该方案描述了咳嗽超敏反应小鼠模型的开发，该模型可以作为研究慢性咳嗽机制的理想模型。

咳嗽是许多呼吸系统疾病最常见的症状之一。慢性咳嗽严重影响生活质量，并造成相当大的经济负担。咳嗽敏感性增加是慢性咳嗽的病理生理学标志。据观察，咳嗽超敏反应与气道炎症、气道感觉神经重塑和中枢神经系统改变有关。然而，确切的分子机制仍不清楚，需要使用合适的动物模型进一步阐明。以前的研究使用豚鼠作为研究咳嗽的模型，但这些模型存在一些实验局限性，包括成本高、缺乏转基因工具和缺乏商业试剂。此外，豚鼠在受到刺激时通常表现出较差的环境耐受性和高死亡率。相比之下，小鼠体型更小、更易于维护、更具成本效益且适合基因作，使其更适合机械研究。在这项研究中，我们建立了一个通过连续吸入柠檬酸 （CA） 出现咳嗽超敏反应的小鼠模型。该模型作简单，结果可重复，使其成为进一步研究慢性咳嗽机制和潜在新治疗方法的宝贵工具。

咳嗽是一种重要的防御性反射，有助于清除气道中的呼吸道分泌物或异物。然而，它也是许多呼吸系统疾病最常见的症状之一，经常促使患者就医¹。慢性咳嗽，定义为成人持续咳嗽超过 8 周，会严重影响生活质量，导致失禁、失眠、反流和其他不愉快的经历等问题，以及巨大的经济负担 ^2,3,4。人们普遍认为，咳嗽敏感性增加是慢性咳嗽的病理生理学标志，其中低水平的热、机械和化学刺激物会引发咳嗽⁵。咳嗽超敏反应与气道炎症⁶ （airway inflammation）、气道感觉神经重塑⁷ （remodification of airway sensory nerves） 和中枢神经系统改变⁸ （changes in the central nervous system） 有关，但确切的分子机制尚不清楚，需要通过合适的动物模型进一步阐明。

各种动物，包括豚鼠、猫、兔子、狗和猪，已被用于研究咳嗽⁹ 的机制。豚鼠传统上被认为是研究咳嗽机制和镇咳药疗效的最合适模型 9,10,11,12。然而，这些模型存在一些实验局限性，包括成本高、缺乏转基因工具和缺乏商业试剂。此外，豚鼠在受到刺激时通常表现出较差的环境耐受性和高死亡率。相比之下，小鼠体型更小、更易于维护、更具成本效益且适合基因作，使其更适合机械研究。以前关于咳嗽模型的研究主要集中在气道炎症诱导的咳嗽上，主要用于评价镇咳药的疗效和外周机制^13,14。目前缺乏咳嗽超敏反应的动物模型。

作为回应，我们介绍了一种通过连续吸入柠檬酸 （CA） 建立咳嗽超敏反应小鼠模型的方法。与其他动物模型相比，该模型更简单、更容易构建且更可行。

所有动物实验程序均经广州医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会 （20230656） 批准。本研究使用成年雄性无特异性病原体的 C57BL/6 小鼠，年龄 8-10 周，体重 20-25 g。所用试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 化学试剂制备

1. 柠檬酸 （CA） 溶液制备
   1. 对于咳嗽评估，通过将 3.84 g 柠檬酸粉溶解在生理盐水中至最终体积为 50 mL 来制备 0.4 M 溶液。
   2. 对于动物处理，通过将 9.6 g 柠檬酸粉末溶解在生理盐水中至最终体积为 500 mL 来制备 0.1 M 溶液。
2. 辣椒素溶液制备
   1. 将 30.5 mg 辣椒素粉末溶于含有 10% 乙醇和 10% 吐温-80 的 PBS 中，制成 10 mM 储备溶液。
   2. 用生理盐水以 1：100 的比例稀释储备液，制成 100 μM 的工作溶液。
3. 乙酰甲胆碱溶液制备
   1. 将 100 mg 乙酰甲胆碱粉末溶于 PBS 中，最终体积为 2 mL，制成 50 mg/mL 溶液。
   2. 用 PBS 稀释该溶液，得到 25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL 和 3.125 mg/mL 的浓度。

2. 动物准备

1. 住宿条件
   1. 笼子里的家鼠可以自由获取食物和水，保持在 22 ± 1 °C 的温度下，具有标准的 12 小时光照/黑暗循环。在适应摄食环境 1 周后进行实验作。
2. 服水土
   1. 在进行实验作之前，让小鼠适应摄食环境 1 周。

3. 模型的开发

1. 组分配
   1. 将小鼠随机分为模型组和对照组，每组 8 只小鼠。
2. 曝光设置
   1. 将小鼠放在两个独立的腔室中（如图 1 所示），每个腔室都连接到超声波雾化器。
   2. 将模型组暴露于 0.1 M 柠檬酸 （CA） 气雾剂中，对照组以 3 mL/min 的雾化速率每天 2 小时暴露于 0.9% 生理盐水 （NS） 气雾剂中，持续 2 周（如图 2 所示）。每次暴露后将小鼠放回笼子。
3. 咳嗽敏感性评估
   1. 最后一次暴露后，通过评估反射性咳嗽（用 NS、CA （0.4 M） 和辣椒素 （100 μM） 攻击）和自发性咳嗽（没有任何攻击）来评估咳嗽敏感性。
      注：为了在模型开发过程中监测咳嗽敏感性的动态变化，请使用 CA （0.4 M） 激发评估第 0 天、第 3 天、第 7 天和第 10 天的咳嗽敏感性。

4. 咳嗽敏感性评估

1. 仪器准备
   1. 使用无创全身体积描记法 （WBP） 系统测量咳嗽敏感性。根据应用手册连接腔室、流量传感器、偏置流和其他组件（参见 材料表）。
   2. 单击 Calibrate 按钮执行校准过程以确保准确测量。状态屏幕将显示进度，一旦状态栏达到 100%，校准即完成。
2. 咳嗽检测
   1. 为小鼠创建咳嗽研究，并配置 1 分钟的驯化、10 分钟的响应时间和 10 分钟的化学溶液输送参数。
   2. 将清醒的小鼠放入单独的腔室中，确保每个腔室只有一只老鼠。
      注意： 在合上盖子之前，请确保鼠标完全在腔室内，以免损坏其尾巴和手指。
   3. 向雾化器中加入 1 mL 化学溶液（NS、CA 或辣椒素）。
      注意：咳嗽事件的数量——每个事件由三个阶段组成：吸气、压迫和排出¹⁵ （如图 3 所示）——将在研究开始后记录。录制 10 分钟后，咳嗽检测将完成。检测每只动物后清洁腔室，以避免交叉污染。

5. 气道高反应性 （AHR） 测量

1. 仪器准备
   1. 按照步骤 4.1 中的说明准备仪器。
2. AHR 测量
   1. 为小鼠创建剂量反应研究，配置测量类型、参数和任务序列：1 分钟用于驯化，30 秒用于乙酰甲胆碱溶液输送，3 分钟用于响应时间，1 分钟用于恢复。
   2. 将清醒的小鼠放入单独的腔室中，确保每个腔室只有一只老鼠。
   3. 向雾化器中加入 50 μL 化学溶液（PBS 或乙酰甲胆碱）并开始研究。
   4. 记录不同浓度的乙酰甲胆碱（0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL）的 Penh 值。

6. 支气管肺泡灌洗液采集

1. 牺牲
   1. 使用戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 的超麻醉处死小鼠， 通过 腹膜内注射 （遵循机构批准的方案）。
2. 样本采集
   1. 将小鼠眼眶窦的血液收集到 1.5 mL 微量离心管中，然后将管子放在冰上。在 4°C 下以 3000 x g 离心血液 10 分钟。 使用移液管收集上清液，分装，并将其储存在 -80 °C。
   2. 通过打开胸部露出气管，将 22 G 留置针插入气管，然后用 0.5 mL 预冷的 PBS 灌洗 3 次并收集液体来收集支气管肺泡灌洗液 （BALF）。
   3. 收集后，将 BALF 在 4 °C 下以 500 x g 离心 10 分钟。 收集上清液，分装，并储存在 -80 °C。 将沉淀重悬于 100 μL PBS 中，并准备细胞弥散条带以供进一步分析。
   4. 通过打开胸部露出肺部，取出肺组织并将其放入低温小瓶中来收集肺组织。将小瓶储存在 -80 °C 以备将来研究。

7. 定量 RT-PCR

1. 使用 TRIzol 试剂从肺组织中提取总 RNA。按照制造商的说明，使用第一链 cDNA 合成试剂盒进行 cDNA 合成（参见 材料表）。
2. 使用 SYBR 绿色荧光在实时定量 PCR 检测系统中进行 PCR。将相对 SP 和 CGRP mRNA 表达的定量标准化为 β-肌动蛋白⁹ 的表达。

8. 统计分析

1. 将数据表示为 SEM ±平均值。使用 t 检验 比较两组之间的数据，认为 P < 0.05 具有统计学意义。使用统计和绘图软件进行所有统计分析。

如图 4A 所示，与对照组 （NS 组） 相比，模型组 （CA 组） 在暴露 1 周后咳嗽敏感性显著增加，并且这种升高的敏感性在整个暴露期间持续存在。对照组和模型组小鼠在建模过程中均未经历死亡（图 4B）。图 4C 和 图 4D 表明，暴露后模型组中自发性咳嗽事件的数量显着增加。此外，暴露期后，NS（图 4E 和 图 4F）、CA（图 4G 和 图 4H）和辣椒素（图 4I 和 图 4J）在模型组中引起的咳嗽敏感性要高得多。

在图 5A、B 中，两组在支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中炎症细胞总数和差异细胞计数方面没有显着差异。图 5C，D 显示了 H&E 染色的 BALF 细胞。如图 6 所示，建模后模型组和对照组之间的气道高反应性没有显着差异。此外，通过 QPCR 评估肺组织中神经源性炎症介质 CGRP 和 SP 的表达水平。结果表明模型组 SP 表达显著增加（图 7A），而两组之间未观察到 CGRP 表达的显著差异（图 7B）。

图 1：小鼠模型的曝光室。 曝光室由丙烯酸玻璃制成，尺寸为 36 厘米 x 20 厘米 x 25 厘米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：咳嗽超敏反应小鼠模型示意图。 通过吸入柠檬酸建立咳嗽超敏反应小鼠模型的示意图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：咳嗽事件的代表性图像。 无创全身体积描记系统记录的咳嗽事件的代表性图像。咳嗽事件包括三个阶段：（a） 吸气性，（b） 压迫性和 （c） 排出性。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：小鼠模型中的咳嗽评估。（A） 在 14 天的暴露期内由 0.4 M 柠檬酸引起的咳嗽事件。暴露 7 天后，柠檬酸 （CA） 组的咳嗽敏感性显著高于对照组。（B） 建模过程中对照组和模型组的生存曲线。（CJ）建模前后生理盐水 （NS） （E，F） 、柠檬酸 （G、H） 和辣椒素 （I，J） 引发的自发性咳嗽事件 （C，D） 和咳嗽事件。数据表示为 SEM 的平均值 ± ***P 与 NS 组相比< 0.001。请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中的白细胞计数。 （A） BALF 中白细胞的总数。（B） BALF 中的差异细胞计数。数据表示为 SEM ±平均值。（C、D） H&E 染色的 BALF 细胞的代表性图像。箭头表示巨噬细胞（橙色）、中性粒细胞（蓝色）和淋巴细胞（绿色）。比例尺：50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 6：CA 和 NS 组的气道阻力。 柠檬酸 （CA） 组与生理盐水 （NS） 组相比的气道阻力。数据表示为 SEM ±平均值。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7：肺组织中 SP 和 CGRP 的 mRNA 表达水平。 （A） 肺组织中 P 物质 （SP） 的相对 mRNA 表达水平。（B） 肺组织中降钙素基因相关肽 （CGRP） 的相对 mRNA 表达水平。数据表示为 SEM ±平均值，与 NS 组相比，*P < 0.05。 请单击此处查看此图的较大版本。

本研究通过持续吸入柠檬酸 （CA） 成功建立了咳嗽超敏反应小鼠模型。该模型表明，柠檬酸和辣椒素引起的自发性咳嗽和反射性咳嗽的咳嗽敏感性均能可靠地增加。柠檬酸和辣椒素广泛用于评估咳嗽反射敏感性¹⁶。

该协议中的几个关键步骤确保了其有效性。首先，用于实验的曝光室不能完全密封。为确保适当通风，应在腔室后部放置通风口。其次，重要的是要避免室内过度拥挤;将老鼠数量限制在 10-12 只可以防止潜在的踩踏事件。第三，暴露后护理至关重要：每次暴露后，必须用暖空气擦干小鼠，以去除皮毛上残留的液体。

虽然豚鼠传统上用于研究咳嗽机制和评估镇咳药，但小鼠模型具有几个优势。以前的研究已经开发了柠檬酸暴露诱导的咳嗽超敏反应的豚鼠模型。例如，Nakaji 等人将豚鼠暴露于 0.5 M 柠檬酸中 10 分钟，每周 3 次，持续 2 周（共 8 次暴露）¹⁷。同样，Xu 等人的另一项研究通过让豚鼠吸入 0.4 M 柠檬酸 25 天，建立了一个咳嗽敏感性增加的模型¹⁸。然而，与目前的小鼠模型相比，这些豚鼠模型表现出不太明显的咳嗽敏感性。此外，豚鼠模型面临局限性，例如缺乏转基因工具和商业试剂，这阻碍了咳嗽超敏反应分子机制的研究。

另一方面，小鼠更容易维护，更具成本效益，并且适合基因作。先前的研究表明，小鼠也是研究咳嗽 15,19,20,21 的有效模型。此外，小鼠常用于神经科学研究，为研究咳嗽超敏反应的中枢机制提供了优势。因此，小鼠被认为更适合慢性咳嗽的机制研究。

尽管该模型已成功建立，但仍有一些限制需要考虑。首先，柠檬酸虽然常用于食品、制药、化学和冶金工业^22,23，但不能准确模拟导致人类咳嗽超敏反应的现实生活暴露条件。其次，该模型中咳嗽超敏反应的确切机制尚不清楚。虽然肺部炎症被认为是咳嗽敏感性增加的潜在介质⁶，但支气管肺泡灌洗液 （BALF） 中炎症细胞总数和差异细胞计数的评估显示两组之间没有显着变化。此外，支气管高反应性是慢性咳嗽²⁴ 的已知触发因素，在暴露 14 天后，模型组和对照组之间的气道阻力没有显着差异。

总之，通过连续吸入柠檬酸 （CA） 建立了咳嗽超敏反应小鼠模型。该模型作简单，结果可重复，使其成为进一步研究慢性咳嗽机制和潜在新治疗方法的宝贵工具。

作者没有什么可披露的。

本研究得到了国家自然科学基金 （NSFC 82100034） 和广州市科技规划项目 （202102010168） 的支持。