Identificazione dei roditori I

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Un requisito fondamentale della ricerca biomedica è la corretta identificazione degli animali da ricerca. È essenziale che l'animale giusto venga utilizzato per le procedure e la raccolta dei dati. Topi e ratti di laboratorio possono essere identificati con i seguenti metodi permanenti: marchi auricolari, codici di punzonatura auricolare, impianto di microchip, tatuaggi di coda per topi adulti e tatuaggi delle dita dei dita per neonati. Metodi temporanei di coloranti e penne per marcatura possono essere utilizzati anche per studi acuti. Questo video copre gli aspetti tecnici dell'ear tagging e della punzonatura per topi e ratti, nonché i benefici di ciascuno rispetto al tipo di ricerca condotta sugli animali. La conoscenza delle tecniche di ritenuta manuale di base per ciascun animale (trattata in un video separato) è necessaria affinché questi metodi di identificazione siano correttamente eseguiti.

I marchi auricolari sono economici e facili da eseguire e, di conseguenza, sono comunemente usati per l'identificazione di singoli topi e ratti. I tag possono essere personalizzati con una serie di numeri e/o lettere. Assegnazione di codici specifici a un ceppo di topo/ratto, o a un Principle Investigator (PI), aiuta nella tenuta dei registri e nella gestione del database, specialmente nelle grandi colonie riproduttive dove ci sono più ceppi e PI. Inoltre, ci sono una varietà di tag disponibili in commercio. Le etichette metalliche hanno caratteri incisi su di esse. Sebbene questa incisione sia chiara, quando si lavora con un mouse è spesso necessario raccoglierlo per leggere il codice sui tag a causa delle piccole dimensioni dei tag. Altre opzioni sono etichette di plastica con numeri e / o lettere su sfondi dai colori vivaci o etichette di plastica con un codice a barre sulla superficie anteriore. Entrambe queste opzioni consentono di leggere i tag senza dover gestire gli animali. Un altro vantaggio dei tag di plastica è la loro compatibilità con l'imaging MRI.

Il posizionamento del tag sull'orecchio è fondamentale, in quanto un posizionamento improprio può avere diverse conseguenze sfortunate. Le etichette devono essere posizionate in modo tale da non causare una curva nella pinna, interferire con la mobilità dell'animale o catturare qualsiasi parte della ingabbiatura. Se il tag è posizionato troppo vicino al bordo dell'orecchio, può essere facilmente strappato dal tessuto pinna. Se posizionato troppo vicino alla testa, la pelle della zona del collo può catturare nel tag, il che creerà irritazione, dolore e movimento limitato. Questo può quindi portare a un auto-trauma da parte dell'animale che graffia il tag, lo strappa dall'orecchio o si impiglia un piede nel tag. La formazione per un corretto posizionamento e tecnica è essenziale. ¹

Mentre i tag forniscono identificatori individuali per topi o ratti, non sono infallibili. I tag possono essere persi a causa di combattimenti, eccessiva toelettatura, dermatite in ceppi sensibili, infezioni o auto-traumi. ² I ratti adulti in particolare sono meno tolleranti nei confronti dei marchi auricolari e spesso li rimuovono, infliggendo auto-traumi. Il comportamento riproduttivo più aggressivo nei ratti può anche portare a strappare un marchio auricolare dalla pinna. Se topi o ratti sono accoppiati o alloggiati in gruppo, la perdita di un marchio auricolare su più di un animale può essere fastidiosa. Per aggirare questo problema, dovrebbe essere utilizzata una forma secondaria di identificazione, come un codice di punzonatura utilizzato sull'orecchio opposto al tag o un tatuaggio della coda o della dito. Una struttura dovrebbe standardizzare sia la scelta dell'orecchio da taggare sia il codice da utilizzare sull'altro orecchio o sulle dita dei piedi. Tutti i codici devono essere indicati sulla scheda della gabbia.

L'uso di codici di punzonatura auricolare consente un metodo di identificazione rapido e semplice, ma la tecnica ha dei limiti. I codici comunemente usati hanno un limite superiore per i numeri disponibili per l'uso, di solito un massimo di 100 a 399. Per leggere i codici dei pugni all'orecchio, la maggior parte degli animali deve essere afferrata alla collottola. I punzoni possono raddoppiare come campioni di tessuto per la genotipizzazione PCR, che consente di eseguire contemporaneamente l'identificazione degli animali e il campionamento del genotipo. Ciò si traduce in meno stress per gli animali dalla manipolazione ripetuta. ³

Esistono tre stili di pugni all'orecchio: il pugno a forbice, il pugno al pollice e il pugno a leva. Sebbene tutti siano ugualmente efficaci, ci sono vantaggi e svantaggi per ciascuno. Ad esempio, quando i ratti invecchiano, la pelle delle loro orecchie si ispessisce. È meglio eseguire i pugni all'orecchio sui giovani ratti mentre vengono svezzati. Per i ratti adulti che richiedono l'identificazione, deve essere preso in considerazione l'uso dell'anestesia inalante. Ergonomicamente, il punch di livello è più facile da usare di un pugno al pollice, specialmente per le orecchie più spesse dei ratti più anziani. Tuttavia, entrambi questi pugni richiedono un movimento di pizzicamento delle dita. Il punzone a forbice ha il vantaggio ergonomico di non richiedere un movimento di pizzicamento, evitando così affaticamento e lesioni del tunnel carpale. Al contrario, il punzone del pollice è vantaggioso per la raccolta di campioni di genotipizzazione, poiché le punte con il materiale tissutale si adatteranno a un tubo di Eppendorf. Lo stile di punzonatura da usare dovrebbe essere determinato dagli individui che eseguono il compito e dall'età dei ratti.

Per i ratti, sebbene i tag metallici siano più spesso utilizzati, gli studi hanno dimostrato che ci sono conseguenze nell'usarli. Infiammazione, cambiamenti neoplastici e persino dolore cronico sono stati osservati in animali che hanno indossato marchi auricolari metallici per diversi mesi. ^3,4,5,6 Le etichette devono essere prontamente rimosse dall'orecchio in caso di reazione avversa e la lesione successiva deve essere esaminata e trattata, se necessario, dal personale veterinario.

Una corretta cura e manutenzione dei punzoni ne estenderà l'uso. Tutti i tipi di punzoni si opacizzeranno se autoclavati, quindi si consiglia di pulirli con un disinfettante e risciacquarli con alcool. Quindi, devono essere accuratamente asciugati per evitare la ruggine. Se i punzoni vengono utilizzati per la PCR, devono essere immersi per 3 minuti in una soluzione che rimuove il DNA residuo o l'RNA. Prima dell'uso vengono risciacquati in alcool e asciugati.

1. Identificazione del punzone dell'orecchio

I codici di punzonatura auricolare sono stati sviluppati come metodo rapido ed economico per etichettare i singoli animali. Esistono tre stili di pugni all'orecchio: il pugno a forbice, il pugno al pollice e il pugno a leva. L'orecchio destro dell'animale è usato per le singole cifre, l'orecchio sinistro per decine e il centro delle orecchie per centinaia.

1. Trattenere l'animale in modo che le orecchie siano facilmente accessibili. La maggior parte dei topi sono marcati con l'orecchio per l'identificazione individuale allo svezzamento. Ciò richiede una manipolazione delicata a causa delle loro dimensioni più piccole e fragili. Alcuni topi hanno meno probabilità di lottare se gli arti posteriori possono poggiare su una superficie come una parte superiore della gabbia o un piano di lavoro.
2. Determinare i pugni all'orecchio necessari per corrispondere al numero sperimentale dell'animale o per identificarlo all'interno di una gabbia.
   1. I punzoni saranno tacche o fori a seconda del codice utilizzato.
   2. L'ultimo numero sul marchio auricolare viene spesso utilizzato come identificatore del punzone auricolare quando è il metodo secondario di identificazione.
   3. Se gli animali sono in uno studio a breve termine in gruppi di gabbie stabili, possono ricevere numeri sequenziali. Questo viene spesso fatto quando non ci sono marchi auricolari presenti.
3. Fai il pugno all'orecchio.
   1. Per fare una tacca, il pugno è posto sul bordo della pinna dell'orecchio.
   2. Per fare un foro, posizionare l'orecchio nel pugno in modo che il foro del punzone sia posizionato lontano dal margine della pinna nella posizione desiderata.
   3. Applicare una pressione sul pugno del pollice o della leva o chiudere il punzone a forbice in modo rapido e deciso per tagliare la pelle dell'orecchio.
   4. Sollevare delicatamente il pugno lontano dall'orecchio quando si usano i pugni del pollice o della leva. Apri il punzone a forbice per rimuoverlo dall'orecchio.
   5. Evitare di tirare o torcere il pugno per evitare di strappare l'orecchio.
   6. I pugni diventano noiosi dopo il tempo. Se un pugno non riesce a tagliare l'orecchio, rilascia il pugno e seleziona un nuovo pugno all'orecchio. Riposizionare il nuovo punzone nello stesso punto.
4. Pulire i punzoni dopo ogni utilizzo.
   1. Tutti i tipi di punzonatura si opacizzeranno se autoclavati. Si raccomanda di pulirli con un disinfettante e risciacquati con alcool. Asciugarli accuratamente per evitare la ruggine.
   2. I punzoni auricolari da utilizzare per la PCR vengono regolarmente immersi per 3 minuti in una soluzione per rimuovere il DNA o l'RNA residuo. Prima dell'uso vengono risciacquati in alcool e asciugati.

Figura 1. Punzonatura dell'orecchio nei topi usando il pugno a forbice.

2. Identificazione del marchio auricolare

I marchi auricolari personalizzati possono essere ordinati dai produttori con codici alfabetici e / o numerici, il che consente la differenziazione di ceppi di topo o investigatori. I marchi auricolari possono essere fatti di metallo o plastica.

1. Selezionare i marchi auricolari appropriati per gli animali da identificare. Esistono diversi stili di applier disponibili presso i produttori di marchi auricolari. Assicurati di ordinare l'applier che è per la dimensione e lo stile specifici dei marchi auricolari utilizzati.
2. Rimuovere delicatamente un tag dal supporto di cartone e orientarlo nell'applier in modo che l'estremità con il foro sia posizionata sopra l'area dentellata dell'applier. L'estremità appuntita del tag dovrebbe essere opposta alla tacca.
3. Trattenere l'animale in modo che le orecchie siano facilmente accessibili. Gli animali possono avere meno probabilità di lottare se gli arti posteriori possono poggiare su una superficie, come una parte superiore della gabbia o un piano di lavoro.
4. Posizionare correttamente il marchio auricolare per il posizionamento.
   1. Posiziona il punto del marchio auricolare il più profondamente possibile nella concha dell'orecchio, in modo che i numeri del tag siano rivolti verso la parte posteriore dell'animale.
   2. Per avere i numeri del marchio auricolare rivolti verso il naso dell'animale, posizionare la punta del tag alla base della pinna sul retro dell'orecchio.
5. Applicare il tag.
   1. Spremere saldamente l'applier chiuso. Il marchio auricolare forerà l'orecchio e si bloccherà insieme.
   2. Rilascia l'applier e l'orecchio taggato cadrà dall'applier.

Figura 2. Un mouse con un marchio auricolare posizionato correttamente sulla pinna.

6. Rimuovere i marchi auricolari in metallo.
   NOTA: A volte, i marchi auricolari in metallo possono causare irritazione e gonfiore dell'orecchio. Il gonfiore e l'irritazione spesso portano a infezioni della pinna. Il trattamento dovrebbe includere la rimozione del tag; tuttavia, in caso di grave irritazione o infezione, l'animale potrebbe aver bisogno di essere anestetizzato.
   1. Rimuovere i detriti intorno all'etichetta con un applicatore con punta di cotone inumidito con una soluzione antisettica.
   2. Tagliare la parte superiore del loop del tag da un bordo all'altro con taglierine a filo. Non tagliare la superficie piana, in quanto ciò comprimerà l'etichetta, pizzicherà l'orecchio e causerà ulteriori danni.
   3. Evitare di applicare la coppia durante il taglio per evitare di strappare l'orecchio.
7. Usa gli ermoni per stendere le estremità tagliate del marchio auricolare.
   1. Guidare delicatamente il marchio auricolare attraverso e fuori dall'orecchio usando gli omestati. Ridurre il trauma evitando l'allargamento del foro di perforazione e facendo scivolare fuori il tag in modo che l'estremità crimpata non passi attraverso l'orecchio.
   2. Una volta che il tag è sparito, pulire l'orecchio con un applicatore di cotone imbevuto di antisettico.
   3. Se c'è una scarica purulenta dall'orecchio, può essere necessario un trattamento di follow-up e si raccomanda la consultazione con il personale veterinario per la valutazione.

Quando si sceglie il metodo di identificazione appropriato, molti fattori devono essere deliberati. Ogni tecnica presenta vantaggi e svantaggi che devono essere considerati in relazione alle esigenze sperimentali. Mentre i costi devono essere pesati insieme ad altri fattori, la facilità della tecnica e il livello di disagio per gli animali dovrebbero essere le considerazioni principali. ^3,4

La punzonatura / tacchetta dell'orecchio è comunemente usata nei topi e nei ratti perché c'è poco costo e la procedura è facilmente eseguibili. Ci sono un numero limitato di codici che possono essere utilizzati, con la maggior parte dei codici che hanno un limite superiore da 100 a 399. Per leggere i codici dei pugni all'orecchio, la maggior parte degli animali deve essere afferrata alla collottola. Tuttavia, i punzoni possono raddoppiare come campioni di tessuto per la genotipizzazione PCR, il che consente di eseguire contemporaneamente l'identificazione e il campionamento del genotipo, con conseguente minore stress per gli animali dalla manipolazione ripetuta. ⁵