표면 플라즈몬 공명 기술을 사용한 PD-1/PD-L1 억제제 식별

이 프로토콜은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 차단 분석을 설명합니다. 2단계 고정 전략과 맞춤형 완충 시스템을 사용하여 반응 단위를 정확하게 측정하고 화합물 또는 생물학적 제제에 대한 차단율 평가를 용이하게 합니다. 또한 PD-1/PD-L1 억제제의 고처리량 식별을 지원합니다.

PD-1/PD-L1 상호작용의 중단은 암 면역요법에 대한 유망한 전략입니다. 신뢰할 수 있는 스크리닝 플랫폼은 PD-1/PD-L1 억제제의 효능을 평가하는 데 필수적입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술(1세대 PD-1/PD-L1 억제제 SPR 스크리닝 플랫폼)을 활용하여 이전에 확립된 인간 PD-1/PD-L1 차단 분석은 HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) 및 세포 기반 분석을 통해 얻은 것과 유사한 결과를 보여주었으며 대규모 스크리닝 가능성이 있습니다. 본 연구에서는 이 분석법의 최적화된 버전(2세대 PD-1/PD-L1 억제제 SPR 스크리닝 플랫폼)을 제시하며, 아민과 바이오 스트렙타비딘 결합을 결합하여 칩의 PD-1 방향 제어를 강화하고 PD-1 단백질 소비를 줄이는 이중 단계 결합 프로세스를 특징으로 합니다. 업데이트된 플랫폼은 PD-1/PD-L1 억제제 BMS-1166을 사용하여 성공적으로 검증되었으며, 이전의 SPR 기반 방법 및 ELISA와 같은 기타 확립된 기술과 유사한 차단 효과를 보여주었습니다. 이러한 결과는 접근 방식의 신뢰성을 확인합니다. 이 최적화된 SPR 스크리닝 플랫폼은 새로운 PD-1/PD-L1 억제제를 식별하고, 암 면역요법 연구를 진전시키며, 면역관문억제제 스크리닝에서 SPR의 잠재력을 강조하기 위한 고처리량의 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

면역 관문 차단 요법, 특히 PD-1(Programmed Cell Death-1) 및 PD-L1(Programmed Cell Death-Ligand 1)을 표적으로 하는 요법은 암 면역 요법의 최전선에 서 있습니다. 항PD-1/PD-L1 치료제는 혈액암, 피부암, 폐암, 간암, 방광암, 신장암 등 다양한 유형의 암에 사용할 수 있도록 승인을 받았다¹. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 막관통 당단백질로, N-말단에서 단일 면역글로불린 변수(IgV)와 유사한 도메인, 원형질막에서 IgV 도메인을 분리하는 약 20개의 아미노산 줄기, 막관통 도메인, 티로신 기반 신호 모티프를 포함하는 세포질 꼬리를 특징으로 합니다². PD-1의 리간드 중 하나로 확인된 PD-L1은 막관통 영역, 두 개의 세포외 도메인(면역글로불린 상수(IgC) 및 IgV)과 세포 내 신호 전달 경로³을 유발하는 상대적으로 짧은 세포질 도메인을 특징으로 하는 I형 막관통 단백질입니다. PD-1/PD-L1 억제 경로는 T 세포 활성화와 자가면역을 조절하는 중요한 면역 관문 역할을 합니다⁴. PD-1은 T세포에서 발현되어 PD-L1과 상호작용하고, T세포 수용체 신호를 억제하며, 항원제시세포와 T세포에서 CD28 및 CD80 분자의 자극을 차단합니다⁵. 암 조직은 탈출 단계에서 PD-L1을 과발현하여 이러한 생리학적 메커니즘을 이용하여 종양의 성장과 진행을 촉진하는 면역억제 환경을 조성합니다⁶. PD-1 및 PD-L1 억제제는 이러한 상호작용을 방해하여 면역체계가 종양 유발 억제를 회피하고 T세포 매개 종양-세포 사멸 과정을 다시 시작할 수 있도록 합니다⁷.

면역관문차단 요법의 탁월한 역할을 바탕으로 PD-1/PD-L1 억제제의 개발은 암 면역 요법의 중요한 발전을 이루었습니다. 미국 식품의약국(FDA)은 PD-1/PD-L1 경로를 특이적으로 표적으로 하는 9가지 면역관문억제제를 승인했습니다. 여기에는 6가지 PD-1 억제제(펨브롤리주맙, 도스타리맙, 니볼루맙, 켐플리맙, 오리팔리맙, 티스렐리주맙)와 3가지 PD-L1 억제제(아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙 ^8,9)가 포함됩니다. 이러한 치료법은 흑색종, 폐암, 요로상피암, 자궁경부암, 위암 또는 위식도암 및 기타 고형 종양과 같은 다양한 암을 치료하는 데 효과적으로 활용되어 왔다¹⁰. 단클론 항체 기반 치료법은 그 효능에도 불구하고 낮은 반응률, 높은 비용, 반감기 연장, 심각한 면역 관련 부작용, 정맥 주사 또는 피하 전달 제한 등 상당한 한계에 직면해 있습니다 11,12,13. 이에 따라 PD-1/PD-L1 축을 표적으로 하는 저분자 억제제 개발에 대한 연구가 점점 더 집중되고 있습니다. 이러한 소분자는 세포 침투 개선, 다양한 생물학적 표적의 조절, 경구 생체이용률 향상, 비용 절감 등의 뚜렷한 이점을 제공하며, 부작용이 적으면서 유사한 치료 결과를 달성하는 것을 목표로 합니다¹⁴. 그러나 PD-1/PD-L1 상호작용을 표적으로 하는 저분자 억제제의 개발은 초기 단계에 있으며, 이는 주로 신뢰할 수 있는 고처리량 스크리닝 플랫폼이 없기 때문입니다. 이러한 플랫폼은 방대한 소분자 라이브러리를 신속하게 평가하고 추가 검증 및 최적화를 위해 선도 화합물을 식별하는 데 필수적입니다. 이러한 문제를 극복하는 것은 암 면역 요법을 발전시키는 데 매우 중요합니다.

SPR (Surface Plasmon Resonance) 기술은 항체 항원, 효소, 핵산 및 약물을 포함한 다양한 생체 분자를 검출하는 데 광범위하게 사용되며 특히 저분자 약물 스크리닝에 효과적입니다^{15 , 16} . 다른 생물물리학 기법과 달리 SPR은 무표지 검출, 실시간 동역학 데이터 및 광범위한 검출 범위를 제공합니다. 대조적으로, 등온 적정 열량측정법은 실시간 역학 통찰력이 부족하고 더 많은 시료 부피가 필요하여 처리량을 제한합니다. Microscale Thermophoresis는 완충 간섭이 발생하기 쉽고 역학 데이터를 제공할 수 없는 반면, Biolayer Interferometry는 분자 크기 및 특성에 따라 응용 분야별 제한이 있습니다. Homogeneous Time-Resolved Fluorescence는 라벨링이 필요하며 형광 간섭에 취약합니다. 우리는 HTRF가 PD-1/PD-L1 억제제를 탐구하는 데 적합한 또 다른 기술이라는 것을 인정합니다. SPR과 비교했을 때 HTRF의 내재적 한계 중 하나는 분자 내 여기 과정(예: 전자 전달, FRET 및 표백)과의 외부 상호 작용으로 인한 형광 소멸, 작은 창 범위로 인해 약물 스크리닝 과정에서 감도가 너무 낮다는 점, 형광 라이브러리 화합물 또는 생물학적 단백질의 간섭입니다¹⁷. 이러한 특징은 SPR을 신약 개발을 위한 우수한 도구로 자리매김하고 있습니다. 이전 연구에서는 SPR이 PD-1/PD-L1에 대한 소분자의 차단 효과를 측정할 수 있음을 입증했으며, 이는 신약 개발 과정에서 높은 라벨링 기술 요구 사항, 여러 단계, 낮은 특이성 및 높은 비용이 필요한 다른 기술에 비해 유리합니다¹⁸.

이 연구는 칩의 PD-1 배향을 강화하고 단백질 사용을 최소화하기 위해 아민과 바이오 스트렙타비딘 결합을 모두 활용하는 이중 단계 결합 프로세스를 통합하는 최적화된 SPR 기반 플랫폼을 소개합니다. 이 업데이트된 접근법은 PD-1/PD-L1 억제제 BMS-1166을 양성 대조군 바인더로 사용하여 성공적으로 검증되었으며, 이전 SPR 방법 및 ELISA^19,20과 같은 다른 확립된 기술 모두에 필적하는 차단 효과를 입증했습니다. 이는 당사 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 확인할 뿐만 아니라 PD-1/PD-L1 억제제의 고처리량 스크리닝을 촉진하는 데 있어 수정된 플랫폼의 효과를 보여줍니다. 바이오 스트렙타비딘 포획 단계를 통합하면 무작위 단백질 배향이 아닌 현장 지향을 제공하여 PD-1 농도를 낮추고(40μg/mL 대 10μg/mL) 최종 사용자가 streptavidin(SA)을 상용화된 사전 고정 SA 칩에 대한 저렴한 대안인 CM5 칩에 고정화할 수 있도록 하여 비용을 절감할 수 있습니다. 따라서 화합물/펩타이드 라이브러리의 대규모, 비용 효율적인 스크리닝에 유리합니다. 암에 대한 PD-1/PD-L1 억제제의 임상적 잠재력을 평가하기 위해서는 인실리코(in silico), 체외(in vitro) 및 생체 내 분석(in vivo assay)을 포함한 추가적인 특성 분석 방법이 필수적이지만, 당사의 향상된 SPR 기반 스크리닝 플랫폼은 PD-1/PD-L1 억제제의 대규모 스크리닝을 위한 효율적인 도구로 두드러집니다.

시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. CM5 칩에서 스트렙타비딘(SA) 단백질의 고정화

1. SPR 기기에서 부동화 방법을 설정합니다: Open/new wizard 템플릿, 부동화를 선택하고, 칩 유형을 CM5로 설정하고, 사이클당 플로우 셀을 1로 설정합니다. immobilize flow cell 1 및 flow cell 2를 확인합니다.
   1. 아민을 고정 방법으로 설정합니다. 고정 수준, 리간드 농도: 40μg/mL 스트렙타비딘, 목표 수준: 2000RU, 세척 용액: 50mM NaOH에 대한 목표 설정. 다음으로, 실행하기 전에 프라임을 확인하십시오.
2. 다음 튜브를 준비하십시오 : R2 B1 및 R2 C1 - 40 μg / mL 스트렙타비딘; R2 B2 및 R2 C2 : 50 mM의 NaOH; R2 B3 및 R2 C3: EDC; R2 B4 및 R2 C4: NHS; R2 B5 및 R2 C5: 비어 있음; R2 B6 및 R2 C6: 에탄올아민.
   참고: EDC와 NHS는 CM5 칩의 카르복실기를 활성화하여 리간드의 아민과 공유 결합을 가능하게 합니다. 에탄올아민은 고정화 중 비특이적 결합을 방지하기 위해 차단 완충액으로 사용됩니다.
3. HBS-EP+ 완충액 20mL를 탈이온수(DI) 180mL에 10× 희석하여 1× HBS-EP+ 러닝 버퍼 용액 200mL를 준비합니다.
4. 스트렙타비딘 1mg에 DNase가 없는 물 1mL를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 스트렙타비딘 용액을 아세테이트 완충액(pH 4.5)에서 40μg/mL로 희석합니다. 제조업체의 지침에 따라 아민 커플링 시약 키트 시약을 준비하고 1.2단계에 표시된 대로 모든 관련 시약의 레이아웃을 배치합니다.
5. 유지보수 센서 칩을 CM5 칩으로 교체한 다음 튜브 A를 준비된 1× HBS-EP+ 버퍼에 넣고 고정 방법을 다시 연 다음 1.2단계 레이아웃에 따라 튜브를 삽입합니다. 메서드를 실행하고 결과 파일을 저장합니다.
6. 실행 후 유지 관리: CM5 칩을 유지 보수 센서 칩으로 교체하고 튜브 A를 탈이온수가 채워진 병에 넣고 프라임을 실행합니다. CM5 칩을 꺼낸 후 DI 워터 몇 방울로 칩을 세척하고 자연 건조시킵니다. 칩을 4°C의 50mL 튜브에 넣습니다.
   참고: 고정된 SA를 사용하면 CM5 칩이 SA 칩으로 작동할 수 있습니다.

2. SA 칩에서 PD-1 단백질의 고정화

1. SPR 기기에서 고정 방법을 설정합니다: Open/new wizard 템플릿, 고정을 선택하고, 칩 유형을 SA로 설정하고, cycle 당 flow cells를 1로 설정합니다. immobilize flow cell 1 및 cell 2를 확인합니다.
   1. SA-비오틴 캡처를 Method로 설정합니다. 셀 1의 경우 빈 고정을 설정하고, 셀 2의 경우 고정 수준을 목표로 하고, 리간드로 10μg/mL PD-1을 설정하고, 목표 수준: 4000RU를 설정한 다음 실행하기 전에 프라임을 확인합니다.
      참고 : 다음 튜브를 준비하십시오 - R2 B1 및 R2 C1 : NaCl 1M, NaOH 50mM; R2 B2 및 R2 C2 : 50 % 이소프로판올 / NaOH 50 mM / NaCl 1 m; R2 C3: 10μg/mL PD-1.
2. 58.44mg의 NaCl을 1mL의 50mM NaOH에 용해시켜 1M의 NaCl과 50mM의 NaOH 용액을 준비합니다. 500μL 물에 NaCl 58.44mg과 NaOH 4.0mg을 용해한 다음 500μL의 이소프로판올을 첨가하여 50% 이소프로판올/50mM NaOH/1M NaCl 용액을 준비합니다.
3. PD-1 용액 준비: 100μg의 Biotinylated Human PD-1(Fc 및 Avitagged)에 DNase가 없는 물 200μL를 추가하고 실온에서 30분 동안 안정화한 다음 아세테이트 완충액(pH 5.0)에서 10μg/mL로 희석합니다.
4. 2.1단계에서 설명한 대로 모든 시약 레이아웃을 배치합니다. 튜브 A를 1× HBS-EP+ 러닝 버퍼 용액에 넣은 다음 유지보수 센서 칩을 꺼내고 SA 칩(1단계에서 스트렙타비딘 단백질로 코팅된 CM5 칩)을 삽입합니다. 고정 방법을 다시 열고 시약 랙 2를 삽입하고 위치를 확인한 다음 예상 실행 시간에 대해 방법을 실행합니다.
5. 1.6단계를 반복합니다.

3. PD-1 및 PD-L1 재생 정찰

1. 재생 스카우팅 방법 설정: Open/new wizard 템플릿, Regeneration Scout 선택, 흐름 경로 설정: 2-1, 4-3, 칩 유형을 SA로 설정, 실행 컨디셔닝 주기 확인, 용액을 HBS-EP+로 기록, 접촉 시간 30초, 주입 횟수 3회, 용액을 PD-L1 단위, 접촉 시간: 30초, 유속: 30μL/min.
   1. 재생 매개변수의 경우 유속은 30μL/min이고 안정화 기간은 300초입니다. 실험 설계에서 조건 수를 4로 설정하고 각 조건에 대한 주기 수를 2로 설정합니다. 조건을 4, 재생 용액 : 글리신 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 접촉 시간 : 30 초로 설정 한 다음 실행하기 전에 프라임을 확인하십시오.
2. 96웰 마이크로플레이트 레이아웃에서 각 PD-L1 농도를 별도의 샘플 웰 위치로 설정: R1 A1 - R1 A9: 1μM PD-L1; R1 A10 - R1 A12: HBS-EP+ 버퍼; R1 B1 : 글리신 1.5; R1 B2 : 글리신 2; R1 B3 : 글리신 2.5; R1 B4: 글리신 3.
   참고: pH가 다른 글리신 완충액이 재생 완충액으로 사용됩니다.
3. PD-L1 용액 준비: 100μg의 Human PD-L1 Fc Tag 단백질(9.42μM)에 DNase가 없는 물 200μL를 첨가한 다음 HBS-EP+ 완충액에서 1μM로 희석합니다.
4. 3.2단계에서 설명한 대로 레이아웃에 모든 관련 시약을 배치합니다. 튜브 A를 1× HBS-EP+ 버퍼에 넣은 다음 유지보수 센서 칩을 SA 칩으로 교체합니다. Regeneration Scouting Method를 다시 열고, 3.2단계의 튜브 위치를 따르고, 시약 랙을 삽입한 다음 예상 실행 시간 동안 Method를 실행합니다 .
5. 1.6단계를 반복합니다.

4. PD-1/PD-L1 상호 작용의 검증

참고: 검증을 위해 이전에 발표된 보고서¹⁸ 다음에 약간의 조정이 이루어졌습니다.

1. General Settings(일반 설정), Assay Steps(분석 단계) 및 Cycle Types(주기 유형)에서 게시된 보고서와 동일한 파라미터를 사용하고, 접촉 시간을 60초로, 해리 시간을 60초로, 유속을 30μL/min으로 설정합니다. Method 변수, 평가 변수 및 명령에서 Glycine 2.0을 재생으로 사용하는 것을 제외하고는 동일한 설정을 사용하고, 유속을 30μL/min으로 설정하고, 1, 2, 3, 4의 유동 경로를 통과합니다.
   1. 그런 다음 실행을 설정하고 흐름 경로( 2-1, 4-3)를 선택합니다. 0 μM, 0.037 μM, 0.111 μM, 0.333 μM 농도 및 51,300 Da의 분자량을 가진 PD-L1을 입력합니다. 검증을 위해 모든 분석 단계를 확인하고 실행 전에 prime을 선택합니다.
   2. 그런 다음 각 PD-L1 농도를 시약 랙 2 레이아웃에서 별도의 샘플 웰 위치로 설정합니다: R2 B1: PD-L1 0μM; R2 B2 : PD-L1 0.037 μM; R2 B3 : PD-L1 0.111 μM; R2 B4 : PD-L1 0.333 μM; R2 A1 : 재생 완충액으로서의 글리신 2.0; R2 A2: HBS-EP+를 시작 버퍼로 사용합니다.
2. 200mL의 1× HBS-EP+ 러닝 버퍼 용액을 준비합니다. PD-L1 농도 준비: PD-L1 단백질을 9.42μM에서 0.333μM, 0.111μM 및 0.037μM로 HBS-EP+에 희석합니다. 그런 다음 4.1.2단계에서 설명한 대로 레이아웃에 모든 관련 시약을 배치합니다.
   1. 튜브 A를 1× HBS-EP+ 러닝 버퍼 용액에 삽입하고 유지보수 센서 칩을 배출한 다음 SA 칩을 삽입합니다. 재생 스카우팅 방법을 다시 열고, 4.1단계의 튜브 위치를 따르고, 시약 랙 2를 삽입하고, 예상 기간 동안 방법을 실행합니다 .
3. 1.6단계를 반복합니다.

5. 저분자 억제제를 사용한 PD-1/PD-L1 봉쇄 분석: BMS-1166

참고: 봉쇄 분석의 경우, 이전에 발표된 보고서¹⁸ 에 약간의 조정이 가해졌습니다.

1. General Settings(일반 설정), Assay Steps(분석 단계) 및 Cycle Types(주기 유형)에서 게시된 보고서와 동일한 파라미터를 사용하고, 접촉 시간을 60초로, 해리 시간을 60초로, 유속을 30μL/min으로 설정합니다. 분석법 변수에서 평가 변수 및 명령도 동일한 설정을 사용하지만, Glycine 2.0을 재생으로 사용하는 것을 제외하고는 유속을 30μL/min으로 설정하고 1, 2, 3, 4의 유동 경로를 통과합니다.
   1. 그런 다음 실행을 설정하고 흐름 경로( 2-1, 4-3)를 선택합니다. 샘플 용액 입력: PD-L1(0.111 μM, 분자량 51,300 Da)과 BMS-1166을 0 μM, 0.125 μM, 0.625 μM, 3.125 μM에서 입력합니다. 검증을 위해 모든 분석 단계를 확인하고 실행 전에 prime을 선택합니다.
   2. 그런 다음 각 PD-L1 농도를 시약 랙 2 레이아웃에서 별도의 샘플 웰 위치로 설정합니다: R2 B1: PD-L1(0.111μM) + BMS-1166 0μM R2 B2: PD-L1(0.111μM) + BMS-1166 0.125μM; R2 B3 : PD-L1 (0.111 μM) + BMS-1166 0.625 μM; R2 B4 : PD-L1 (0.111 μM) + BMS-1166 3.125 μM; R2 A1: 재생을 위한 글리신 2.0.
2. 200mL의 1× HBS-EP+ 러닝 버퍼 용액을 준비합니다. BMS-1166/PD-L1 혼합물 준비: 77.99μL 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 5mg의 BMS-1166을 용해시켜 100mM 원액을 준비합니다. PD-L1 단백질(0.11μM)이 함유된 원액을 HBS-EP+에서 0μM, 0.125μM, 0.625μM 및 3.125μM에서 BMS-1166의 목표 농도로 희석합니다. 5.1.2단계에 설명된 대로 모든 관련 시약 레이아웃을 배치합니다.
   1. 튜브 A를 1× HBS-EP+ 러닝 버퍼 용액에 넣은 다음 유지보수 센서 칩을 꺼내고 SA 칩을 삽입합니다. 재생 스카우팅 방법을 다시 열고 5.1부터 튜브 위치를 따르고 시약 랙 2를 삽입한 다음 예상 실행 시간 동안 방법을 실행합니다 .
3. 1.6단계를 반복합니다.

CM5 칩에서 SA의 고정화
SPR 기기 및 관련 분석 소프트웨어의 출력을 통해 데이터를 분석했으며, 이는 플로우 셀 1 및 플로우 셀 2에서 SA 단백질의 목표 RU(2000RU)가 성공적으로 달성되었음을 나타냅니다. 플로우 셀 1과 2는 플로우 셀 1에서 1902.3RU(그림 1A), 플로우 셀 2에서 1900.7RU의 최종 반응으로 CM5 칩 표면에서 SA(40μg/mL)로 고정되었습니다(그림 1B).

SA 칩에서 PD-1의 고정화
SPR 기기 및 관련 소프트웨어의 출력을 기반으로 한 데이터 분석은 플로우 셀 1의 blank cell에 대해 낮은 반응 단위(RU)와 flow cell 2에서 PD-1 리간드에 대한 목표 RU(4000RU)의 성공적인 달성을 나타냈습니다. 플로우 셀 1은 블랭크로 고정되어 -161.0RU의 최종 반응을 보였으며(그림 2A), 플로우 셀 2는 SA 칩에 코팅된 비오틴화된 PD-1 단백질(10μg/mL)로 고정되어 최종 반응은 3698.5RU였습니다(그림 2B).

PD-1 및 PD-L1에 대한 재생 정찰.
재생 스카우팅은 PD-1을 플로우 셀 2에 고정하고 PD-L1을 다양한 글리신 pH 수준(1.5, 2, 2.5 및 3)에서 용액(0.1μM)에 담아 안정적인 베이스라인 및 샘플 반응을 도출하는 재생 용액을 측정하기 위해 수행했습니다. SPR 기기 및 분석 소프트웨어의 출력을 통해 데이터를 분석한 결과, 베이스라인 및 샘플 반응 모두에 대한 반응의 변화가 최소화되어 최적의 재생 조건으로 글리신(pH 2.0)이 생성되었으며, 이는 PD-1 단백질 손실이 최소화되고 칩 표면에서 PD-L1 단백질이 성공적으로 제거되었음을 나타냅니다. 글리신 pH 2.0에서 기준선 반응은 비교적 일정하게 유지되었고 분석물 반응은 안정적이었으며 실험 시작 시 반응에 가까웠으며, 이는 테스트된 4가지 글리신 pH 조건 중 가장 최적의 재생 완충액을 나타냅니다. 높은 pH는 충분하지 않고 낮은 pH는 너무 가혹합니다. pH 2.0이 가장 적합한 재생 조건으로 확인되었습니다(그림 3).

PD-1/PD-L1 상호 작용 검증
데이터는 해당 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. Kinetics/Affinity 섹션에서 "surface-bound"를 선택하고, 곡선 2-1을 선택하고, kinetics 모델을 1:1 바인딩으로 설정하고, RI 매개변수를 상수 적합으로 조정하여 association rate(ka), dissociation rate(kd) 및 equilibrium dissociation constant(KD)를 결정합니다. 다양한 농도에서 PD-L1과 PD-1의 결합 상호작용을 정량화하여 측정 가능한 반응을 생성했습니다(그림 4). 분석된 결합 매개변수에는 3.611 × 10⁴(1/Ms)의 연관률(ka), 0.0236(1/s)의 해리율(kd_{) 및} 6.536 × ^10-7M의 평형 해리 상수(KD)가 포함되었습니다.

확립된 소분자 억제제를 사용한 PD-1/PD-L1 봉쇄 분석: BMS-1166
데이터는 해당 자료를 사용하여 분석하였다. Kinetics/Affinity(역학/친화도)에서 surface-bound(표면 경계)를 선택하고 곡선 2-1을 선택한 다음 결과 및 응답 단위의 시각화된 곡선을 얻습니다. PD-1/PD-L1 결합 상호작용의 차단 효과는 HBS EP+ 완충액에서 0.11μM PD-L1 단백질과 함께 BMS-1166(0-3.125μM)에서 관찰되었습니다(그림 5). 가장 높은 반응 단위는 PD-L1 단독으로 식별되는 반면, BMS-1166 농도가 증가하면 결합 반응 단위가 비례적으로 감소합니다.

그림 1: CM5 칩에서 SA의 고정화. CM5 칩 플로우 셀 1(A) 및 플로우 셀 2(B)에서 스트렙타비딘 단백질의 고정 곡선이 표시되어 있습니다. 먼저, SA 단백질의 5개의 사전 농도가 플로우 셀 1과 2를 통해 흐른 다음 NaOH 세척 및 안정적인 기준선 설정이 수행되었습니다. 다음으로, EDC와 NHS를 첨가 한 다음 에탄올 아민 염산염 세척을 수행했습니다. 다음으로, 목표 수준(2000RU)에 도달하기 위해 PD-1의 5개 펄스를 수행한 다음, 에탄올아민 염산염 세척을 수행하여 정전기로 결합된 리간드를 제거하고 반응성이 없는 NHS-에스테르를 비활성화했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: SA 칩에서 PD-1의 고정화. (A) SA로만 코팅된 blank 플로우 셀 1 및 (B) 플로우 셀 2의 SA 칩에 있는 PD-1 단백질의 고정 곡선이 표시되어 있습니다. 블랭크(플로우 셀 1)의 경우 1M의 NaCl과 50mM의 NaOH를 3회 주입한 후 50% 이소프로판올/1M의 NaCl/50mM의 NaOH로 세척했습니다. PD-1 단백질(플로우 셀 2)의 경우 1M의 NaCl과 50mM의 NaOH를 3회 주입한 다음 PD-1 단백질의 5개 펄스를 주입하여 4000RU의 목표 수준에 도달하고 50% 이소프로판올/1M의 NaCl/50mM의 NaOH를 최종 세척했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: PD-1 및 PD-L1에 대한 재생 정찰. 시료 검사 전에 최적의 재생 용액을 결정하기 위해 pH 1.5, 2, 2.5 및 3에서 글리신을 사용한 4가지 재생 조건에 대해 기준선 및 샘플 반응을 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: PD-1/PD-L1 상호 작용 검증. 스트렙타비딘 코팅된 칩 표면에서 PD-1에 다양한 농도의 PD-L1(0.037μM, 0.111μM 및 0.333μM)의 결합 동역학. PD-L1은 PD-1과 뚜렷한 연관성(0-60초) 및 해리 단계(61-120초)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 용액에 PD-L1(0.11μM) 및 BMS-1166(0-3.125μM)이 포함된 SA 고정 CM5 칩에 코팅된 PD-1의 SPR 분석. (A) PD-1/PD-L1과 BMS-1166 사이의 결합 반응에 대한 대표적인 실시간 SPR 응답. (B) PD-1/PD-L1 상호 작용 결합 역학에 대한 백분율 차단 효과 BMS-1166. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: PD-1 단백질 고정화 전략 비교. 아민 커플 링 (A) vs. 이중 단계 Streptavidin-비오틴 커플링(B). 아민 결합은 접근 가능한 결합 부위의 제한된 가용성, 결합에 대한 입체 장애, 고정 중 PD-1 결합 부위의 잠재적 변형 등의 문제를 제시합니다. 대조적으로, 이중 단계 Streptavidin-biotin 접근법은 고정된 PD-1의 자유 결합 부위의 가용성을 향상시켜 용액 내 PD-L1과의 향상된 상호 작용을 촉진합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

지난 수십 년 동안 암 백신, 면역관문억제제, CAR T세포 요법 등 다양한 면역요법 접근법이 암 치료법을 크게 발전시켰다²¹. 면역 관문은 병원성 반응 중 면역 세포 매개 부수적 손상을 방지하고 자가면역을 억제하는 데 중요한 역할을 합니다. 대표적인 예가 PD-L1과 PD-1의 상호작용인데, PD-1은 주요 면역 관문을 형성하여 암세포가 면역 감시를 회피할 수 있도록 합니다. 단클론 항체로 PD-1/PD-L1 경로를 표적으로 하는 것은 임상 종양학에서 놀라운 성공을 거두었습니다. 그러나 단클론 항체 치료제와 관련된 한계와 면역 관련 부작용 발생률 증가로 인해 PD-1/PD-L1을 표적으로 하는 저분자 억제제 개발에 대한 관심이 높아지고 있습니다 ^9,22.

저분자 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 현재 스크리닝 전략은 주로 ELISA, 세포 기반 리포터 분석 및 T 세포 분석과 같은 생물학적 분석 기술에 중점을 두고 있습니다. SPR 및 BLI(biolayer Interferometry)를 포함한 생물물리학 기법은 결합 친화도의 특성화를 위해 널리 사용되지만, 스크리닝 도구로 사용될 가능성은 과소평가되고 있습니다²³. 이 연구는 저분자 PD-1/PD-L1 억제제 발견에 적합한 고처리량 플랫폼을 제공하는 최적화된 SPR 기반 PD-1/PD-L1 차단 분석을 개발했습니다. SA는 ~2000 RU로 고정되었고, 이어서 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 비오틴화된 PD-1(~4000 RU)이 이루어졌습니다. 이 강력한 결합은 최적의 방향으로 안전한 PD-1 코팅을 보장하여 비특이적 결합을 최소화하고 단백질 사용량(10μg/mL)을 줄였습니다. 현장 지시 고정화(site-directed immobilization)는 기존 방법에 비해 효율성을 향상시켰습니다. 글리신 완충액(pH 2.0)을 사용하여 사이클 사이에 센서 표면을 재생하여 실험적 무결성을 유지하고 비특이적 결합을 방지했습니다.

표준 면역학적 방법 및 ELISA와 비교했을 때, 이 SPR 접근법은 높은 민감도와 특이성으로 실시간 label-free 검출을 제공했습니다. 또한 120초/샘플의 런타임으로 고처리량 스크리닝을 가능하게 하고 PD-1/PD-L1 표적 화합물 및 생물학적 제제의 차단 효율을 평가할 때 생물학적 분석을 보완합니다. 달성된 고정 수준은 이전 플랫폼(3698.5RU 대 3688.5RU)과 유사했으며 PD-1/PD-L1 상호 작용 친화도(KD = 6.536 × ^10-7M 대 1.295 × ^10-7M )였습니다. BMS-1166 억제제는 더 낮은 농도에서 더 높은 해리율을 보였으며, 이전 플랫폼과 유사한 차단 효과(3.125μM에서 99.8% 대 94.2%)를 보였습니다. BMS-1166은 HTRF 및 세포 기반 분석에서 각각 1.4nM 및 96nM의 IC₅₀ 값이 지원하는 PD-1/PD-L1 봉쇄 속도를 보여주었습니다²⁴. 또한, 다른 연구에서는 HTRF 및 면역 관문 봉쇄 공동 배양 분석 방법을 사용하여 3.9nM 및 1574nM의 IC₅₀ 값을 보고했습니다²⁵. 이전 결과는 BMS-1166의 IC₅₀ 값이 85.4nM임을 보여주었으며, 이는 이러한 초기 발견과 일치합니다¹⁸. 이 스크리닝 플랫폼의 또 다른 장점은 견고함과 높은 처리량입니다. 이 방법은 384웰 플레이트 형식을 사용하는 고처리량 스크리닝에 광범위하게 적용되었으며, BMS-1166 및 BMS-202는 10개 샘플마다 양성 대조군으로 포함되었습니다. 봉쇄율 범위는 10nM(n=플레이트당 11)에서 BMS-1166의 경우 29.8%-38.1%, BMS-202의 경우 6.0%-10.4%였습니다.

DMSO는 국소 구성 및 구조에 따라 이질적인 생물학적 막에 다양한 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 막 관련 생물학적 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 상대적으로 낮은 농도에서 DMSO는 용액의 단백질 특성을 변경하여 변성, 응집 또는 분해를 유발할 수 있습니다. 또한, DMSO는 단백질^26,27의 겉보기 결합 특성을 변형시킬 수 있습니다. 또한 DMSO 간섭에 대한 이전의 우려를 해결하기 위해 이 프로토콜에서 DMSO 농도를 0.003%(이전 플랫폼에서는 0.01% DMSO가 사용됨)로 줄였습니다.

이전 연구에서 PD-1 단백질은 EDC/NHS 화학을 사용하여 칩의 카르복시메틸기를 활성화하고 PD-1의 아민기와 공유 결합을 형성하는 아민 커플링을 사용하여 센서 칩에 고정되었습니다. PD-1의 288개 아미노산에 걸쳐 여러 아민기가 존재하기 때문에 이 방법은 본질적으로 임의의 방향을 초래합니다. 보다 구체적인 방향을 달성하기 위해 이 연구에서는 비오틴화된 인간 PD-1(Fc, Avitag)과 포획 결합 전략을 사용했습니다. Avitag의 단일 lysine 잔류물은 PD-1의 Fc 영역에서 효소를 통해 비오틴화되어 비오틴과 스트렙타비딘 간의 높은 친화성 상호 작용을 통해 정확한 고정을 가능하게 합니다(그림 6). 이론적으로 이 접근 방식은 PD-1의 가변 영역이 노출된 상태로 유지되도록 하여 버퍼에서 PD-L1과의 최적의 상호 작용을 촉진합니다. 그러나 이러한 가정을 위해서는 단백질 배향을 확인하기 위해 Cryo-EM 또는 결정학과 같은 기술을 사용한 추가 검증이 필요합니다.

글리신 2.0은 가벼운 재생 완충액으로 사용되어 고정된 PD-1을 감소시키지 않고 PD-L1을 효과적으로 제거했습니다. 그러나 단단히 결합된 억제제 또는 단백질 응집체의 경우 후속 샘플과의 간섭을 방지하기 위해 0.5% SDS 또는 50-100mM의 NaOH와 같은 더 강력한 재생 완충액이 필요할 수 있습니다.

이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, SPR 계측의 높은 비용으로 인해 접근성이 제한될 수 있지만, 이 프로토콜은 종종 유사한 기능을 가진 다른 SPR 시스템에 맞게 조정될 수 있습니다. 단백질 농도 및 결합/해리 시간과 같은 매개변수는 특정 SPR 플랫폼에 맞게 조정할 수 있습니다. 또 다른 한계는 재조합 단백질에 의존한다는 것인데, 이는 네이티브 단백질 상호 작용을 완전히 복제하지 못할 수 있습니다. SPR 데이터를 해석하고 결과를 세포 기반 분석 또는 생체 내 모델과 같은 보완 기술과 비교할 때 이러한 요소를 고려해야 합니다.

이러한 한계에도 불구하고 최적화된 SPR 방법은 PD-1/PD-L1 상호 작용의 저분자 억제제를 스크리닝하기 위한 빠른 실시간, 고처리량 및 label-free 접근법을 제공합니다. PD-1/PD-L1 상호작용을 표적으로 하는 소분자 및 생물학적 제제를 특성화하기 위한 생물물리학적 기술을 크게 향상시킵니다. 민감도가 높은 이 플랫폼은 면역 관문 상호 작용 및 광범위한 단백질-단백질 상호 작용(PPI)을 연구하는 데 특히 유용하므로 PPI 약물 발견을 진전시키기 위한 강력한 도구입니다.

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저자들은 미국 국립보건원(NIH) 산하 기관인 국립연구자원센터(National Center for Research Resources, NCRR)의 그랜트 P20GM103430(Grant )의 지원을 받는 로드아일랜드대학교(University of Rhode Island)의 RI-INBRE 핵심 시설을 인정한다. 이 연구는 로드 아일랜드 대학교 약학 대학의 파일럿 그랜트 상, 로드 아일랜드 생명 과학 허브(RILSH)의 소규모 그랜트 상, 로드 아일랜드 재단 보조금의 지원을 받았으며, 모두 Chang Liu 박사에게 수여되었습니다.