المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

وصفت طريقة لالمكانية والزمانية السيطرة على نشاط GTPase صغيرة من الضوء. ويستند هذا الأسلوب على heterodimerization FKBP-FRB rapamycin التي يسببها ونظم الصور الحبس. تعظيم الاستفادة من أشعة الضوء تمكن من تفعيل المكانية والزمان التحكم من GTPases الصغيرة على مستوى التحت خلوية.

تنظيم دينامية الأسرة رو من triphosphatases فسفات الصغيرة (GTPases) مع الدقة المكانية كبير أمر ضروري للوظائف الخلوية المختلفة والمناسبات ^{1 و 2.} وقد كشفت عن طبيعتها الديناميكية spatiotemporally التي تصور من نشاطهم والتوطين في ³ في الوقت الحقيقي. من اجل الحصول على فهم أعمق لدورهم في الوظائف الخلوية المختلفة على المستوى الجزيئي، ينبغي أن تكون الخطوة التالية اضطراب الأنشطة في مكان وجود بروتين التحت خلوية دقيقة وتوقيت.

لتحقيق هذا الهدف، قمنا بتطوير طريقة لصنع ضوء، المكانية والزمان تفعيل رقابة من GTPases الصغيرة من خلال الجمع بين اثنين من التقنيات: (1) rapamycin التي يسببها FKBP-FRB heterodimerization و (2) طريقة الصور والحبس من rapamycin. مع استخدام heterodimerization FKBP-FRB rapamycin بوساطة، وقد طورنا طريقة لقابل للتحريض بسرعة تفعيل أو تعطيل من includi GTPases صغيرنانوغرام RAC ^4، Cdc42 ^{4، 4} ورأس RhoA ^5، الذي يدفع rapamycin إزفاء من FKBP-تنصهر GTPases، أو تفعيل لها، إلى غشاء البلازما حيث يرتكز FRB. لاقتران مع هذا النظام heterodimerization، وضعنا أيضا نظام الصور والحبس من rapamycin النظير. مجمع الصور في قفص هو جزيء صغير النشاط الذي يتم قمع مع مجموعة photocleavable حماية المعروفة باسم مجموعة الحبس. لقمع نشاط heterodimerization تماما، قمنا بتصميم rapamycin قفص التي يتم مربوط الى جزيء مثل هذا المجمع الناتج كبير لا يستطيعون عبور غشاء البلازما، مما يؤدي إلى نشاط عمليا خلفية لا بوصفها dimerizer الكيميائية داخل الخلايا ^6. ويوضح الشكل 1 مخطط لدينا نظام. مع مزيج من هذين النظامين، ونحن المعينين محليا منشط طلب إلى غشاء البلازما في فترة زمنية من ثانية، وحقق الضوء الناجم عن تفعيل طلب في ليف التحت خلويةش ^6.

1. ترنسفكأيشن من البلازميد

1. إضافة السلطات الوطنية المعينة بلازميد، 0.5 ميكروغرام غشاء المربوطة FRB (المشار إليه فيما LDR) و 0.5 ميكروغرام FKBP-Tiam1 (T-سرطان الغدد الليمفاوية الخلية الغزو والانبثاث الذي يحفز البروتين 1: طلب المنشط) الموسومة ب بروتين فلوري إلى 37.5 ميكرولتر O. ₂ درهم إضافة 1 ميكروليتر FuGENE HD.
2. دوامة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. في هذه الأثناء، انتقل إلى خطوات 1،3-1،8.
3. غسل كل بئر من غرفة 8-جيدا مع 50 ميكرولتر بولي ليسين-D.
4. غسل مركز كل جيدا مع DH ₂ O.
5. يعرض للتريبسين 80-85٪ متكدسة المعاهد الوطنية للصحة، 3T3 الخلايا وتضعف إلى 10 مل الثقافة المتوسطة (DMEM مع FBS 10٪).
6. إزالة 375 ميكرولتر من التعليق والطرد المركزي في 1750 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
7. نضح في وسائل الإعلام، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
8. إضافة 750 ميكرولتر من FBS DMEM ث / 10٪ وresuspend.
9. إضافة تعليق إلى خلية درهم ₂ O / DNA / FuGENE حل HD وتخلط بلطف.
10. إضافة 250ميكرولتر من خلية / الحمض النووي تعليق على كل بئر (سوف تملأ ما يصل الى 3 آبار).
11. احتضان خلايا transfected عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ ل15-18 ساعة.

2. إعداد CRB-الحل

1. توليف في قفص rapamycin-البيوتين معقد إضافي (CRB). انظر "مخطط الاصطناعية من CRB" للحصول على التفاصيل. لفترة وجيزة، على استعداد الحبس والبيوتين الأنصاف بشكل منفصل. شاردة الحبس بعد ذلك مترافق إلى rapamycin (LC مختبر)، والمنتج بالإضافة إلى وقت لاحق على شاردة من البيوتين بواسطة وسيلة للتفاعل فوق ⁷ إلى تحمل CRB.
2. تعد الأوراق المالية 1 ميكرومتر حل CRB في DMSO.
3. حل أفيدين 1mg في 250 ميكروليتر من PBS في أنبوب 0،5 مل إيبندورف.
4. إضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون CRB أفيدين إلى حل. مزيج من قبل عدة مرات قلب.
5. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ليحقق CRB-أفيدين المتقارن (CRB-A) حل.
6. استبعاد جزيئات صغيرة غير منضم وتنقية CRB-A. باستخدام عمود الحجم الاستبعاد

3. المجهري والإضاءة الخفيفة على المستوى التحت خلوية

1. مصل تجويع الخلايا transfected في DMEM بدون FBS لمدة 12 ساعة.
2. نضح بلطف وسائل الإعلام خارج الخلايا وإضافة 250 ميكرولتر من 400 نانومتر استعدادا CRB-A حل (من الخطوة 2.6).
3. لتصور ديناميات البروتين في الخلايا الحية في قرار التحت خلوية قبل وبعد العلاج ضوء، تم استخدام المجهر الغزل القرص (الشكل 2A). وقد تحقق إضاءة الأشعة فوق البنفسجية من قبل اقتران البصريات للأشعة فوق البنفسجية ضوء الصمام (365 نانومتر) مع برنامج التحصين الموسع ومضان ضوء (الشكل 2B).
4. وقد استخدم MetaMorph البرمجيات لالتقاط الصور مضان من الخلايا transfected كل 15 ثانية.
5. تحديد إحداثيات وحجم بقعة الإضاءة باستخدام لوحة من الزجاج المطلي مع الأصباغ الفلورية ولع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يمكن أن حجمأن تختلف عن طريق تطبيق عدسة تكبير الهدف مع مختلف وبتحديد الألياف البصرية مع حجم الأساسية المختلفة.
6. بعد تحديد مستويات أساسية من الإزعاج غشاء، أشرق ضوء الأشعة فوق البنفسجية في محيط الخلايا. التاليين الخطوات هي على النقيض السابقة الآثار المحلية.
7. أشرق على الصعيد العالمي مع خلايا ضوء 365 نانومتر المقدمة من مصباح الزئبق.
8. حل uncaged، وبالتالي rapamycin الأصلي في DMSO ومن ثم في برنامج تلفزيوني (400 نيوتن متر نهائي)، وإضافة إلى حل للغرفة التصوير للحث على الآثار العالمية.

4. ممثل النتائج

ويرد مثال على نتائج ممثل في الشكل (3). الأشعة فوق البنفسجية أشعة الضوء في منطقة صغيرة بالقرب من حافة الخلوية التي يسببها بسرعة تشكيل المترجمة الكشكشة فقط في وبالقرب من منطقة المشع. لتأكيد أن هذا هو في الواقع نشاط محلي، ونحن بعد ذلك المشع على الصعيد العالمي مع خلايا للأشعة فوق البنفسجية، أو إضافة rapamycin إلى وسائل الإعلام بالجملة، وكلا من مبادرة الخوذ البيضاءالفصل العالمية الناجمة تشكيل كشكش في جميع أنحاء غشاء. عن التحليل الكمي، وتنقسم نحن الخلايا المستهدفة إلى أربعة أجزاء، وعدها وتيرة تشكيل كشكش في كل رباعي على المحلية، وكذلك في أعقاب التحفيز العالمية في ظل ظروف مختلفة بما في ذلك الضوابط (الشكل 4). أنها ليست سوى هذا المزيج من الأشعة فوق البنفسجية، CRB-A، ومناسبة FKBP-FRB بنيات الذي يسبب الإزعاج المحلية.

الشكل 1. تخطيطي من dimerization بروتين تقتصر مكانيا باستخدام قفص rapamycin-أفيدين المتقارن (CRB-A) والأشعة فوق البنفسجية. اشعة فوق البنفسجية يشق رابط بين rapamycin والبيوتين، مما أدى إلى الإفراج عن dimerizer الكيميائية (سعادة، رابا، C40-O-(2-هيدروكسي إيثيل) rapamycin)، ولها من قبل المنتج. وdimerizer سراح ينشر بعد ذلك في الخلايا ويؤدي dimerization بين FKBP-البوي (بروتين من الفائدة) وmemb البلازمارست RANE FRB فقط في المناطق القريبة من المنطقة المعرضة للإشعاع (الدائرة الزرقاء). من دون أشعة فوق البنفسجية، وFKBP FRB عدم الربط بين (الصليب الأحمر)، وتنتج بالتالي أي تأثير. (حقوق الطبع والنشر @ ACS2011) ⁶

الشكل 2. صورة من المجهر مخصصة مضان مبائر. (أ) عرض أمامي من المجهر متحد البؤر (مقلوب Axiovert 200، زييس). (ب) عن قرب، رأي كبار من وحدة توصيل لمضان برنامج التحصين الموسع والإضاءة فوق البنفسجية.

الشكل 3. تشكيل كشكش تقتصر مكانيا في زنزانة NIH3T3 transfected الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية المترجمة. وخضع الصور مضان مبائر خلية الليفية NIH3T3 التي يتم transfected مع YFP الموسومة FKBP-Tiam1 (RAC المنشط) وLDR (غشاء الراسية FRB) إشعاع في منطقة مغلقة بالقرب من حافته مع Lالضعف الجنسي في ضوء 365 نيوتن متر لمدة 15 ثانية ابتداء من الساعة الثانية 210 في وجود CRB-المتقارن في وسائل الإعلام الجزء الأكبر. وأعقب هذا العلاج بواسطة الإضاءة العالمية مع مصباح الزئبق في 1 ثانية في إضافة ثانية والعالمية 1063 نيوتن متر من rapamycin 400 في نهائي 1560 في الثانية. وأظهرت خلية تقريبا أي نشاط الإزعاج في بداية (أ) لكنه أظهر تقتصر مكانيا الإزعاج بعد إضاءة مترجم (دائرة صفراء) (ب). وأظهرت الخلية عالمي تشكيل كشكش بعد الإضاءة العالمية، وبالإضافة إلى ذلك من rapamycin (CD)، مشيرا إلى أن السبب في تشكيل كشكش المحلية عن طريق تفعيل تقتصر مكانيا من طلب. شريط الحجم: 10 ميكرون. (حقوق الطبع والنشر @ ACS2011) ⁶

الشكل 4. تردد من تشكيل كشكش في الأرباع من الخلايا NIH3T3 transfected. المحلية للاشعة فوق البنفسجية مع CRB-A تم تنفيذها والتالية للاشعة فوق البنفسجية العالمي في 13 الخلايا. CRB-A بالإضافة إلى ذلك (لا توجد أشعة فوق البنفسجية)، ونفذت المحلية للاشعة فوق البنفسجية مع أو بدون أفيدين على خلايا 13، 5 و 6، على التوالي. لم يظهر أي من الخلايا المرصودة تشكيل كشكش مع CRB-A من دون أشعة فوق البنفسجية، أو الأشعة فوق البنفسجية المحلية مع أو بدون أفيدين في وسائل الإعلام الجزء الأكبر. جمعنا البيانات من الخلايا مع انخفاض خلفية تشكيل كشكش لكن التي لديها القدرة على تشكيل كشكش rapamycin التي يسببها، والتي دققت نحن بعد كل تجربة من خلال التأكد عالمي تشكيل كشكش نتيجة لإضافة rapamycin (نهائي 400 نيوتن متر). وأظهرت هذه النتائج أن CRB-A والمحلية للاشعة فوق البنفسجية ضرورية لتشكيل كشكش المحلية في الخلايا. (حقوق الطبع والنشر @ ACS2011) ⁶

الاختصارات:

FKBP: FK506 ملزم بروتين
FRB: FKBP-rapamycin ملزم بروتين
Tiam1: تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية الغزو والانبثاث الذي يحفز بروتين 1 (RAC GEF)
LDR: لين، DSAG رابط، FRB (لين: N-11 محطة من الأحماض الأمينية كيناز لين)
سعادة ورابا: C40-O - (2-هيدروكسي إيثيل) rapamycin
CRB: rapamycin في قفص مع شاردة البيوتين
CRB-A: CRB مترافق إلى أفيدين

ووصف لدينا التقنية التي توظف رواية قفص مركب جنبا إلى جنب مع نظام heterodimerization FKBP-FRB من أجل التعامل مع رو GTPase النشاط في مكان وجود التحت خلوية دقيق على نطاق ومرة ​​ثانية.

هناك ثلاثة أوجه القصور في النهج الحالي. أولا، لأنه يعتمد الأسلوب على منع أو السماح للنشر dimerizer عبر غشاء البلازما، وموقع الهدف الخلوية يجب أن يكون غشاء البلازما أو المناطق المجاورة لها. قد مزيد من التحسين على التركيبة الكيميائية للسماح CRB المجمع لدخول الخلايا دون التسبب dimerization حتى إشعاع ضوء. مع dimerizer مثل هذا، فإننا لا يمكن من الناحية النظرية التلاعب نشاط الجزيئات يشير الى أي مكان داخل الخلايا. ثانيا، لا يمكن نشر الجزيئي للdimerizers الكيميائية، FKBP-FRB مجمع dimerization، أو المنشط الذاتية الجزيئات يشير تؤثر بشكل كبير الحبس دقيق للآثار المقصود. هو واضح بشكل خاص بهذا الشأنفي وقت لاحق نقاط الوقت وتعتمد على المعطيات المرتبطة اشعة فوق البنفسجية (مثل عرض الحزمة، والطاقة، ووضع شعاع (مستمر مقابل نابض))، ومعاملات نشر من المركبات ذات الصلة. مزيد من التحسين التجريبية من هذه الثوابت يمكن حبس أكثر صرامة من الأنشطة إشارة. ثالثا، يسلك على ضوء الأشعة فوق البنفسجية غير تافهة الضيائية إلى الخلايا. واحد طريقة سهلة لتخفيف هذه المشكلة هو استخدام أطول طول موجي مثل 405 نانومتر إلى uncage الجماعات الحبس nitrobenzyl. ثنائي الفوتون إضاءة لuncaging يسمح الإضاءة في طول موجي لفترة أطول، وكذلك في منطقة المترجمة للغاية من الخلايا. في الآونة الأخيرة، وقال باحثون من غيرها من هذا النهج أنيقة لتفعيل طلب في مكان التحت خلوية استخدام البروتينات النباتية الحساسة للضوء ^8-11. حتى الآن، يقتصر تطبيقه على البروتينات قليلة فقط. بالمقارنة مع استراتيجياتها، أسلوبنا الحالي هو أكثر قدرة على التكيف بسهولة لتوسيع عدد من البروتينات المستهدفة دون واسعة ومنظمة الشفافية الدوليةلي طويلا إعادة الهندسة. وقد وضعنا وغيرها بالفعل على العديد من التحقيقات dimerization التي يمكن التعامل مع هذا النشاط من مختلف الجزيئات يشير في غشاء البلازما ^{5، 6، 12-14.} أحداث الخلوية ديناميكية Spatiotemporally هي الآن قابلة للاختبار مباشرة.

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة تمويل بحوث (DK090868 وGM092930 إلى TI). هناك براءة اختراع معلقة على التناظرية rapamycin في قفص.