生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。

大きな時空間精度で小さなグアノシントリホスファターゼのRhoファミリー（GTPアーゼ）の動的な制御は、様々な細胞機能やイベントの^1、2のために不可欠です。その時空の動的な性質は、リアルタイム³それらの活性と局在の可視化によって明らかにされています。分子レベルでの多様な細胞機能における役割のより深い理解を得るために、次のステップは、正確な細胞内局在場所とタイミングでタンパク質の活動の摂動である必要があります。

（1）ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロおよびラパマイシン（2）写真ケージング方法：この目標を達成するために、我々は、光誘起、二つの手法を組み合わせることにより、低分子量GTPaseの時空間、時間的に制御されたアクティベーションの方法を開発した。ラパマイシン媒介FKBP-FRBのヘテロを使用すると、我々は急速に低分子量GTPase includiの活性化または不活性化を誘導するための方法を開発しましたngのRAC ^4、ラパマイシンは、FRBが固定されている細胞膜に、FKBP-融合GTPアーゼ、またはそれらの活性化の移行を誘導するCdc42の^4、RhoAの⁴とRasの^5。このヘテロシステムと結合するために、我々はまた、ラパマイシン類似体の写真ケージシステムを開発した。写真ケージド化合物は、その活動ケージング基として知られている光開裂性保護基で抑制されている小分子である。完全にヘテロの活性を抑制するために、我々はセル⁶内の化学dimerizerとして事実上のバックグラウンド·アクティビティにつながる、結果として大規模な複合体が細胞膜を通過できないような高分子につながれているケージラパマイシンを設計しました。 図1は、我々のスキームを示していますシステム。これら二つのシステムの組み合わせにより、我々は局所的に数秒の時間スケールで形質膜へのRac活性化を採用し、細胞内レフで光誘起Racの活性化を達成しましたエル^6。

1。プラスミドDNAのトランスフェクション

1. プラスミドDNAを追加し、0.5μgの膜係留FRB（以下、LDRと呼ばれる）と0.5μgのFKBP-Tiam1（T-細胞リンパ腫の浸潤や転移を誘発するタンパク質1：RAC活性剤）37.5μLのdH ₂ Oに蛍光タンパク質でタグ付け1μlのトランスフェHDを追加します。
2. 20分間室温でボルテックスし、インキュベートします。一方、ステップ1.3から1.8に進みます。
3. 50μlのポリ-D-リジンで8ウェルチャンバーの各ウェルを洗浄します。
4. のdH ₂ Oで各ウェルの中央を洗う
5. 80から85パーセントコンフルエントNIH-3T3細胞をトリプシン処理し、10 mlの培地（10％FBSを含むDMEM）に希釈する。
6. 懸濁液375μlを削除し、3分間1750 rpmで遠心します。
7. ペレットを乱さないように注意しながら、培地を吸引除去する。
8. DMEMのw / 10％FBSを再懸濁し、750μlを添加します。
9. のdH ₂ O / DNA /トランスフェHDソリューションに細胞懸濁液を加え、穏やかに混ぜる。
10. 250を追加します。各ウェルに細胞/ DNA懸濁液の液（3ウェルにいっぱいになります）。
11. 15から18時間のために°C、5％CO ₂で37トランスフェクションした細胞をインキュベートします。

2。 CRB-溶液の調製

1. ケージラパマイシン-ビオチン付加物（CRB）を合成。詳細については、 "CRBの合成スキーム"を参照してください。簡潔に、ケージとビオチン部分が別々に用意されています。ケージ部分は、その後、ラパマイシン（LCラボ）、その後、CRBを与えるためにクリック反応⁷によってビオチン部分に結合された製品に結合している。
2. DMSO中のCRBの1μMのストック溶液を準備します。
3. 0.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにPBS 250μlで1mgのアビジンを溶解する。
4. 溶解アビジンにCRBのストック溶液を1μlを追加します。反転数回混和する。
5. CRB-アビジンコンジュゲート（CRB-もたらすために室温で15分間インキュベート）ソリューションを提供します。
6. バインドされていない小分子を排除し、CRB-サイズ排除カラムを用いて精製する。

3。顕微鏡と細胞内レベルでのライト照明

1. 血清は12時間FBSを含まないDMEMでトランスフェクトした細胞を飢えさせる。
2. 穏やかに、細胞から培地を吸引除去すると、準備400nMのCRB-ソリューション（ステップ2.6から）250μlを加える。
3. ディスク顕微鏡を回転させて、光治療の前と後細胞内分解能で生きた細胞内のタンパク質の動態を可視化する（ 図2a）を用いた。 UV照度は落射蛍光光（ 図2b）と紫外LEDの光（365 nm）のための光学部品を結合させることによって達成された。
4. MetaMorphソフトウェアは、15秒ごとにトランスフェクトした細胞の蛍光画像をキャプチャするために使用された。
5. UV光により励起され蛍光色​​素で被覆したガラス板を使用することによって照明スポットの座標とサイズを定義します。サイズは缶異なる倍率で対物レンズを適用することにより、異なるコアサイズの光ファイバを選択することによって変化させることができます。
6. 膜の波打ちのバックグラウンドレベルを決定した後、細胞の周囲に照射UV光。次の2つの手順では、ローカライズされた効果の前に対比することです。
7. グローバル水銀ランプによって提供された365nmの光で細胞を照射します。
8. DMSOの後、PBSでuncaged、そのため、元ラパマイシン（最後の400 nM）を溶解し、グローバルな効果を誘導するイメージング室にソリューションを追加します。

4。代表的な結果

代表的な結果の一例を図3に示します。ローカライズの携帯端急速に誘導され形成の近くの小さな領域での紫外線照射は、照射領域と近いだけフリル。これはWHIの両方の、我々は、その後世界的に紫外線で細胞を照射し、実際に地元の活動であった、またはバルクメディアにラパマイシンを加えていることを確認するにはchは、膜全体のグローバルフリルの形成を誘導した。定量分析のために、私たちは4つの象限に標的細胞を分割し、フリル、ローカル時の各象限の形成と同様に、コントロール（図4）を含む様々な条件の下でグローバルな刺激後の周波数を数えた。それだけで、UV照射、CRB-、地元の波打ちを誘導する適切なFKBP-FRBの構成要素の組み合わせです。

図1。ケージラパマイシン-アビジンコンジュゲート（CRB-A）と紫外光を用いて空間的に閉じ込められたタンパク質の二量体の模式図。 UV照射は、化学dimerizer（HE-ラパ 、C40-O-（2 -ヒドロキシエチル） -ラパマイシン）とその副産物のリリースでは、その結果、ラパマイシンおよびビオチン間のリンカーを切断する。リリースdimerizerは、細胞内に拡散し、FKBP-POI（興味のあるタンパク質）とプラズマMEMBの間に二量体化を誘導するRANEは、照射領域（青丸）の近くにFRBを固定。 UV照射することなく、FKBPとFRBは、それ故に何の効果も生産しない、（赤い十字）関連付けられているわけではない。 （著作権@ ^ACS2011）6

図2。カスタマイズされた共焦点蛍光顕微鏡の画像。共焦点顕微鏡の（a）は正面図（Axiovert 200、ツァイスを反転）。 EPI蛍光およびUV照射のためのカップリングユニット（b）のクローズアップ、トップビュー。

ローカライズされたUV照射により誘導されるトランスフェクトしたNIH3T3細胞の3。空間に閉じ込めフリルの形成図 。 YFPタグの付いたFKBP-Tiam1（RACアクチベーター）とLDR（FRBを膜に固定）でトランスフェクトされたNIH3T3線維芽細胞の共焦点蛍光画像は、Lとの縁の近くに狭い領域で照射を受けた15秒は、バルクメディアのCRB-共役の存在下で210秒で起動するための365 nmでEDが点灯します。この治療は1063​​年で1秒の水銀ランプとグローバルイルミネーション秒および1560秒でラパマイシン、最終的な400nmのグローバル添加した。セルは初め（）でほとんど波打ち活性を示さなかったが、空間的にローカライズされた照明（黄色の丸）（b）の後の波打ち閉じ込められた認められた。セルは、ローカルフリル形成はRacの空間的に閉じ込められた活性化によって引き起こされたことを示す、グローバルイルミネーションおよびラパマイシン（CD）を添加した後にグローバルなフリルの形成を示した。スケールバー：10μmである。 （著作権@ ^ACS2011）6

図4：トランスフェクトしたNIH3T3細胞の象限のフリル形成の頻度。 CRB-と、次のグローバルUV照射は、13細胞で行われた。CRB-を使用したローカルのUV照射さらに（UV照射なし）、アビジンの有無にかかわらず地元のUV照射は、それぞれ、13、5と6のセルに実装されました。観測された細胞のいずれも、UV照射、またはローカルUV照射バルクメディアのアビジンの有無にかかわらずなしCRB-とフリルの形成は認められなかった。我々は低バックグラウンドフリル形成と細胞からデータを収集しますが、これは、我々はラパマイシン（最後の400 nm）の加算の結果として、グローバルなフリルの形成を確認して、それぞれの実験の後にチェックラパマイシン誘発性フリル形成の能力を持っていた。これらの結果は、CRB-およびローカルのUV照射は、細胞内のローカルフリル形成に必要であることを示した。 （著作権@ ^ACS2011）6

略語：

FKBP：FK506結合タンパク質
FRB：FKBP-ラパマイシン結合タンパク質
Tiam1：T-細胞リンパ腫の浸潤や転移を誘発するタンパク質1（RAC GEF）
LDR：リン-DSAGリンカーFRB（リン：LynキナーゼのN末端11アミノ酸）
HE-ラパ：C40-O - （2 -ヒドロキシエチル） -ラパマイシン
CRB：ビオチン部分とケージラパマイシン
CRB-：アビジンにコンジュゲートcrbを

我々は、秒の時間スケールでの正確な細胞内の場所でのRho GTPase活性を操作するために、FKBP-FRBヘテロシステムと小説ケージド化合物を一緒に採用してテクニックを説明します。

現在のアプローチの3つの制約があります。方法は、プラズマ膜を横切ってdimerizerの拡散を防止または許可に基づいているので、まず、ターゲット細胞の位置は、原形質膜またはその付近である必要があります。 CRBの化学構造のさらなる最適化は、化合物は光照射するまでの二量体化を誘導することなく細胞を入力することが可能になります。そのようなdimerizerでは、我々は理論的にはどこでも細胞内シグナル伝達分子の活性を操作することができます。第二に、化学dimerizers、FKBP-FRBの二量体複合体、またはアクティブに内因性のシグナル伝達分子の分子拡散が大幅に意図した効果の正確な閉じ込めに影響を与えることができます。この効果は、特に発音されます後の時点で、UV照射（例えば、ビーム幅、エネルギー、ビームモード（連続対パルス）など）と関係する化合物の拡散係数に関連付けられたパラメータに依存しています。これらのパラメータのさらなる実証的最適化は、信号の活動のより厳格な閉じ込めが可能になります。第三に、UV光が細胞に非自明な毒性を示す。この問題を改善する一つの簡単な方法は、ベンジルケージグループを解放するためにそのような405 nmの長波長を使用することです。アンケージングの2つの光子照明は、さらに長い波長などの細胞の非常にローカライズされた領域で照明することができます。最近、他の研究者は光に敏感な植物性タンパク質の^8-11を使用^して細胞内の場所でのRacを活性化するためのエレガントなアプローチが報告されています。これまでのところ、そのアプリケーションは、わずかのタンパク質に限定されています。彼らの戦略に比べ、我々の現在の技術はなく、標的タンパク質の数を拡張するより容易に適応可能である広範かつTI私のかかる再設計。我々や他のはすでに細胞膜^{5、6、12月14日}に、多様なシグナル伝達分子の活性を操作することができますダイマープローブの様々な開発してきました。時空間ダイナミック携帯電話のイベントは、現在直接テスト可能です。

利害の衝突が宣言されません。

本研究では、NIHの研究資金（TIへDK090868とGM092930）によってサポートされていました。ケージラパマイシンアナログの保留中の特許があります。