Sitrik Asit Solunması Yoluyla Öksürük Aşırı Duyarlılığı Olan Bir Fare Modelinin Kurulması

Bu protokol, kronik öksürük mekanizmalarını incelemek için ideal bir model olarak hizmet edebilecek öksürük aşırı duyarlılığına sahip bir fare modelinin geliştirilmesini açıklar.

Öksürük, birçok solunum yolu hastalığının en yaygın semptomlarından biridir. Kronik öksürük yaşam kalitesini önemli ölçüde etkilemekte ve önemli bir ekonomik yük getirmektedir. Artan öksürük duyarlılığı, kronik öksürüğün patofizyolojik bir özelliğidir. Öksürük aşırı duyarlılığının hava yolu iltihabı, hava yolu duyu sinirlerinin yeniden şekillenmesi ve merkezi sinir sistemindeki değişiklikler ile ilişkili olduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, kesin moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve uygun hayvan modelleri kullanılarak daha fazla açıklama gerektirmektedir. Önceki çalışmalar, öksürüğü incelemek için model olarak kobayları kullanmıştır, ancak bu modeller, yüksek maliyetler, transgenik araçların eksikliği ve ticari reaktiflerin kıtlığı dahil olmak üzere çeşitli deneysel sınırlamalar sunmaktadır. Ek olarak, kobaylar uyaranlara maruz kaldıklarında tipik olarak zayıf çevresel tolerans ve yüksek ölüm oranı sergilerler. Buna karşılık, fareler daha küçük, bakımı daha kolay, daha uygun maliyetli ve genetik manipülasyona uygundur, bu da onları mekanik araştırmalar için daha uygun hale getirir. Bu çalışmada, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığı olan bir fare modeli oluşturduk. Bu modelin kullanımı kolaydır ve tekrarlanabilir sonuçlar verir, bu da onu kronik öksürük için mekanizmalar ve potansiyel yeni tedaviler hakkında daha ileri çalışmalar için değerli bir araç haline getirir.

Öksürük, solunum salgılarını veya yabancı maddeleri hava yolundan temizlemeye yardımcı olan çok önemli bir savunma refleksidir. Bununla birlikte, aynı zamanda birçok solunum yolu hastalığının en yaygın semptomlarından biridir ve genellikle hastaları tıbbi yardım almaya sevk eder¹. Erişkinlerde 8 haftadan uzun süren inatçı öksürük olarak tanımlanan kronik öksürük, yaşam kalitesini önemli ölçüde etkileyerek idrar kaçırma, uykusuzluk, reflü ve diğer hoş olmayan deneyimler gibi sorunlara ve önemli bir ekonomik yüke neden olmaktadır ^2,3,4. Artan öksürük duyarlılığının, düşük seviyelerde termal, mekanik ve kimyasal tahriş edici maddelerin öksürüğü tetikleyebileceği kronik öksürüğün patofizyolojik bir özelliği olduğuna yaygın olarak inanılmaktadır⁵. Öksürük aşırı duyarlılığı, hava yolu iltihabı⁶, hava yolu duyusal sinirlerinin yeniden şekillenmesi⁷ ve merkezi sinir sistemindeki^{değişiklikler 8} ile ilişkilidir, ancak kesin moleküler mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır ve uygun hayvan modelleri aracılığıyla daha fazla açıklama gerektirmektedir.

Gine domuzları, kediler, tavşanlar, köpekler ve domuzlar dahil olmak üzere çeşitli hayvanlar öksürük mekanizmalarını incelemek için kullanılmıştır⁹. Gine domuzları geleneksel olarak öksürük mekanizmalarını ve antitussif ilaçların etkinliğini incelemek için en uygun model olarak kabul edilmiştir ^9,10,11,12. Bununla birlikte, bu modellerin yüksek maliyetler, transgenik araçların eksikliği ve ticari reaktiflerin kıtlığı dahil olmak üzere çeşitli deneysel sınırlamaları vardır. Ek olarak, kobaylar uyaranlara maruz kaldıklarında genellikle zayıf çevresel tolerans ve yüksek ölüm oranı sergilerler. Buna karşılık, fareler daha küçük, bakımı daha kolay, daha uygun maliyetli ve genetik manipülasyona uygundur, bu da onları mekanik araştırmalar için daha uygun hale getirir. Öksürük modelleri üzerine yapılan önceki çalışmalar, esas olarak antitussif ilaçların ve periferik mekanizmaların etkinliğini değerlendirmek için kullanılan hava yolu inflamasyonunun neden olduğu öksürüğe odaklanmıştır^13,14. Şu anda öksürük aşırı duyarlılığı için hayvan modelleri eksikliği vardır.

Yanıt olarak, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığının bir fare modelini oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu model, diğer hayvan modellerine kıyasla daha basit, yapımı daha kolay ve daha uygulanabilirdir.

Tüm hayvan deney prosedürleri, Guangzhou Tıp Üniversitesi (20230656) Birinci Bağlı Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada 8-10 haftalık ve 20-25 g ağırlığında yetişkin erkek spesifik patojen içermeyen C57BL / 6 fareler kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Kimyasal reaktif hazırlama

1. Sitrik asit (CA) çözeltisi hazırlama
   1. Öksürük değerlendirmesi için, 3.84 g sitrik asit tozunu normal salin içinde 50 mL'lik bir nihai hacme çözerek 0.4 M'lik bir çözelti hazırlayın.
   2. Hayvan muamelesi için, 9.6 g sitrik asit tozunu normal tuzlu su içinde 500 mL'lik bir nihai hacme çözerek 0.1 M'lik bir çözelti hazırlayın.
2. Kapsaisin çözeltisi hazırlama
   1. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için% 10 etanol ve% 10 Tween-80 içeren PBS'de 30.5 mg kapsaisin tozunu çözün.
   2. 100 μM'lik bir çalışma çözeltisi elde etmek için stok çözeltisini normal tuzlu suda 1:100 oranında seyreltin.
3. Metakolin çözeltisi hazırlama
   1. 50 mg / mL'lik bir çözelti yapmak için 100 mg metakolin tozunu PBS'de 2 mL'lik bir nihai hacme çözün.
   2. 25 mg / mL, 12.5 mg / mL, 6.25 mg / mL ve 3.125 mg / mL konsantrasyonlar elde etmek için bu çözeltiyi PBS ile seyreltin.

2. Hayvan hazırlama

1. Barınma koşulları
   1. Yiyecek ve suya serbest erişimi olan kafeslerdeki ev fareleri, standart 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsü ile 22 ± 1 °C sıcaklıkta tutulur. Deneysel manipülasyonlar, beslenme ortamına alıştıktan 1 hafta sonra gerçekleştirildi.
2. İklimlendirme
   1. Deneysel manipülasyonlar yapmadan önce farelerin 1 hafta boyunca beslenme ortamına alışmasına izin verin.

3. Modelin geliştirilmesi

1. Grup ödevi
   1. Fareleri rastgele bir model grubuna ve bir kontrol grubuna bölün ve her grupta 8 fare bulun.
2. Pozlama kurulumu
   1. Fareleri, her biri ultrasonik bir nebülizöre bağlı iki bağımsız odaya (Şekil 1'de gösterildiği gibi) yerleştirin.
   2. Model grubunu 0.1 M sitrik asit (CA) aerosolüne ve kontrol grubunu 0.9 hafta boyunca günde 3 saat boyunca 3 mL / dk'lık bir atomizasyon hızında% 2 normal salin (NS) aerosolüne maruz bırakın ( Şekil 2'de gösterildiği gibi). Her maruziyetten sonra fareleri kafeslerine geri koyun.
3. Öksürük duyarlılığı değerlendirmesi
   1. Son maruziyetten sonra, refleksif öksürüğü (NS, CA (0.4 M) ve kapsaisin (100 μM) ile zorlanan) ve spontan öksürüğü (herhangi bir zorluk olmadan) değerlendirerek öksürük duyarlılığını değerlendirin.
      NOT: Model geliştirme sırasında öksürük duyarlılığındaki dinamik değişiklikleri izlemek için 0, 3, 7 ve 10. günlerde bir CA (0.4 M) zorluğu kullanarak öksürük duyarlılığını değerlendirin.

4. Öksürük duyarlılığı değerlendirmesi

1. Enstrüman hazırlığı
   1. Öksürük duyarlılığını ölçmek için non-invaziv bir tüm vücut pletismografi (WBP) sistemi kullanın. Odaları, akış dönüştürücülerini, önyargı akışını ve diğer bileşenleri uygulama kılavuzuna göre bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Kalibre Et düğmesine tıklayarak doğru ölçümleri sağlamak için bir kalibrasyon işlemi gerçekleştirin. Bir durum ekranı ilerlemeyi gösterecek ve durum çubuğu %100'e ulaştığında kalibrasyon tamamlanacaktır.
2. Öksürük tespiti
   1. Fareler için bir öksürük çalışması oluşturun ve parametreleri 1 dakika alışma, 10 dakika yanıt süresi ve 10 dakika kimyasal çözelti iletimi için yapılandırın.
   2. Bilinçli fareleri ayrı bölmelere yerleştirin ve oda başına yalnızca bir fare olduğundan emin olun.
      NOT: Kuyruğuna ve parmaklarına zarar vermemek için kapağı kapatmadan önce farenin haznenin içinde olduğundan emin olun.
   3. Nebülizöre 1 mL kimyasal çözelti (NS, CA veya kapsaisin) ekleyin.
      NOT: Her biri üç fazdan oluşan öksürük olaylarının sayısı: inspiratuar, kompresyon ve ekspulsif¹⁵ ( Şekil 3'te gösterildiği gibi) - çalışma başladıktan sonra kaydedilecektir. 10 dakikalık kayıttan sonra öksürük tespiti tamamlanacaktır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her bir hayvanı tespit ettikten sonra hazneyi temizleyin.

5. Havayolu Aşırı Duyarlılığı (AHR) ölçümü

1. Enstrüman hazırlığı
   1. Aletleri adım 4.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
2. AHR ölçümü
   1. Fareler için bir doz-yanıt çalışması oluşturun, ölçüm türlerini, parametreleri ve görev sırasını yapılandırın: iklimlendirme için 1 dakika, metakolin çözeltisi iletimi için 30 saniye, yanıt süresi için 3 dakika ve kurtarma için 1 dakika.
   2. Bilinçli fareleri ayrı bölmelere yerleştirin ve oda başına yalnızca bir fare olduğundan emin olun.
   3. Nebulizatöre 50 μL kimyasal çözelti (PBS veya metakolin) ekleyin ve çalışmayı başlatın.
   4. Farklı metakolin konsantrasyonlarına (0 mg / mL, 3.125 mg / mL, 6.25 mg / mL, 12.5 mg / mL, 25 mg / mL, 25 mg / mL, 50 mg / mL) yanıt olarak bronkokonstriksiyonun bir göstergesi olan Penh'in değerini kaydedin.

6. Bronkoalveoler lavaj toplama

1. Kurban
   1. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla uygulanan pentobarbital sodyum (50 mg / kg) ile hiperanestezi kullanarak fareleri sakit edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
2. Numune toplama
   1. Farenin orbital sinüsünden kanı 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın, ardından tüpü buzun üzerine yerleştirin. Kanı 3000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı toplamak için bir pipet kullanın, ayırın ve -80 °C'de saklayın.
   2. Trakeayı açığa çıkarmak için göğsü açarak, trakeaya 22 G'lik bir kalıcı iğne sokarak, ardından 0.5 mL önceden soğutulmuş PBS ile üç kez lavaj yaparak ve sıvıyı toplayarak bronkoalveoler lavaj sıvısını (BALF) toplayın.
   3. Toplandıktan sonra, BALIF'ı 500 °C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın, ayırın ve -80 °C'de saklayın. Peleti 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin ve daha fazla analiz için hücre yaymalarını hazırlayın.
   4. Akciğerleri açığa çıkarmak için göğsü açarak, akciğer dokularını çıkararak ve bunları kriyojenik şişelere yerleştirerek akciğer dokularını toplayın. Gelecekteki çalışmalar için şişeleri -80 ° C'de saklayın.

7. Kantitatif RT-PCR

1. TRIzol reaktifi kullanarak akciğer dokusundan toplam RNA'yı çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir Birinci iplikli cDNA sentez kiti kullanarak cDNA sentezi gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
2. SYBR yeşil floresan kullanarak gerçek zamanlı kantitatif bir PCR tespit sisteminde PCR gerçekleştirin. Bağıl SP ve CGRP mRNA ekspresyonunun nicelleştirilmesini β-Aktin⁹ ekspresyonuna normalleştirin.

8. İstatistiksel analiz

1. Verileri ortalama ± SEM olarak sunun. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul ederek iki grup arasındaki verileri karşılaştırmak için bir t-testi kullanın. İstatistik ve grafik yazılımı kullanarak tüm istatistiksel analizleri yapın.

Şekil 4A'da gösterildiği gibi, model grubundaki (CA grubu) öksürük duyarlılığı, kontrol grubuna (NS grubu) kıyasla 1 haftalık maruziyetten sonra önemli ölçüde artmıştır ve bu yüksek duyarlılık maruziyet süresi boyunca devam etmiştir. Ne kontrol grubu ne de model grubu fareleri, modelleme işlemi sırasında mortalite yaşamamıştır (Şekil 4B). Şekil 4C ve Şekil 4D, maruziyet sonrası model grubunda spontan öksürük olaylarının sayısının önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Ek olarak, NS (Şekil 4E ve Şekil 4F), CA (Şekil 4G ve Şekil 4H) ve kapsaisin (Şekil 4I ve Şekil 4J) tarafından ortaya çıkan öksürük duyarlılığı, maruziyet süresinden sonra model grubunda önemli ölçüde daha yüksekti.

Şekil 5A,B'de, iki grupta bronkoalveoler lavaj sıvısındaki (BALF) toplam inflamatuar hücre sayısı ve diferansiyel hücre sayısı açısından anlamlı bir fark yoktu. Şekil 5C, D, H & E boyamalı BALF hücrelerini göstermektedir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, modelleme sonrası model ve kontrol grupları arasında hava yolu aşırı duyarlılığı açısından anlamlı bir fark yoktu. Ek olarak, akciğer dokusunda nörojenik inflamatuar mediatörler olan CGRP ve SP'nin ekspresyon seviyeleri QPCR ile değerlendirildi. Sonuçlar, model grubunda SP ekspresyonunda anlamlı bir artış olduğunu gösterirken (Şekil 7A), iki grup arasında CGRP ekspresyonunda anlamlı bir fark gözlenmedi (Şekil 7B).

Şekil 1: Fare modeli için pozlama odası. Pozlama odası, 36 cm x 20 cm x 25 cm boyutlarında akrilik camdan yapılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Öksürük aşırı duyarlılığına sahip fare modelinin şeması. Sitrik asit inhalasyonu yoluyla öksürük aşırı duyarlılığı olan bir fare modelinin kurulmasının şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir öksürük olayının temsili görüntüleri. Non-invaziv bir tüm vücut pletismografi sistemi tarafından kaydedilen bir öksürük olayının temsili görüntüleri. Öksürük olayı üç aşamadan oluşur: (a) inspiratuar, (b) sıkıştırıcı ve (c) itici. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Fare modelinde öksürük değerlendirmesi. (A) 14 günlük maruz kalma süresi boyunca 0,4 M sitrik asidin ortaya çıkardığı öksürük olayları. Sitrik asit (CA) grubundaki öksürük duyarlılığı, 7 günlük maruziyetten sonra kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksekti. (B) Modelleme sürecinde kontrol ve model gruplarının hayatta kalma eğrileri. (C-J) Modelleme öncesi ve sonrası normal salin (NS) (E,F), sitrik asit (G,H) ve kapsaisin (I,J) ile ortaya çıkan spontan öksürük olayları (C,D) ve öksürük olayları. Veriler, NS grubuna kıyasla ortalama ± SEM, ***P < 0.001 olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Bronkoalveoler lavaj sıvısındaki (BALF) lökosit sayımı. (A) BALB'deki toplam lökosit sayısı. (B) BALF'deki diferansiyel hücre sayımları. Veriler ortalama ± SEM olarak temsil edilir. (C, D) H&E boyama ile BALF hücrelerinin temsili görüntüleri. Oklar makrofajları (turuncu), nötrofilleri (mavi) ve lenfositleri (yeşil) gösterir. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: CA ve NS gruplarında hava yolu direnci. Sitrik asit (CA) grubunda normal salin (NS) grubuna kıyasla hava yolu direnci. Veriler, SEM ± ortalama olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Akciğer dokusunda SP ve CGRP'nin mRNA ekspresyon seviyeleri. (A) Akciğer dokusundaki P (SP) maddesinin nispi mRNA ekspresyon seviyeleri. (B) Akciğer dokusunda kalsitonin geni ile ilişkili peptidin (CGRP) nispi mRNA ekspresyon seviyeleri. Veriler, NS grubuna kıyasla ortalama ± SEM, *P < 0.05 olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığı olan bir fare modelini başarıyla oluşturmuştur. Bu model, sitrik asit ve kapsaisin tarafından ortaya çıkan hem spontan öksürükler hem de refleksif öksürükler için öksürük duyarlılığında güvenilir bir artış göstermiştir. Sitrik asit ve kapsaisin, öksürük refleks duyarlılığını değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁶.

Bu protokoldeki birkaç kritik adım, etkinliğini sağlar. İlk olarak, deneyler için kullanılan maruz kalma odası tamamen hava geçirmez olmamalıdır. Uygun havalandırmayı sağlamak için, odanın arkasına havalandırma delikleri yerleştirilmelidir. İkinci olarak, oda içinde aşırı kalabalıktan kaçınmak önemlidir; Fare sayısının 10-12 ile sınırlandırılması olası izdihamları önler. Üçüncüsü, maruziyet sonrası bakım çok önemlidir: her maruziyetten sonra, kürklerinde kalan sıvıyı çıkarmak için fareler ılık hava ile kurutulmalıdır.

Gine domuzları geleneksel olarak öksürük mekanizmalarını incelemek ve antitussif ilaçları değerlendirmek için kullanılırken, fare modelleri çeşitli avantajlar sunar. Önceki çalışmalar, sitrik asit maruziyetinin neden olduğu öksürük aşırı duyarlılığının kobay modellerini geliştirmiştir. Örneğin, Nakaji ve ark. kobayları 10 dakika boyunca, 2 hafta boyunca haftada üç kez (toplam sekiz maruziyet) 0.5 M sitrik aside maruz ^bıraktı17. Benzer şekilde, Xu ve arkadaşları tarafından yapılan başka bir çalışma, kobayların 25 gün boyunca 0.4 M sitrik asit solumasını sağlayarak öksürük duyarlılığı artmış bir model oluşturdu¹⁸. Bununla birlikte, bu kobay modelleri, mevcut fare modeline kıyasla daha az belirgin öksürük duyarlılığı sergiledi. Ek olarak, kobay modelleri, öksürük aşırı duyarlılığında moleküler mekanizmaların incelenmesini engelleyen transgenik araçların ve ticari reaktiflerin eksikliği gibi sınırlamalarla karşı karşıyadır.

Öte yandan farelerin bakımı daha kolaydır, daha uygun maliyetlidir ve genetik manipülasyona uygundur. Önceki çalışmalar, farelerin öksürük ^15,19,20,21 çalışması için de etkili modeller olduğunu göstermiştir. Ek olarak, fareler sinirbilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılır ve öksürük aşırı duyarlılığının merkezi mekanizmalarını incelemek için bir avantaj sağlar. Bu nedenle, farelerin kronik öksürüğün mekanik araştırmaları için daha uygun olduğu düşünülmektedir.

Modelin başarılı bir şekilde kurulmasına rağmen, dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, sitrik asit, gıda, ilaç, kimya ve metalurji endüstrilerinde yaygın olarak kullanılmasına rağmen^22,23, insanlarda öksürük aşırı duyarlılığı ile sonuçlanan gerçek hayattaki maruz kalma koşullarını doğru bir şekilde taklit etmez. İkincisi, bu modeldeki öksürük aşırı duyarlılığının kesin mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Pulmoner inflamasyon, artmış öksürük duyarlılığının^potansiyel bir aracısı olarak kabul edilirken6, bronkoalveoler lavaj sıvısındaki (BALF) toplam inflamatuar hücre sayımlarının ve diferansiyel hücre sayımlarının değerlendirilmesi iki grup arasında anlamlı bir değişiklik göstermedi. Ek olarak, kronik öksürük^24'ün bilinen bir tetikleyicisi olan bronşiyal aşırı duyarlılık, 14 günlük maruziyetten sonra model ve kontrol grupları arasında hava yolu direncinde anlamlı bir fark göstermedi.

Sonuç olarak, sitrik asidin (CA) sürekli solunması yoluyla öksürük aşırı duyarlılığı olan bir fare modeli kurulmuştur. Bu modelin kullanımı kolaydır ve tekrarlanabilir sonuçlar verir, bu da onu kronik öksürük için mekanizmalar ve potansiyel yeni tedaviler hakkında daha ileri çalışmalar için değerli bir araç haline getirir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC 82100034), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Planlama Projesi (202102010168) tarafından desteklenmiştir.