Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Işık tarafından küçük GTPaz aktivitesinin yerleşim-zaman kontrolü için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, rapamisin indüklenen FKBP-FRB heterodimerization ve foto-kafes sistemleri dayanmaktadır. Işık ışınlama Optimizasyonu Subselüler düzeyindeki küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon sağlar.

Büyük zamanmekansal hassasiyetle küçük guanozin triphosphatases (GTPases) ve Rho ailesinin Dinamik yönetmelik çeşitli hücresel fonksiyonları ve olaylar ^{1, 2} için gereklidir. Onların spatiotemporally dinamik yapısı gerçek zamanlı ³ de, faaliyet ve yerelleşme görselleştirme tarafından ortaya konmuştur. Moleküler düzeyde çeşitli hücresel fonksiyonların rolleri daha derin bir anlayış kazanmak için, bir sonraki adım, kesin Subselüler konum ve zamanlama ile protein faaliyetlerinin pertürbasyon olmalıdır.

(1) rapamisin bağlı FKBP-FRB heterodimerization ve rapamisin (2) Fotoğraf-kafes yöntemi: Bu hedefe ulaşmak için, ışık kaynaklı, iki tekniği birleştirerek küçük GTPases bir uzay-zamansal olarak kontrollü aktivasyon için bir yöntem geliştirdik. Rapamisin aracılı FKBP-FRB heterodimerization kullanımı ile, hızla küçük GTPases includi aktivasyonu veya inaktivasyonu indüklenebilir için bir yöntem geliştirding Rac ^4, rapamisin FRB tutturulduğu plazma zarına, FKBP-erimiş GTPases, ya da bunların aktivatörlerinin translokasyonu indüklemektedir hangi Cdc42 ^4, RhoA ⁴ ve ⁵ Ras,. Bu heterodimerization sistemi ile bağlantı için, biz de rapamisin analoglarının bir foto-kafes sistemi geliştirdik. A foto-kafeste bileşiğin aktivitesi olan bir kafes grubu olarak bilinen bir photocleavable koruyucu grup ile bastırılmış, küçük bir moleküldür. Tamamen heterodimerization faaliyetleri bastırmak için, hücrelerin ⁶ içinde kimyasal bir dimerizer olarak neredeyse hiçbir plan aktivitesi yol, elde edilen büyük ve karmaşık bir plazma zarı geçemez öyle bir makromolekül tethered bir kafese rapamisin tasarlanmıştır. Şekil 1 bizim bir düzeni göstermektedir sistem. Bu iki sistemin kombinasyonu ile, yerel saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde plazma membranı bir Rac aktivatörü işe ve Subselüler lev ışık kaynaklı Rac aktivasyon eldeEl ^6.

1. Plazmid DNA transfeksiyon

1. 37.5 ul dH ₂ O kadar floresan proteini tagged: plazmid DNA'lar, 0.5 mikrogram membran-gergin FRB (bundan sonra LDR olarak anılacaktır) ve 0.5 mg FKBP-Tiam1 (Rac aktivatör T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1) ekle 1 ul FuGENE HD ekleyin.
2. 20 dakika için oda sıcaklığında vorteks ile inkübe. Bu arada, adım 1,3-1,8 geçin.
3. 50 ul poli-D-Lizin içeren bir 8-de haznesinin her oyuğa yıkanır.
4. DH ₂ O her iyi merkezi yıkayın
5. % 80-85 konfluent NIH-3T3 hücreleri Trypsinize ve 10 ml kültür ortamı (% 10 FBS DMEM) ye tamamlanır.
6. Süspansiyon 375 ul çıkarın ve 3 dakika 1750 rpm'de santrifüj.
7. Pelet rahatsız dikkat ederek, medya aspire.
8. DMEM w /% 10 FBS ve Pastör pipetiyle 750 ul ekleyin.
9. DH ₂ O / DNA / FuGENE HD çözümü için hücre süspansiyonu ekleyin ve hafifçe karıştırın.
10. 250 ekleHer bir kuyuya hücre / DNA süspansiyonu ul (3 kuyu kadar dolduracaktır).
11. 37 Transfekte hücreler inkübe ° C ve 15-18 saat _boyunca% 5 CO2.

2. KİB-Bir Çözüm hazırlanması

1. Sentezlemek kafesli rapamisin-biotin adduct (KİB). Ayrıntılar için "KİB Sentetik düzeni" bakınız. Kısaca, kafes ve biyotin yarımlar ayrı olarak hazırlanır. Kafes yarımı sonra rapamisinin (LC laboratuar) ile konjuge olup, ürün daha sonra CRB verecek şekilde tıklama reaksiyonu ^içinde bir ⁷ vasıtası ile biyotin yarımına bağlanmıştır.
2. DMSO içinde CRB bir 1 uM stok çözeltisi hazırlayın.
3. 0,5 ml Eppendorf tüp PBS 250 ul olarak 1mg avidin eritin.
4. Çözünmüş avidin için CRB stok solüsyonundan 1 ul ekleyin. Ters tarafından bir kaç kez karıştırın.
5. CRB-avidin konjugatı (CRB-A verecek şekilde 15 dakika oda sıcaklığında inkübe) Çözümü.
6. Ilişkisiz küçük moleküller uzaklaştırın ve saflaştırmak KİB-A boyutu-dışlama sütunu kullanarak.

3. Mikroskopi ve Subselüler Düzeyinde Işık Aydınlatma

1. Serum 12 saat boyunca FBS olmadan DMEM içinde transfekte edilmiş hücrelerin açlık.
2. Yavaşça hücrelerini medya çekilerek hazırlanmış 400 nM KİB-bir çözüm (adım 2.6 dan itibaren) 250 ul ekleyin.
3. Işık tedavisi öncesi ve sonrası Subselüler çözünürlükte canlı hücreler protein dinamikleri görselleştirmek için, iplik diski mikroskobu (Şekil 2a) kullanıldı. UV aydınlatma epi-floresan ışığı (Şekil 2b) ile UV LED ışık (365 nm) için optik bağlantı sağlandı.
4. Metamorph yazılımı Transfekte edilmiş hücrelerin floresans görüntüler, her 15 saniye yakalamak için kullanıldı.
5. UV ışığı ile heyecanlandım floresan boya ile kaplanmış bir cam levha kullanılarak bir aydınlatma noktanın koordinatları ve boyutu tanımlayın. Boyutu olabilirfarklı büyütmeler objektif lens uygulayarak ve farklı çekirdek boyutu ile optik fiberler seçilerek çeşitlendirilebilir.
6. Hücre periferinde membran ruffling, saçmak UV ışık arka seviyelerini belirledikten sonra. Aşağıdaki iki adım lokalize etkileri önceki karşılaştırmak vardır.
7. Küresel bir cıvalı lamba tarafından sağlanan 365 nm ışık hücreleri ışın tedavisi.
8. , Uncaged DMSO içinde ve sonra PBS (400 nM final) içinde eritilir ve böylece orijinal rapamisin ve küresel etkilere sebep olmak için görüntüleme odasına solüsyonu ilave edin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Temsili sonuçlar bir örneği, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Bir hücresel kenarında küçük bir bölgede UV ışık ışınlama hızla lokalize oluşumu uyarılan ışınlanmış alanında ve yakın sadece katlar. Bu WHI iki, biz o zaman küresel UV ile ışınlanmış hücreleri, aslında yerel etkinlik, ya da toplu medya rapamisin eklendiğini onaylamak içinch membran boyunca küresel fırfır oluşumuna bağlı. Bir kantitatif analiz için, dört parçaya bölünür hedef hücrelere bölünmüş ve fırfır yerel üzerine her çeyrekte oluşumu gibi denetimleri (Şekil 4) dahil olmak üzere, çeşitli koşullar altında küresel uyarılmasını takiben sıklığı sayılır. Sadece bu UV ışınlama kombinasyonu, KİB-A, ve yerel ruffling indükler uygun FKBP-FRB yapıları olduğunu.

Şekil 1. Kafesli rapamisin-avidin konjuge (KİB-A) ve UV ışık kullanılarak mekansal sınırlı protein Dimerleşme şematik. UV ışını kimyasal dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hidroksietil) rapamisin) ve yan-ürünün yayın ile sonuçlanan, rapamisin ve biotin ile linker parçalayarak. Serbest dimerizer sonra hücrelerin içine yayılır ve FKBP-POI (ilgi protein) ve plazma memb arasındaki dimerizasyon indüklerRane sadece ışınlanmış bölgesi (mavi daire) yakınında FRB demirledi. UV ışını olmadan, FKBP ve FRB dolayısıyla hiçbir etkisi üreten, (kırmızı çarpı) doçent yok. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Şekil 2. Özelleştirilmiş konfokal floresan mikroskop resmi. Konfokal mikroskop (a) önden görünüşü (Axiovert 200, Zeiss ters). EPI, floresans ve UV aydınlatma için bir kaplin ünitesi (b), Yakın çekim, üstten görünüşü.

Şekil lokalize UV ışını ile indüklenen bir transfekte NIH3T3 hücrede 3. Mekansal sınırlı fırfır oluşumu. YFP etiketli FKBP-Tiam1 (Rac aktivatörü) ve LDR (FRB membran-demirlemiş) ile transfekte bir NIH3T3 fibroblast hücre Konfokal floresan görüntüleri L ile kenarına yakın bir sınırlı alanda ışınlama yapıldı15 sn toplu medyada KİB-A konjugat varlığında 210 sn 'den için 365 nm'de ED ışık. Bu tedavi 1560 sn rapamisin son 400 nM 1063 sn ve küresel Ayrıca az 1 saniye civa lambası ile global aydınlatma izledi. Hücre başında (a) neredeyse hiç ruffling faaliyet gösterdi ancak gösterdi uzaysal lokalize aydınlatma sonra ruffling sınırlı (sarı daire) (b). Hücre yerel fırfır oluşumu Rac olarak uzaysal sınırlı aktivasyonu sonucu olduğunu gösteren, global aydınlatma ve rapamisin (cd) ilavesinden sonra küresel fırfır oluşumu gösterdi. Ölçek çubuğu: 10 mikron. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Şekil 4. Transfekte NIH3T3 hücrelerinin kadranda fırfır oluşumu sıklığı. CRB-A ve aşağıdaki genel UV ışını 13 hücreleri üzerinde yapıldı. CRB-A ile lokal UV ışını Ayrıca (UV radyasyon) Lüks, avidin olan veya olmayan yerel UV ışınlaması sırasıyla 13, 5 ve 6 hücreleri üzerinde uygulanmıştır. Gözlenen hücrelerin hiçbiri UV radyasyon, veya veya toplu ortamda avidin olmadan yerel UV ışınlaması olmadan KİB-A ile fırfır oluşumu gösterdi. Düşük arka fırfır oluşumu ile hücrelerde verileri toplanmıştır ancak bu rapamisinin (nihai 400 nM) ilavesi sonucu genel oluşması fırfır teyit tarafından her bir deney sonra kontrol rapamisin indüklenen fırfır oluşumu, bir kapasiteye sahip olan. Bu sonuçlar, CRB-A ve yerel UV ışını hücrelerinde yerel fırfır oluşumu için gerekli olduğunu gösterdi. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Kısaltmalar:

FKBP: FK506-bağlayıcı protein
FRB: FKBP-rapamisin-bağlayıcı protein
Tiam1: T-hücreli lenfoma invazyon ve metastaz uyaran protein 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG linker-FRB (Lyn: Lyn kinaz N-terminal 11 amino asitleri)
HE-Rapa: C40-O - (2-hidroksietil) rapamisin
KİB: biotin grubu ile kafesli rapamisin
KİB-A: avidin için CRB konjuge

Biz saniyelik bir zaman ölçeği üzerinde doğru bir hücre içi yerde Rho GTPaz aktivitesi işlemek üzere FKBP-FRB heterodimerization sistemine sahip bir yeni bileşik kafeste birlikte çalıştığı bir yöntem tarif.

Bu yaklaşımın üç sınırlamalar vardır. Metodu plazma membranında dimerizer difüzyonu önlenmesi veya izin bağlı olduğu Birincisi, hedef hücresel plazma membranında konuma yada çevresi olması gerekmektedir. KİB kimyasal yapısı daha ileri optimizasyon bileşik ışık ışınlama kadar dimerizasyon neden olmadan hücrelere girmek için izin verebilir. Böyle bir dimerizer ile, teorik olarak her yerde hücre içinde sinyal moleküllerinin aktivitesini manipüle olabilir. İkinci olarak, kimyasal dimerizers, FKBP-FRB dimerizasyon kompleksi, ya da aktive edilmiş endojen sinyal molekülleri moleküler difüzyon büyük ölçüde etkiler amaçlanan hassas bir şekilde sınırlandırıcı etkileyebilir. Bu etki özellikle telaffuz edilirDaha sonra az zaman noktaları ve UV radyasyonuna (örneğin ışını genişliği, enerji, ve kiriş mod (sürekli vs darbeli) gibi) ve söz konusu bileşiklerin difüzyon katsayısı ile görülen parametreleri bağlıdır. Bu parametrelerin ayrıntılı ampirik optimizasyonu sinyal faaliyetlerinin daha sıkı sarılma sağlar. Üçüncü olarak, bir UV ışık hücrelere Önemsiz olmayan fototoksisite sergiler. Bu sorunu düzeltmek için bir kolay yolu nitrobenzil kafes grupları uncage böyle 405 nm gibi daha uzun dalga boyu kullanmaktır. Uncaging için iki-fotonlu aydınlatma bir hatta daha uzun dalga boyu gibi az hücrelerinin aşırı lokalize bölgede aydınlatma sağlar. Son zamanlarda, diğer araştırmacılar ışığa duyarlı bitki proteinleri ^8-11 kullanarak Subselüler yerde Rac etkinleştirmek için zarif bir yaklaşım bildirdin. Şimdiye kadar, bu uygulamanın sadece birkaç proteinleri ile sınırlıdır. Kendi stratejileri ile karşılaştırıldığında, mevcut teknik olmadan hedef proteinlerin sayısını artırmak için daha kolay uyarlanabilir kapsamlı ve tiBeni tüketen yeniden mühendisliği. Biz ve diğerleri, zaten plazma membranında ^{5, 6, 12-14} azından farklı sinyal molekülleri aktivitesi işleyebilirsiniz dimerizasyon probları çeşitli geliştirmişlerdir. Spatiotemporally dinamik hücresel olayların artık doğrudan sınanabilir.

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışma NIH araştırma fonu (DK090868 ve TI GM092930) tarafından desteklenmiştir. Kafesli bir rapamisin analog bir patent var.