不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製

この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。

神経細胞下分画技術がシナプスとの間で売買されているタンパク質の定量化を可能にします。もともと1960年代後半に記載されるように、シナプス形質膜に関連するタンパク質は、ショ糖密度勾配超遠心分離によって単離することができる。シナプス膜が単離されると、シナプス後密度として知られている高分子複合体は、続いて、その界面活性剤不溶性に単離することができる。シナプス形質膜およびシナプス後密度タンパク質を単離するために使用される技術は、40年後に本質的に同じままであり、広く現在の神経科学の研究で​​使用されている。この記事では、不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後密度に関連するタンパク質の分画について詳しく説明します。得られたタンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。

ニューロンは、シナプスを介して通信しており、この通信の品質はシナプスにおけるタンパク質の組成変化によって大幅に規制されている。特に、シナプス後密度で存在するタンパク質は、そのシグナル伝達系¹と密接に足場神経伝達物質受容体による神経細胞のコミュニケーションに参加しています。さらに、シナプス効力の強度の持続的な変化は、シナプス後密度^1-6で追加または受容体を除去することによって制御されている。したがって、シナプスタンパク質の単離および定量化は、神経細胞がシナプス効力^7を刺激し、変更するための対応方法への洞察を得るために必要かつ有用な技術である。この記事では、不連続ショ糖勾配超遠心分離によって齧歯類脳組織からシナプスのタンパク質を分離するために一般的な手法について説明します。シナプス形質膜画分を濃縮することができるとに基づいて単離さ経験的に1.2Mのショ糖に類似すると判断されたショ糖でのその密度、。

生物学的問題によっては、細胞下画分は、スクロース又はパーコールのいずれかの連続または不連続勾配によって分離することができる。連続勾配は、複数の画分へのタンパク質の分離を可能に。これは、与えられた画分⁸内のタンパク質の共局在を実証するために特に有用であり得る。しかし、連続的な勾配の調製は、より面倒であり、多くの用途のためには不要である。不連続勾配は調製が比較的容易であり、少数の、一般的に定義された画分にタンパク質を分離するために使用することができます。増加モル濃度の三スクロースの層から構成されている不連続勾配が広くシナプス形質膜（SPM）に関連するタンパク質を単離するために使用されてきた。このシナプス形質膜画分は、さらに、シナプス後密度fractioに加工することができる界面活性剤不溶性画分の界面活性剤処理および分離によりn（PSD）。

このプロセスは、最初に1960年代^9,10に記載されたときに、電子顕微鏡は、大まかに、シナプス形質膜およびシナプス後密度画分^9-14を定義細胞小器官、膜を実証した。これらの研究は、シナプス前および後膜とSPM画分中のシナプス小胞を含めることを実証した。界面活性剤処理した後、主に電子密度の高い、シナプス後密度が見えた。手順では、低張性ショックは、電池本体¹⁰からシナプスプロセスをピンチオフするために使用される。このステップは、ミトコンドリア浸透圧ショックに対してより耐性であり、無傷のままであり、従ってそれらはショ糖勾配（ 図1）の底部に沈降するという事実を利用する。

これと同じ濃縮技術を使用して、SPMとPSD画分を生化学的に最初でした主要なタンパク質成分^15〜17のポリアクリルアミドゲル電気泳動および配列決定によって定義される。続いてウェスタンブロット分析（ 図2）、これらの画分を定義し、さらに検出し、シナプスのタンパク質のレベルを定量化するために使用されている。私たちは、SLC6A3遺伝子座をマウス¹⁸で重複しているときに発生するドーパミントランスポーターのシナプスレベルの変化を定量化するために私たちの研究室でこの技術を使用している。また、DISC1のインタラクトーム¹⁹の一部であるタンパク質中のシナプス特異的な減少を明らかにNMDA受容体欠損マウスでは、この技術を使用している。

これは、SPM画分を、シナプス小胞膜タンパク質、エンドソームのマーカー、ミトコンドリアタンパク質、膜結合合成酵素およびシグナル伝達分子、ならびにシナプス後密度の不可欠な構成要素とシナプス形質膜^20〜23を含有し、ウェスタンブロット分析から明らかである。 EVEN PSD画分を豊富ミトコンドリアタンパク質の混入を持つことができ、それは彼ら^13を除去する第二の勾配沈降または追加の精製工程を実行する必要があるかもしれない。最近では、定量的な質量分析だけでは、シナプス後密度の100以上のタンパク質のリスト、ならびにこれらの構成要素^24,25の相対存在量の指標を提供してきました。

以下のプロトコルは、動物管理のカナダの協議会のガイドラインに準拠し、トロント大学の医学部や薬学部動物実験委員会によって承認されています。

表1に記載のように1。必要な試薬を準備する

1. 表1に概説濃度ですべてのスクロース溶液、緩衝液にプロテアーゼおよびホスファターゼ（必要な場合）阻害剤を加え、のddH ₂ O。重要：実験の開始に先立って試薬や機器のすべてを、4℃でのすべての手順を実行して、事前にクール。油性マジックで超遠心管を含め、全てのチューブにラベルを付けます。

適切な脳領域の2解剖

1. 頸椎脱臼または断頭により動物を生け贄に捧げる。ハウスとは、動物のケアに関する制度や政府の方針に従って動物を安楽死させる。
2. 急速番目を削除チルド解剖台の頭蓋骨と場所からの電子の脳。
3. 新鮮な組織から適切な脳領域を解剖し、ステップ3に進みます。

モーター駆動ガラステフロンホモジナイザーで3組織の均質化

1. 0.32 M HEPES緩衝ショ糖溶液4ml含む標識13ミリリットルポリプロピレンチューブ中で解剖組織（SPM用）50〜100 mg、または（PSD用）100〜200ミリグラムを置きます。 15ミリリットルに試料を移す先細ガラステフロン組織グラインダー/ホモジナイザー、900rpmで（設定7）にモータ駆動に設定し、30秒かけて12ストロークでサンプルを均質化する。サンプル間の異なるガラステフロンホモジナイザーを使用するか、またはサンプル間の冷蒸留水でホモジナイザーをすすぎ、キムワイプで拭いて乾かしてください。注：組織の最大4グラムを0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液4mlに均質化することができる、しかし、それは適切な分別を保証するために少ない組織を使用することをお勧めします。
2. Tバックホモジナイズサンプルを転送同じ13ミリリットルポリプロピレンチューブO。予備後続のタンパク質定量、総タンパク質画分のウェスタンブロット分析のために-80℃でホモジネートし、店舗100μlの。

核画分を削除する4。低速遠心（上清S1に利回り）

1. 遠心し、4℃で10分間、900×gで固定角ローターでホモジネート。新しい上清（S1）を移し、13ミリリットルチューブを標識し、0.32MのHEPES緩衝スクロースを500μlの核画分のペレット（P1）を懸濁します。 NOTE：（P1）画分は-80℃で保存し、核画分のウエスタンブロット分析のために使用することができる。

粗製シナプトソーム画分の5。エンリッチメント（利回りペレットP2）

1. 4℃で15分間のを10,000×gで遠心上清（S1）。その後のタンパク質定量のために-80℃で保存するために上清（S2）、および予備マイクロチューブ内の500μlのを削除しますificationおよび細胞質/光膜画分のウエスタンブロット分析。 0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液1ml中に残った粗シナプトソーム画分をペレット（P2）に再懸濁し、別の3ミリリットルの0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液を添加する。
2. 4℃で15分間、10,000×gで遠心する。その後のタンパク質の定量化および細胞質/光膜画分のウエスタンブロット分析のために-80℃で保存するためのマイクロ遠心チューブに上清（S2 '）と予備500μlのを削除します。ポリプロピレンチューブに洗浄された粗シナプトソームペレット（P2 '）を保存します。

粗製シナプトソーム画分の6。·ライジング（低浸透圧ショック）

1. 溶解のddH ₂ O 1ml中に再懸濁することによりポリプロピレンチューブ中の粗シナプトソームペレット（P2 '）のddH ₂ Oを別の3mlをガラステフロン組織ホモジナイザーに移し、追加し、3ストロークで、手で均質化する。注：これは重要です可能な限り迅速に、この手順を実行し、すぐに6.2に進みます。
2. バック同じ13ミリリットルのポリプロピレンチューブに、急速にホモジナイザーからの振替サンプル混合する反転、1M HEPES溶液の16μlのバック4のHEPESにサンプルを調整します。
3. 完全な溶解を確実にするために30分間、4℃でサンプルを回転させます。

シナプトソーム膜画分の7。エンリッチメント（P3）

1. 4℃で20分間25000×gで遠心する。原油水疱分画上清（S3）を取り外し、その後のタンパク質定量およびウエスタンブロット分析のために-80℃で保存するために5ミリリットルチューブにそれを予約。 0.32 M HEPES緩衝スクロース溶液1mlにシナプトソーム膜画分（P3）を再懸濁する。

不連続ショ糖勾配の8。準備

1. ピペットで正確に3.5ミリリットルの1.2M HEPES緩衝ショ糖溶液の正確3.0ミリリットルそれぞれ1.0 Mおよび0.8 M HEPEの独立した6ミリリットル中に、S-緩衝化ショ糖溶液はキャップチューブをはめ込みます。注：このスクロース勾配を作るために使用される緩衝液の体積を予め測定するために行われる。ボリュームの正確な測定は、得られた勾配超遠心分離のためにバランスされることを保証することが重要である。
2. ガラスパスツールピペットや電球を使用して、12ミリリットルポリアロマー超遠心管に1.2MのHEPES緩衝スクロース溶液を移す。慎重に1.2MのHEPES緩衝スクロース溶液の上に1.0MのHEPES緩衝スクロース溶液をレイヤー。最後に、1.0MのHEPES緩衝スクロース溶液の上に0.8MのHEPES緩衝スクロース溶液をレイヤー。各ショ糖溶液のために、新鮮なパスツールピペットを使用し、ショ糖勾配を乱さないように注意してください。ベンチボルテックスまたはマイクロ遠心からの振動は、勾配の整合性を乱す。
3. パスツールピペットを使用して、調製された不連続ショ糖勾配の上に再懸濁したシナプトソーム膜画分（P3）の層。勾配がスイングバケットローターのバケツの中にそれらの重量を測定することによってバランスされていることを確認。バケットがバランスの取れていない場合は、慎重に勾配の上部に0.32 M HEPES緩衝蔗糖を追加し、ローターバケットのバランスをとるP200ピペットを使用しています。

シナプス形質膜（SPM）の9分画

1. 4℃で2時間150,000×gで、スイングバケットローターで超遠心分離機。慎重に超遠心バケットからショ糖勾配を削除します。 18 G針および1mlシリンジを用いて、1.0 M / 1.2 M HEPES緩衝スクロース溶液相間の下部にチューブを穿刺し、シナプス形質膜層（SPM）を引き出す。
2. 各SPMサンプルは1mlシリンジに占めるボリュームをメモしておいてください。各サンプルが調整された後、正確に4のHEPES、2.5容量の0.32 Mに1.2 Mからスクロース濃度を調整するために追加し、3.5ミリリットル厚肉超遠心管に集め、SPM層を配置edは0.32 Mスクロース、0.32MのHEPES緩衝ショ糖溶液で試験管のバランスをとる。
3. 4℃で30分間200,000×gで固定角ローター中で超遠心機。上清を除去し、廃棄する。 50のHEPES / 2mMのEDTA溶液300μlのシナプス形質膜ペレット（SPM）を再懸濁します。 -80℃で保存サンプルは、ウェスタンブロッティングに使用するまで。

シナプス後肥厚画分の10。準備（PSD）

1. 氷上でのSPMのサンプルを解凍する。
2. 50のHEPES / 2のEDTA溶液中の0.54％トリトンX-100の溶液を作る。
3. 5ミリリットルポリスチレンチューブ中で、トリトンX-100 / HEPES / EDTA溶液および300μlのSPMフラクション2.7mlのを結合し、4°Cで15分間試料を回転させる
4. 4°Cで20分間32,000×gで3.5ミリリットル厚肉超遠心管、遠心サンプルに転送サンプル。
5. -80上清（トリトンX-100可溶性画分[TS]）​​と店舗を予約;°C。注：この段階では、ペレットは「PSD-1T」割合を表す。界面活性剤による第二の治療は、「PSD-2T」部分を生成します。 PSD-1T画分が所望される場合、10.6に進む。
   1. PSD-2T分画を生成するために、50mMのHEPES / 2mMのEDTA溶液中で0.5％トリトンX-100 3mlにペレットを再懸濁する。 4℃で15分間、サンプルを回転させます。 4℃で20分間、32,000×gで遠心分離した試料とは10.6に進みます。
6. 上清を捨て、50のHEPES / 2のEDTA溶液中のシナプス後（PSD）ペレットを再懸濁。注：再懸濁体積はペレットのサイズに依存してもよい。 50〜75μlの容量を推奨します。 PSD画分は、界面活性剤不溶性画分であるため、タンパク質の完全な再懸濁を可能にするために0.5％SDSの1〜2μlを添加することがしばしば必要である。 -80℃で保存サンプルは、ウェスタンブロッティングに使用するまで。

ショ糖密度勾配の調製は、ショ糖の3モルソリューション（0.8、1.0、1.2 Mショ糖）の明確な分離をもたらすはずである。タンパク質サンプルを添加する前勾配の例については、 図3Aを参照してください。勾配は、事前にあまり用意され、またはそれは他の機器からの振動をベンチ表面上に用意されている場合、勾配が損なわれ、適切な分離が達成されない場合。三つの溶液の明確な分離が表示されていない場合には、タンパク質試料を追加する前に、新しいグラデーションを作成することをお勧めします。タンパク質サンプルが追加されたショ糖勾配（黒矢印）の例については、 図3（b）を参照してください。

遠心分離後、各間期におけるタンパク質画の明確なバンド（0.32 / 0.8、0.8 / 1.0、1.0 / 1.2）があるはずです。加えてペレットをチューブの底に見えるはずです。例については、 図3Cを参照してください超遠心分離後の留バンドの。画分だけ、間で拡散して存在している場合、それは勾配が侵害された更なる処理をお勧めされていない可能性があります。

マウスの線条体からの総、SPM及びPSD1Tタンパク質試料のウェスタンブロッティング図2に示されている。のGluR1、PSD95、およびCaMKIIのようなシナプスのタンパク質の濃縮を、合計、SPMからのタンパク質（10μg）を一定量をロードすることによって視覚化することができる、およびPSD画分。ドーパミントランスポーター（DAT）のようなPerisynapticタンパク質は、SPM画分に濃縮されているが、PSD濃縮プロセスのその後の洗剤のステップで除去される。

同等のローディングを確実にするために、タンパク質レベルはポンソーレッド²⁶で染色してウエスタンブロット膜上で視覚化することができる。抗体ベースの「負荷制御」は、シナプスタンパク質は差分かもしれないので、多くの場合、文献に報告されているが、これは誤った名称であってもよいerentially実験的治療群で規制。抗体ベースの「負荷制御」が所望される場合は、最初ポンソー染色により同等のタンパク質負荷を決定し、別の実験群において変化しないものを同定するためにいくつかの基準タンパク質をテストすることが望ましい。

SPMとPSD蛋白分画を豊かにする細胞下分画の図1のワークフロー。

タンパク質抽出物を図2マウスの線条体からの総、SPM、およびPSD1Tタンパク質の代表的なウエスタンブロット。10μgのは、SDS-変性、10％アクリル上で分離したアミドゲル、およびPVDF膜に移した。その後、これらのブロットを、後シナプス密度のすべてのコンポーネントであるαCaMKII、GluR1の、PSD-93、およびPSD-95のための一次抗体と共にインキュベートした。したがって、これらのタンパク質はSPMとPSD画分に濃縮される。交互に、ブロットは線条体におけるシナプス前膜に位置しているDATのための一次抗体と共にインキュベートした。 DATは、SPM画分に濃縮されるが、それはPSD複合体の一部ではなく、免疫反応性はPSD画分に観察されない。いくつかの実験条件も同様にこれらのタンパク質のレベルに影響を与えるかもしれないがアクチンまたはナトリウム/カリウムATPアーゼし（Na / Kポンプ）に対する抗体を、ローディングコントロールとして使用することができるので、適切なローディングコントロールは、経験的に決定されなければならない。

図3。 ショ糖勾配の代表的な例として前と超遠心分離後に。勾配を調製した後、Aは 、チューブは、光にかざしたときに表示されている3段階があるはずです。白い矢印は、0.8 / 1.0 Mショ糖溶液、および1.0 / 1.2 Mのショ糖溶液間の中間相を示している。B.サンプルは、勾配の上にロードされると、それは0.32 Mショ糖溶液内にあり、0.8の上に残りますのスクロース層℃で遠心分離した後、ホモジネートは、いくつかの画分に分離される。 0.8 / 1.0 Mショ糖溶液の相間での浮遊画分は、ミエリン膜に濃縮されます。 1.0 / 1.2 Mのショ糖溶液の相間での画分は、針およびシリンジを用いて収集されるSPMの割合を表す。チューブの底にペレットをミトコンドリアタンパク質のために濃縮される。

表1に必要な試薬

細胞成分分画を区別するタンパク質マーカーの表2にリスト

成功した結果のために重要である手順にはいくつかのステップがあります。ステップ3では、均質化の一貫性の程度は、各サンプルについて達成されることが重要である。モーター駆動ホモジナイザーで組織を均質化する場合には、一定の速度を乳棒の回転のためだけでなく、ストローク数でも利用される。低張液の拡張均質化またはインキュベーションがミトコンドリアを溶解し、SPMサンプルを汚染するので、浸透圧ショック時のインキュベーション時間は、正確である必要があります。

もう一つの重要なステップは、試薬、特にスクロース溶液の調製である。ショ糖溶液のモル濃度が正しくない場合は手順が動作しません。したがって、スクロース溶液は、その後、正確な最終容量に4のHEPESを加える4のHEPES溶液中に溶解させ、ショ糖の重量を測定することによって準備する必要があります。トラブルシューティングのヒント：ENに準備されたショ糖溶液を用いた試験勾配を構築勾配が適切に組み立てられていることを確認してください。三つの異なる層の可視化を支援するための3つのスクロース溶液のうちの2つに（例えば、w / vの0.005％-0.02％の最終濃度）のブロモフェノールブルーの濃度を変化させ追加します。

これは、勾配が組み立てられたとき、チューブを遠心分離したときの間の時間の量を制限することが重要である。通常の拡散は、時間をかけて勾配を破壊し、勾配が保存されているベンチに振動がある場合、これが加速される。正確なボリュームがガラスパスツールピペットでピペッティングしされるために個別のアリコートへのソリューションの予備ピペッティングが可能になる。これはまた、勾配超遠心分離アセンブリとの間の時間が短縮されます。トラブルシューティングのヒント：実験のためのショ糖勾配と同時に上記のようにブロモフェノールブルー染料で「テスト勾配」を構築。勾配の完全性は、このように経時的にモニターすることができる。テスト勾配となる拡散の指標勾配が事前にすぎ組み立てられるや振動にさらされている場合。

最後に、それは続いて水の2.5倍量の試料を希釈する必要があるため、できるだけ小さい容積のSPMサンプルを収集することが重要である。理想的には、サンプルは、1ccの注射器を用いて0.4〜0.7ミリリットルの容量で収集する必要があります。これは、勾配超遠心分離アセンブリとの間の時間を制限するために、ステップ7で最後の20分間のスピンの間に不連続勾配を構築することをお勧めします。

プロトコルは、異なる画分のすべてを確保し、その後の分析のために-80℃で、これらを格納するための推奨事項が含まれています。当社は、これらの画分のわずかに図2のシナプス後のタンパク質の濃縮を実証した。しかし、その分布を理解する画分のそれぞれに目的とする蛋白のレベルを測定することをお勧めします。 DISTRIBの比較他の細胞内マーカータンパク質画分中のタンパク質のutionも実験条件が必要な分画を達成したことを確認するのに役立ちます。 表2は、分別の段階の指標として使用することができ、一般的に使用されるタンパク質マーカーをまとめた^{8,27- 38。}

不連続ショ糖勾配の利用は広くシナプス形質膜を豊かにするために使用されます。このメソッドは、作成が容易であり、特別な装置を必要としない不連続ショ糖勾配での連続パーコール勾配よりも有利である。しかし、この方法は、正確に、目的のタンパク質を局在化するのに十分でない可能性があり、これらの用途にパーコール勾配が好ましい場合がある。

The authors have no conflicts of interest to disclose.

The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).