فإن قياسات MSI على هذا المقياس غير فعالة ، خاصة في حالة العينات ذات الكثافة الخلوية المستهدفة المنخفضة ، بسبب مقدار الوقت المستغرق في تصوير المناطق الفارغة بين الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن قابلية الكشف عن العديد من التحليلات محدودة بسبب الحجم الصغير الذي تم أخذ عينات منه. للتغلب على هذه التحديات ، قمنا بتطوير نهج MALDI MS الموجه بالصور لتحليل الخلية المفردة عاليالإنتاجية 11،12. في هذا النهج ، يتم تحديد مواقع الخلايا المشتتة برمجيا من صور مضان الشريحة الكاملة واستخدامها لتوجيه مرحلة مطياف الكتلة إلى المواضع التي توجد فيها الخلايا الفردية ذات المعلمات المحددة (على سبيل المثال ، الحجم والشكل) ثم يتم تحليلها عن طريق التشعيع باستخدام ليزر MALDI. تم استخدام العمل السابق باستخدام هذا النهج المستهدف لتوصيف الدهون والببتيدات والجزيئات الحيوية الأخرى في مجموعات الخلايا غير المتجانسة5،13.
نظرا للطبيعة المحدودة للكتلة للخلايا المفردة ، فإن عدد التحليلات المكتشفة في هذه العينات أقل بشكل عام من تلك التي لوحظت مباشرة من الأنسجة. لذلك ، لزيادة تغطية التحليل في تحليل MS أحادي الخلية ، تعد زيادة حساسية الكشف عن التحليل أمرا بالغ الأهمية. أحد الأساليب التي تم تطويرها مؤخرا والتي تساعد في التغلب على تحدي الكشف هذا هو MALDI مع الليزر بعد التأين (MALDI-2) ، والذي ثبت أنه يعزز الحساسية لمجموعة واسعة من التحليلات9،14،15،16. نتيجة لذلك ، يولد MALDI-2 مجموعات بيانات أكثر شمولا من خلية واحدة ويوفر تغطية جزيئية أعمق في العينات المحدودة الكتلة ، مثل الخلايا المعزولة.
الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على قياسات الدهون من آلاف الخلايا الفردية. تحقيقا لهذه الغاية ، نصف سير العمل الذي يتيح قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية MALDI-2 عالي الإنتاجية ويمكن تمديده بشكل عام إلى أي نهج قياس الطيف الكتلي القائم على المسبار مع التحكم الدقيق في المرحلة17. في سير العمل هذا ، يتم تشريح الأنسجة من منطقة (مناطق) الدماغ ذات الأهمية ، ويتم الحصول على الخلايا الفردية من الأنسجة بعد إجراء تفكك غراء. ثم يتم تمييز الخلايا ببقعة نووية ويتم تشتيتها على شرائح زجاجية موصلة محفورة بعلامات إيمانية ، حيث يسمح لها بالالتصاق. بعد ذلك ، يتم التقاط صور الشريحة الكاملة باستخدام المجهر الفلوري. يتم ترسيب المصفوفة عن طريق التسامي ، مما يولد طبقة بلورية متجانسة قابلة للتكرار وإشارة عالية إلى ضوضاء لتحليل MS أحادي الخلية. باستخدام البرنامج مفتوح المصدر microMS11 ، يتم تعيين الإحداثيات النسبية لمواقع الخلايا من صورة الفحص المجهري ومحاذاتها مع إحداثيات مرحلة مطياف الكتلة عن طريق تسجيل مجموعة النقاط باستخدام علامات إمانية محفورة على الشرائح الزجاجية حيث تم إيداع الخلايا. أخيرا ، باستخدام هذه المعلومات ، يتم الحصول على أطياف MS الدقيقة والمستهدفة من كل خلية على حدة ، مما يسمح بتحديد الآلاف من الخلايا في تشغيل واحد (<1 ساعة) 12،13.
أجريت جميع التجارب على في هذه الدراسة وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة إلينوي المؤسسية لرعاية واستخدامه (23228) مع الالتزام الصارم بالمعايير الوطنية ومعايير ARRIVE للمعاملة الأخلاقية للحيوانات ورعايتها.
1. تحضير المواد والحلول
2. تحضير الخلايا العصبية الأولية
ملاحظة: يتم تشريح أنسجة الحصين في الفئران ، وتفكيكها إلى خلايا فردية مع غراء ، وترسبها على شرائح زجاجية موصلة بكثافة منخفضة. يتيح عزل الخلايا بهذه الطريقة قياس طيف كتلة الخلية المفردة عالي الإنتاجية للدهون الداخلية.
3. الفحص المجهري
ملاحظة: لتحديد موقع الخلايا المترسبة ، يتم تصوير كل شريحة بواسطة المجهر الساطع / الفلور. تسمح قناة التألق بتحديد موقع الخلايا الملطخة ب Hoechst بدقة ، بينما يوفر التصوير الساطع معلومات مورفولوجية. أي مجهر قادر على الحصول على الصور المبلطة مناسب لهذه العملية.
4. تطبيق المصفوفة
ملاحظة: يعد تطبيق مصفوفة MALDI المتسق والمناسب أمرا بالغ الأهمية للحصول على بيانات عالية الجودة أحادية الخلية. أثناء استخدام التسامي باستخدام جهاز تجاري هنا ، يمكن أيضا إجراء تطبيق المصفوفة باستخدام بخاخ آلي12 أو البخاخة21 أو جهاز التسامي محلي الصنع22. لقد وجدنا أن المستحضرات أحادية الخلية تتطلب مصفوفة أقل من أقسام الأنسجة الرقيقة المستخدمة عادة في تصوير قياس الطيف الكتلي. لتقليل تأثيرات الدفعات ، يوصى بتطبيق المصفوفة على جميع الشرائح قيد الدراسة خلال جلسة واحدة وإيداع الخلايا من مجموعات مختلفة (على سبيل المثال ، منطقة الدماغ أو العلاج مقابل التحكم) على نفس الشريحة كلما أمكن ذلك. يعد اختيار المصفوفة أمرا بالغ الأهمية لكل من سير العمل أحادي الخلية MALDI و MALDI-2 التقليدي. بالنسبة إلى MALDI أحادية الخلية ، تم استخدام DHB23 و 9-AA24 و CHCA25 بنجاح. في MALDI-2 ، لاحظنا نحن وآخرون تحسنا كبيرا في الإشارة مع DHAP9 ، بينما تم أيضا تطبيق المصفوفات مثل NEDC16 و CHCA26 بشكل فعال.
5. خلية واحدة MALDI MS
ملاحظة: يتم الحصول على بيانات MS أحادية الخلية على جهاز MALDI-2 timsTOF (timsTOF flex) باستخدام حزمة microMS مفتوحة المصدر لاكتشاف الخلايا وتوجيه مطياف الكتلة. يتطلب ذلك ترجمة مواقع بكسل الصورة البصرية للخلايا المستهدفة إلى الإحداثيات الفيزيائية لمرحلة مطياف الكتلة.
6. معالجة البيانات
ملاحظة: حزم البرامج التجارية الحالية ليست مناسبة تماما لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية عالية الإنتاجية. بينما يمكن تصور الأطياف الفردية ، فإن استخراج رؤى بيولوجية ذات مغزى يتطلب أدوات متخصصة. لمعالجة هذه المشكلة ، نقدم برنامجا متاحا مجانا يسهل تحليل بيانات MALDI-2 MS أحادية الخلية. يسهل سير العمل المحدث لدينا التحويل المباشر للبيانات أحادية الخلية إلى تنسيق imzMLمفتوح المصدر 27 ، مما يسمح بالتوافق مع SCiLS MVS وبرامج البائعين الأخرى. لتحليل البيانات الأكثر تقدما ، يتضمن البرنامج النصي الكامل أيضا وظائف للتعليق التوضيحي للدهون والتجميع وأدوات التصور الأخرى التي تم تمكينها بواسطة Matplotlib (الإصدار 3.7.3). يتم تسهيل تحليل البيانات الأولية وقراءتها من خلال مكتبة pyTDFSDK ، وهي مجموعة من الوظائف المضمنة في سير عمل TIMSCONVERT28.
تظهر نظرة عامة على سير العمل ل MALDI-2 MS أحادية الخلية الموجهة بالفلورة في الشكل 1. أولا ، يتم فصل الأنسجة التي تم تشريحها من مناطق الدماغ المستهدفة (الشكل 1 أ) إلى خلايا مفردة وترسبها على شرائح الفحص المجهري الموصلة المطلية ب ITO (الشكل 1 ب). يتم تحديد مواقع الخلايا عن طريق التصوير الفلوري للشريحة الكاملة (الشكل 1 ج) ، متبوعا بتطبيق مصفوفة MALDI (الشكل 1 د) ، وتحليل MALDI-2 MS بمساعدة microMS (الشكل 1E) ، وتحليل البيانات (الشكل 1F). باستخدام سير العمل هذا ، يمكن تحديد عشرات إلى مئات الدهون داخل الخلايا الفردية بدقة كتلة أقل من 10 جزء في المليون (باستخدام MALDI-2 timsTOF).
يمكن إجراء تصوير قياس الطيف الكتلي في منطقة صغيرة ذات أهمية لتقييم جودة تحضير الخلية وتطبيق المصفوفة. تظهر النتيجة التمثيلية لتصوير MALDI-2 للخلايا المشتتة في الشكل 2 أ. من هذه الصورة ، يمكن للمستخدم تقييم مدى انتشار المادة التحليلية بالمقارنة مع صورة مجهرية لنفس المنطقة. بناء على مقدار الانتشار ، يمكن للمحلل ضبط حجم مجال شعاع الليزر ومرشح المسافة لضمان عمليات الاستحواذ الحقيقية على الخلية الواحدة. في MSI أحادي الخلية ، سيتم استخدام حجم ليزر صغير وعرض نقطي للحصول على دقة خلوية (1-5 ميكرومتر) ، بينما يمكن استخدام حجم ليزر أكبر ل microMS ، مما يزيد من شدة الإشارة وعدد الدهون التي يمكن اكتشافها بالنسبة للتصوير. تظهر النتائج التمثيلية لتحسين الإشارة التي تم الحصول عليها باستخدام MALDI-2 في الشكل 2 ب. لوحظ زيادة أنواع الكوليسترول و PE و PC بالاتفاق مع الأدبيات السابقة14. بشكل عام ، نحصل على أفضل تحسين لإشارة MALDI-2 عند استخدام طاقة ليزر عالية نسبيا (>50٪) وعدد أقل من اللقطات (حوالي 10 إلى 200). بعض التحسين ضروري ، لأن الانخفاض الشديد في طاقة الليزر لن يوفر تعزيزا ، في حين أن الكثير من طاقة الليزر سيؤدي إلى تجزئة مفرطة للتحليل29. بالنسبة لتحليل الخلية الواحدة ، يعد التسجيل المكاني خطوة حاسمة لضمان الاستهداف الدقيق للخلايا الفردية. للتحقق من صحة التسجيل ، يمكن إنشاء مجموعة صغيرة من نقاط الاختبار (~ 5) حول الشريحة عن طريق إنشاء كائنات كبيرة الحجم في أماكن معروفة وتصدير إحداثيات الأداة عبر microMS. يضمن التحقق من أن نقاط الاختبار هذه تحدد مرحلة الأداة بشكل صحيح عند تحديدها أن استهداف الخلايا اللاحق سيكون دقيقا.
يتيح MALDI MS تحديد التنميط بين مناطق الدماغ الفردية وداخلها (الشكل 3). من خلال تحليل الاختلافات في ملفات تعريف الدهون ، تفصل تقنيات تقليل الأبعاد الخلايا بشكل فعال إلى مجموعات متميزة ، مما يسلط الضوء على تنوع تركيبات الدهون عبر مجموعة البيانات (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، يظهر تطبيق تقنيات التجميع ، مثل تجميع ليدن ، وجود مجموعات فرعية فريدة من الخلايا داخل مناطق معينة من الدماغ ، بما في ذلك المخطط والقشرة (الشكل 3 ب). بالإضافة إلى ذلك ، من خلال مقارنة ملفات تعريف الدهون لكل مجموعة ببعضها البعض (الشكل 3 ج) ، يمكن استخدام دهون محددة كعلامات لتحديد الهويات الخاصة بالمجموعة. يتم تنظيم العديد من أنواع الدهون بشكل كبير في مجموعات محددة ، مما يشير إلى أدوار أو حالات وظيفية مميزة ، بينما يتم مشاركة أنواع أخرى عبر مجموعات ولكنها تختلف في شدة الإشارة النسبية. لضمان تحليل قوي للبيانات النهائية ، من الضروري تحقيق اكتشاف موثوق للدهون في غالبية الخلايا وتقييم تأثيرات الدفعات المحتملة. يعرض الشكل 3D أطياف تمثيلية من ست خلايا قشرية فردية منتشرة عبر شرائح منفصلة مطلية ب ITO. في حين أن ملامح الدهون الفردية تظهر عدم التجانس ، يتم الكشف عن الدهون باستمرار في جميع عمليات الاستحواذ. يعرض الشكل 3E UMAP للخلايا القشرية من شرائح مختلفة ، تم إعدادها وتحليلها في ظل ظروف متطابقة. يشير التداخل الكبير للخلايا بين الشرائح إلى أن تأثيرات الدفعات لا تربك بشكل كبير التفسيرات البيولوجية. إذا لزم الأمر ، يمكن تطبيق خوارزميات تصحيح الدفعات مثل ComBat30 للتخفيف من أي تأثيرات متبقية. باختصار ، MALDI-2 أحادي الخلية هو تقنية متقدمة لتحديد المؤشرات الحيوية للدهون ، وتقدم رؤى مهمة حول المجموعات السكانية الفرعية الخلوية وتعزز فهمنا للتنوع الإقليمي والوظيفي في الدماغ.
الشكل 1: سير العمل العام ل scMALDI-2 MS. (أ) تشريح الأنسجة اليدوي وعزل مناطق الدماغ. (ب) تفكك غراء الأنسجة إلى خلايا مفردة وترسب الخلية على شرائح موصلة مغلفة ب ITO. (ج) الفحص المجهري الفلوري كامل الشريحة عن طريق التلوين النووي (DAPI / Hoechst). (د) تسامي مصفوفة MALDI (DHAP) على شرائح العينة. (ه) قياسات MALDI-2 MS أحادية الخلية الموجهة بالصور. (و) تحليل شامل للبيانات، بما في ذلك تخفيض الأبعاد، والتجميع، والتحليل الإحصائي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحسين MALDI-2 MS والتصوير لتحليل الخلية الواحدة. (أ) تصوير MALDI-2 MSI للمجموعات المتفرقة من الخلايا الأولية. تشير الأسهم إلى عدد قليل من الخلايا الفردية. يسمح أداء MSI ومنطقة صغيرة للمحلل بتحسين معلمات الطريقة وتقييم جودة العينة. (ب) مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام اقتناء MALDI-2 و MALDI MS. يتم تسليط الضوء على تحسين الإشارة (MALDI 2 مقابل MALDI) لمختلف الدهون ، بما في ذلك الكوليسترول ، DAG (دياسيل الجلسرين) ، PC (فوسفاتيديل كولين) ، و PE (فوسفاتيديل إيثانولامين) ، من خلال إظهار طيف MALDI-2 (أعلى) وطيف MALDI (أسفل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التنميط الدهني أحادي الخلية داخل ثلاث مناطق في دماغ القوارض بواسطة MALDI-2 MS. (أ) تحليل التقريب والإسقاط المتشعب المنتظم (UMAP) للخلايا التي تم تحليلها الملونة حسب منطقة المنشأ الدماغية. (ب) تحليل UMAP لنفس الخلايا بعد الخضوع لتجميع ليدن ، حيث تتوافق المجموعات مع مجموعات سكانية فرعية من الخلايا ذات التركيبات الدهنية المتشابهة. تظهر الألوان هنا مجموعات مختلفة من بيانات Leiden. (ج) مخطط كمان يوضح الفرق في توزيعات الشدة للدهون المختلفة بين المجموعات. (د) تم تحليل الأطياف من ست خلايا قشرية فردية تمثيلية من شريحتين منفصلتين. (ه) تحليل UMAP للخلايا القشرية التي تم تحليلها من شريحتين منفصلتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: SC-MALDI2_Analysis.py. يحتوي هذا الملف على مجموعة من الوظائف التي تم تطويرها لمعالجة بيانات قياس الطيف الكتلي MALDI-2 أحادية الخلية. يتضمن طرقا لقراءة بيانات قياس الطيف الكتلي الخام ، وإجراء التجميع ، وإجراء التعليقات التوضيحية وتحليلات المصب. يتم توفير مجموعة الخلايا لتحميل وتنفيذ جميع المعالجة المسبقة للبيانات والتحليلات في الملف التكميلي 2. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: JOVE Analysis.ipynb. يحتوي هذا الملف على دفتر ملاحظات Jupyter يحتوي على مجموعة من الخلايا لتحميلها في وظائف Python المخصصة من SC-MALDI2_Analysis.py وإجراء جميع المعالجة المسبقة للبيانات والتحليلات المذكورة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
يعد MALDI MS أحادي الخلية عالي الإنتاجية والموجه بالصور أداة قيمة لفهم عدم التجانس الكيميائي على نطاق خلية واحدة. توفر إضافة ما بعد التأين الناجم عن الليزر (MALDI-2) تغطية تحليلية أعمق ، وهو أمر بالغ الأهمية للعينات محدودة الكتلة والحجم مثل خلايا الثدييات المعزولة.
في حين أن الغالبية العظمى من تدفقات عمل التصلب العصبي المتعدد أحادية الخلية وحيدة الخلية المنشورة تستخدم الخلايا المستنبتة ، يتم تطبيق نهجنا على الخلايا الأولية المعزولة بسرعة نسبيا. هذا التمييز أمر بالغ الأهمية ، حيث تظهر الخلايا المستنبتة تغيرا واضحا في محتوى مستقلبها والدهون في غضون أيام قليلة من زراعة23،31. يؤدي عزل الخلايا الأنزيمية ، في معظم الحالات ، إلى فقدان الهياكل الخلوية الدقيقة مثل المحاور والتشعبات والعمليات النجمية. لذلك ، يتم الحصول على إشارات التحليل المرصودة بشكل أساسي من سوما الخلية. على الرغم من ذلك ، تم تحقيق تصنيف ناجح حسب نوع الخلية4 ومنطقةالدماغ 12. يشير هذا إلى أن العديد من الدهون الفريدة للخلايا المتميزة تقع في سوما.
يمكن أن يكون للاختلافات الصغيرة في طريقة تطبيق مصفوفة MALDI تأثيرات عميقة على إشارة التحليل الناتجة. لقد قدمنا سير عمل يعتمد على تسامي المصفوفة القابلة للتكرار باستخدام جهاز تجاري ، والذي يولد طبقة مصفوفة متجانسة ، وإشارة عالية إلى ضوضاء ، وانتشار محدود للتحليل. ومع ذلك ، يمكن استخدام تطبيق المصفوفة باستخدام بخاخ آلي أو بخاخة الفنان ، من بين طرق أخرى. بغض النظر عن النهج ، يجب تطبيق كثافة مصفوفة أقل على مستحضرات الخلية المفردة مقارنة بتلك المستخدمة في MSI القياسي للأنسجة من أجل تحقيق نسبة المصفوفة البصرية إلى التحليل. كثافة المصفوفة المطبقة هنا هي ما يقرب من نصف تلك المستخدمة في MSI الأنسجة. بالطبع ، هذا يعني أن كمية المصفوفة لكل خلية أعلى مما هي عليه في MSI ، مما يساعد على المساهمة في استخراج التحليل المعزز والكشف عنه في نهج الخلية المعزولة المستخدم هنا.
بالنسبة للعينات التي تتطلب تحسينا كبيرا ، يمكن إجراء إجراء MSI على عائد استثمار صغير لتفكك الخلية المفردة ، كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كجزء من عملية التحسين. يمكن أن تسمح هذه الخطوة أيضا للمحلل بتقييم مدى انتشار التحليل في مناهج تطبيق المصفوفة القائمة على المذيبات.
يتطلب MALDI الناجح الموجه بالصور للخلايا المفردة صورا مضان عالية الجودة ، وتطبيق مصفوفة قابلة للتكرار ، وتحكما دقيقا في المرحلة. هذه التجارب أكثر تطلبا من مهام سير عمل MSI القياسية ، والتي تتسامح مع أخطاء التسجيل الطفيفة والتباين في ظروف المصفوفة والعينة بسبب مناطق التصوير الأكبر وعدد التحليلات الأعلى. على الرغم من هذه التحديات ، نجحنا في استهداف عضيات مفردة باستخدام MALDI التقليدي.
يعد الخياطة الدقيقة للصور الفلورية المبلطة أمرا ضروريا ، حيث يمكن أن تتفاقم الأخطاء الصغيرة وتؤثر على التحكم في المرحلة ، مما يجعل دقة التسجيل أمرا بالغ الأهمية. تمثل تأثيرات الدفعات أيضا تحديا كبيرا ، حيث لوحظت اختلافات الإشارة عبر نفس الشريحة وبين الشرائح وعبر الاستعدادات. تساعد استراتيجيات التطبيع المناسبة، بما في ذلك استخدام المعايير الداخلية والتطبيع بين الربيعات، في التخفيف من هذه المسائل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام خوارزميات تصحيح الدفعات مثل ComBat30 لتقليل التباين التقني وتعزيز الاختلافات البيولوجية الحقيقية.
لا يزال الحصول على التعليقات التوضيحية الجزيئية الواثقة من الخلايا المفردة يمثل تحديا. في كثير من الأحيان ، تكون كمية المواد وحساسية الكشف غير كافية لمرض التصلب العصبي المتعدد الترادفي من جميع الأنواع باستثناء الأنواع الأكثر وفرة. بالنسبة لأولئك الذين لا يمكن اكتشافهم بما يكفي لمرض التصلب العصبي المتعدد الترادفي مباشرة من الخلايا الفردية ، يمكن تطبيق طرق بديلة لإنشاء مكتبة تحليلية. على سبيل المثال ، يمكن الحصول على بيانات التصلب العصبي المتعدد الترادفي على الأنسجة من عمليات القطع بالتبريد الرقيقة من نفس منطقة الدماغ المستخدمة لتوليد مجموعات خلوية. يمكن أيضا استخدام استخراج الدهون من الأنسجة متبوعا ب LC-MS. مع استمرار تحسن استراتيجيات تحضير العينات وتقنية التصلب العصبي المتعدد ، يمكن الحصول على المزيد والمزيد من المعلومات الهيكلية ذات الصلة مباشرة من الخلايا المفردة. في المستقبل ، نتوقع أن يتم توسيع سير العمل هذا للحصول على بيانات MS الترادفية من الخلايا المفردة ، مما يلغي الحاجة إلى تجارب LC-MS / MS الإضافية. نتصور أيضا أن هذا النهج يمكن أن يمتد إلى العديد من العينات على النطاق الجزئي في علم الأحياء وما بعده ، بما في ذلك أنواع الخلايا الفريدة ، وعضيات الثدييات ، والمساحيق ، واللدائن الدقيقة.
ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.
تعترف SWC بالدعم المقدم من زمالة Peixin He و Xiaoming Chen PhD4 وزمالة جامعة إلينوي Block Grant. وحظي هذا العمل بدعم من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات أيضا بموجب الجائزة رقم P30DA018310 ، المعهد الوطني للشيخوخة بموجب الجائزة رقم. R01AG078797 ، ومن قبل مكتب مدير ، المعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم S10OD032242.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2',5'-dihydroxyacetophenone | Sigma Aldrich | D107603 | DHAP, 97% purity |
Ammonium acetate | Sigma Aldrich | 238074 | ACS reagent, ≥97% |
Axio M2 Imager | Zeiss | N/A | N/A |
Biopsy punch, 2 mm | Fisher Scientific | 12-460-399 | integra miltex standard biopsy punch, 2mm |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | anhydrous, powder ≥97% |
Eppendorf Centrifuge | Sigma Aldrich | EP5405000441 | centrifuge 5425 with rotor FA-24x2 |
Gentamicin | Sigma Aldrich | G1272 | liquid, BioReagent |
Glass etching pen | Sigma Aldrich | Z225568 | carbide time, pkg of 1 |
Glycerol | Sigma Aldrich | G7893 | ACS reagent, ≥99.5% |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H3375 | ≥99.5% (titration) |
Hoechst 33258 Solution | Sigma Aldrich | 94403 | 1 mg/mL in H2O, ≥98.0% (HPLC) |
In line HEPA Filter | Sigma Aldrich | WHA67225001 | VACU-GUARD 60 mm disc, 0.45 PFTE housing |
ITO-Coated Microscopy Slides | Delta Technologies | CG-90IN-S115 | 70-100Ω resistance |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | anhydrous, ≥98% |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 208094 | anhydrous, ≥97% |
Microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich | HS4323K | tube capacity 1.5 mL, pack of 500 |
Papain dissociation system | Worthington Biochemical | LK003150 | one box, 5 single use vials |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458 | liquid, BioReagent |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | 529552 | Molecular biology grade |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | Reagent Plus |
Sodium biocarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | ACS reagent, ≥99.7% |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99% |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 221465 | ACS reagent, ≥97%, pellets |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | ACS reagent, ≥99% |
Sublimate | HTX | N/A | N/A |
timsTOF FleX MALDI-2 | Bruker | N/A | microGRID enabled |
Vacuum tubing | Thermo Scientific | 8701-0080 | Nalgene Non-phthalate PVC Tubing |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved