Espaço-Temporal Manipulação de Atividade GTPase Pequeno em nível subcelular e em escala de tempo de segundos em células vivas

Um método para espácio-temporal controlo da actividade GTPase pequena pela luz é descrito. Este método baseia-se em rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e foto-enjaulamento sistemas. Otimização de luz irradiação permite a ativação espaço-temporalmente controlada de pequenas GTPases no nível subcelular.

Regulação dinâmica da família Rho de trifosfatases guanosina pequenas (GTPases) com precisão espaço-temporal grande é essencial para várias funções celulares e eventos ^{1, 2.} A sua natureza dinâmica spatiotemporally foi revelada pela visualização da sua actividade e localização em tempo real ^3. A fim de obter uma compreensão mais profunda dos seus papéis em diversas funções celulares a nível molecular, o próximo passo deve ser perturbação das actividades de proteína a uma localização precisa subcelular e de temporização.

Para atingir este objectivo, desenvolvemos um método para a induzida pela luz, num espaço-temporal activação controlada de GTPases pequenas pela combinação de duas técnicas: (1) rapamicina induzida heterodimerização FKBP-FRB e (2) um método de foto-enjaulamento de rapamicina. Com o uso de rapamicina mediada heterodimerização FKBP FRB-, desenvolvemos um método para rapidamente induzível activação ou inactivação de pequeno GTPases including Rac ^4, Cdc42 ^4, RhoA ⁴ e ⁵ Ras, em que a rapamicina induz a translocação de FKBP-fundidos GTPases, ou os seus activadores, para a membrana plasmática, onde está ancorada FRB. Para o acoplamento com o presente sistema de heterodimerização, também desenvolvido um sistema foto-enjaulamento de análogos de rapamicina. Um composto de foto-engaiolados é uma molécula pequena, cuja actividade é suprimida com um grupo fotocliváveis ​​proteger conhecido como um grupo de encarceramento. Para suprimir a actividade heterodimerização completamente, foi elaborado um rapamicina engaiolados que está preso a uma macromolécula tal que o complexo resultante grande não pode atravessar a membrana plasmática, levando a virtualmente nenhum fundo actividade como um dimerizer química no interior das células ^6. A Figura 1 ilustra um esquema do nosso sistema. Com a combinação destes dois sistemas, é localmente recrutado um activador Rac para a membrana plasmática num espaço de tempo de segundos, e conseguido induzida pela luz de activação Rac no lev subcelularel ^6.

1. A transfecção de DNA de plasmídeo

1. Adicionar DNAs plasmídicos, 0,5 ug FRB membrana amarrado (daqui em diante referido como LDR) e 0,5 ug FKBP-Tiam1 (T-cell lymphoma invasão e metástase indutora de proteína 1: Rac activador) marcado com proteína fluorescente para 37,5 uL dH ₂ O. Adicionar 1 ml FuGENE HD.
2. Vortex e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos. Enquanto isso, vá para as etapas 1,3-1,8.
3. Lava-se cada poço de uma câmara de 8-bem com 50 uL de poli-D-lisina.
4. Lavar o centro de cada poço com dH ₂ O.
5. Trypsinize 80-85% confluentes células NIH-3T3 e diluir até 10 mL meio de cultura (DMEM com FBS 10%).
6. Remover 375 ul de suspensão e centrifugar a 1750 rpm durante 3 minutos.
7. Aspirar a mídia, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
8. Adicionar 750 ul de DMEM FBS w / 10% e ressuspender.
9. Adicionar suspensão de células de dH ₂ O / DNA / solução FuGENE HD e misture delicadamente.
10. Adicionar 250ul de célula / DNA suspensão a cada poço (irá preencher até 3 poços).
11. Incubar as células transfectadas a 37 ° C e _5% de CO2 durante 15-18 hr.

2. Preparação de crb-se uma solução

1. Sintetizar enjaulado aduto rapamicina-biotina (CRB). Consulte "esquema sintético do crb" para detalhes. Resumidamente, porções enjaulamento e biotina são preparados separadamente. A porção de encarceramento é então conjugado de rapamicina (LC laboratório), o produto subsequentemente acoplado à porção de biotina por um meio de reacção clique ⁷ para se obter CRB.
2. Preparar uma solução-mãe 1 mM de crb em DMSO.
3. Dissolve-se avidina 1mg em 250 ul de PBS em um tubo Eppendorf 0,5 ml.
4. Adicionar 1 ml de solução estoque para crb avidina dissolvido. Misturar invertendo várias vezes.
5. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min para se obter CRB-avidina conjugada (CRB-A) De solução.
6. Excluir pequenas moléculas não ligadas e purificar CRB-A. Utilizando uma coluna de exclusão de tamanho

3. Microscopia e Iluminação Luz em nível subcelular

1. Soro fome células transfectadas em DMEM sem FBS durante 12 horas.
2. Aspirar cuidadosamente os meios de comunicação fora das células e adicionar 250 uL da nM 400 preparada CRB-se uma solução (a partir do passo 2.6).
3. Para visualizar dinâmica de proteínas em células vivas em resolução subcelular antes e após tratamento com luz, microscopia de disco giratório foi utilizado (Figura 2a). Iluminação UV foi conseguida por acoplamento óptica para luz do LED UV (365 nm) com epi-fluorescência de luz (Figura 2b).
4. MetaMorph software foi usado para capturar imagens de fluorescência de células transfectadas a cada 15 segundos.
5. Definir as coordenadas e tamanho de um ponto de iluminação usando uma placa de vidro revestida com corantes fluorescentes excitadas pela luz UV. O tamanho podeser variado através da aplicação de lente objectiva com ampliações diferentes e seleccionando as fibras ópticas com tamanho do núcleo diferente.
6. Após a determinação dos níveis de fundo de luz membrana ruffling UV, irradiam na periferia das células. Os dois passos seguintes são para contrastar anterior efeitos localizados.
7. Globalmente irradiar as células com luz de 365 nm fornecida por uma lâmpada de mercúrio.
8. Dissolver uncaged, assim rapamicina original em DMSO e em seguida em PBS (400 nM final), e adicionar a solução para a câmara de imagem para induzir efeitos globais.

4. Os resultados representativos

Um exemplo de resultados representativos é mostrado na Figura 3. Irradiação com luz UV a uma pequena região perto de uma aresta celular rapidamente induzida a formação de zonas plissados ​​apenas na e próximo da área irradiada. Para confirmar que esta era de fato a atividade local, em seguida, globalmente irradiados células com UV, ou adicionado a rapamicina para os meios de comunicação em massa, tanto de which induziram a formação ruffle global ao longo da membrana. Para uma análise quantitativa, as células alvo dividida em quatro quadrantes, e contados a frequência de formação de plissado em cada quadrante sobre local, bem como após a estimulação global sob várias condições, incluindo os controlos (Figura 4). É apenas esta combinação de irradiação UV, CRB-A, e adequados FKBP-FRB construções que induz ruffling local.

Figura 1. Esquemática da dimerização de proteínas espacialmente confinado usando gaiolas rapamicina-avidina conjugada (CRB-A) e luz UV. Irradiação UV cliva o ligante entre rapamicina e biotina, resultando na libertação de química dimerizer (HE-Rapa, C40-O-(2-hidroxietil) rapamicina) e do seu sub-produto. O dimerizer liberado em seguida, difunde para as células e induz a dimerização entre FKBP-POI (proteína de interesse) e memb plasmarane ancorado FRB apenas na proximidade da região irradiada (círculo azul). Sem a irradiação UV, FKBP e FRB não associado (cruz vermelha), portanto, não produzindo efeito. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Figura 2. Imagem do microscópio confocal personalização de fluorescência. (A) Vista frontal do microscópio confocal (invertido Axiovert 200, Zeiss). (B) Close-up vista, topo de uma unidade de acoplamento de EPI fluorescência e iluminação UV.

Figura 3. Formação plissado espacialmente confinado numa célula NIH3T3 transfectadas induzida por irradiação UV localizada. Confocal imagens de fluorescência de uma célula de fibroblastos NIH3T3 que é transfectada com YFP-marcado FKBP-Tiam1 (Rac ativador) e LDR (membrana ancoradas FRB) foram submetidos à irradiação em uma área restrita perto de sua borda com LED luz a 365 nm durante 15 seg 210 seg a partir de, na presença de CRB-Um conjugado nos meios de comunicação a granel. Este tratamento foi seguido de iluminação global com lâmpada de mercúrio durante 1 seg a 1063 adição seg e global de rapamicina finais 400 nM em 1560 seg. A célula mostrou quase nenhuma atividade despenteando no início (a), mas mostrou espacialmente confinado despenteando após a iluminação localizada (círculo amarelo) (b). A célula mostrou a formação plissado global após iluminação global e adição de rapamicina (cd), indicando que a formação de plissado local foi causada por activação espacialmente confinado de rac. Barra de escala: 10 um. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Figura 4. Frequência de formação de plissado em quadrantes de transfectadas células NIH3T3. Irradiação UV local com CRB-A e irradiação UV seguinte global foram realizados em 13 células. CRB-A adição (sem irradiação de UV), irradiação UV local com ou sem avidina foram aplicadas sobre as células 13, 5 e 6, respectivamente. Nenhuma das células observados mostrou a formação de plissado com CRB-A, sem irradiação de UV, ou irradiação de UV local com ou sem avidina em meios a granel. Foram colhidos dados a partir de células com baixa formação de fundo plissado, mas que tinha a capacidade de rapamicina induzida por formação de plissado, que verificada após cada experiência, confirmando a formação de plissado global como um resultado da adição de rapamicina (finais 400 nM). Estes resultados mostraram que CRB-A e irradiação UV local são necessários para a formação plissado local nas células. (Copyright @ ACS2011) ⁶

Abreviaturas:

FKBP: FK506-binding protein
FRB: FKBP-rapamicina-binding protein
Tiam1: T-cell lymphoma invasão e metástase indutor de proteína 1 (Rac GEF)
LDR: Lyn-DSAG ligante-FRB (Lyn: N-terminal 11 aminoácidos da Lyn quinase)
HE-Rapa: C40-O - (2-hidroxietil) rapamicina
crb: rapamicina enjaulado com porção biotina
CRB-A: crb conjugada com avidina

Nós descrevemos uma técnica que utiliza um novo composto engaiolados em conjunto com o sistema de heterodimerização FKBP-FRB, a fim de manipular Rho actividade GTPase a uma localização precisa subcelular numa escala de tempo de segundos.

Há três limitações da presente abordagem. Em primeiro lugar, porque o método baseia-se na prevenção ou permitindo a difusão de dimerizer através da membrana plasmática, a localização do alvo celular necessita de ser membrana plasmática ou na sua vizinhança. Optimização adicional da estrutura química do crb pode permitir que o composto para entrar nas células sem induzir a dimerização até irradiação de luz. Com tal dimerizer um, poderíamos, em teoria, manipular actividade de moléculas de sinalização em qualquer lugar no interior das células. Em segundo lugar, a difusão molecular de dimerizers químicos, FKBP-FRB complexos dimerização, ou endógenos ativados moléculas sinalizadoras podem afetar significativamente o confinamento precisa dos efeitos pretendidos. Este efeito é particularmente pronunciadaem pontos de tempo mais tarde e é dependente de parâmetros associados com a irradiação de UV (tais como a largura do feixe, a energia, e modo de feixe (contínua vs pulsado)) e os coeficientes de difusão dos compostos envolvidos. Optimização empírica adicional destes parâmetros permite confinamento mais rigoroso das actividades de sinalização. Em terceiro lugar, uma luz UV exibe não trivial fototoxicidade para as células. Uma maneira fácil para melhorar este problema é usar um comprimento de onda de 405 nm, tais como para libertar da gaiola grupos enjaulamento nitrobenzilo. Dois fotões iluminação para uncaging permite iluminação durante a um comprimento de onda ainda mais tempo, bem como a região extremamente localizada de células. Recentemente, outros investigadores relataram uma abordagem elegante para activar Rac numa localização subcelular utilizando proteínas de plantas sensíveis à luz ^8-11. Até agora, a sua aplicação é limitada a apenas poucas proteínas. Comparado com as suas estratégias, a nossa técnica atual é mais facilmente adaptável para expandir o número de proteínas-alvo extenso e sem time consome re-engenharia. Nós e outros já desenvolveram uma variedade de sondas de dimerização que podem manipular a actividade de diversas moléculas de sinalização na membrana plasmática ^{5, 6, 12-14.} Spatiotemporally dinâmicos eventos celulares estão agora directamente testável.

Não há conflitos de interesse declarados.

Este estudo foi financiado pelo NIH o financiamento da investigação (DK090868 e GM092930 de TI). Existe uma patente pendente sobre um análogo rapamicina enjaulado.