Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

La Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio ("La Guida") afferma che la valutazione e l'alleviamento del dolore sono componenti integranti della cura veterinaria degli animali da laboratorio. ¹ La definizione di anestesia è la perdita di sensibilità o sensazione. È un evento dinamico che comporta cambiamenti nella profondità anestetica rispetto al metabolismo di un animale, stimolazione chirurgica o variazioni nell'ambiente esterno.

È necessario un monitoraggio preciso e costante dell'anestesia per mantenere in sicurezza la profondità necessaria per una procedura. I parametri da monitorare includono frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, temperatura corporea e livelli di ossigeno nel sangue. Per topi e ratti, nessuno di questi parametri è facilmente monitorabile a causa delle piccole dimensioni corporee di questi animali. Poiché la frequenza cardiaca nei roditori è così rapida, lo stetoscopio normalmente utilizzato per l'auscultazione è inadeguato per catturare una frequenza cardiaca accurata. Lo stetoscopio può essere utilizzato solo per rilevare la presenza o l'assenza di un battito cardiaco. La frequenza cardiaca normale per un topo è di 328-780 battiti al minuto, mentre la frequenza regolare per un ratto è di 250-600 battiti al minuto. Le frequenze respiratorie nei roditori sono anche elevate al di sopra di ciò che può essere contato con precisione usando metodi visivi o durante l'auscultazione. La frequenza respiratoria normale per un topo è di 90-220 respiri al minuto, e per il ratto questo valore è di 66-144 respiri al minuto. Per accertare con precisione la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria, sono necessarie apparecchiature di monitoraggio elettronico specializzate. I sensori vengono impiantati chirurgicamente nell'animale o posizionati esternamente e interagiscono con la piattaforma di monitoraggio su cui è posizionato l'animale. ^3,4

La causa più comune di decessi correlati all'anestesia nei roditori è dovuta all'ipotermia. I roditori hanno un elevato rapporto superficie/massa corporea. Inoltre, un animale anestetizzato perde la capacità di rabbrividire per mantenere la temperatura corporea. Pertanto, il monitoraggio della temperatura corporea e il calore integrato, come una piastra riscaldante, sono essenziali durante le procedure chirurgiche di sopravvivenza. La temperatura corporea normale per un topo è 96,6-99,7 ° F (35,8-37,4 ° C)⁵ e per un ratto è 96,6-99,5 ° F (35,9-37,5 ° C). ⁵ La maggior parte dei termometri sono stati progettati per animali più grandi e modellati su quelli utilizzati per l'uomo. I termometri a mercurio sono stati in gran parte sostituiti con versioni digitali ed elettroniche. Sebbene i termometri digitali ed elettronici siano stati documentati come accurati se usati per via rettale, orale e nell'orecchio, le loro dimensioni sono inappropriate per i piccoli roditori. Le sonde rettali progettate specificamente per topi e ratti sono disponibili in commercio e il loro uso è incoraggiato.

I livelli di ossigenazione nel sangue vengono utilizzati per valutare un adeguato assorbimento di ossigeno dai polmoni con conseguente concentrazione appropriata di ossigeno nel sangue arterioso di un roditore. Il monitoraggio dell'assorbimento di ossigeno monitora anche indirettamente la respirazione e la ventilazione, in quanto rivela se esiste un'adeguata ispirazione di ossigeno e la scadenza dei gas di scarico. La frequenza cardiaca è anche implicata nell'ossigenazione del sangue, poiché una diminuzione della frequenza cardiaca comporterà una riduzione dei livelli di ossigeno, che potrebbe causare una perfusione di sangue inadeguata. ⁶

L'obiettivo dell'anestesista è quello di immobilizzare e alleviare adeguatamente tutte le sensazioni di dolore per un animale con la dose o la concentrazione più bassa di anestesia. Per raggiungere questo obiettivo è necessario valutare correttamente la profondità dell'anestesia. Ci sono quattro fasi dell'anestesia e quattro piani all'interno della fase chirurgica dell'anestesia. Durante la prima fase, l'animale diventa disorientato. Nella seconda fase, c'è una fase eccitatoria con una frequenza respiratoria irregolare, compresa la trattenuta del respiro in alcuni ceppi di topo e ratto. Anche il riflesso di raddrizzamento, che è la capacità di rotolare indietro quando viene posizionato in posizione dorsale, viene perso.

La terza fase è la fase chirurgica dell'anestesia. Nel Piano I, i riflessi palpebrali e di deglutizione sono assenti. I riflessi laringei e corneali si perdono nel Piano II. Con i Piani I e II, non ci sono amnesia o effetti analgesici; pertanto, l'animale deve raggiungere il Piano III prima dell'inizio di una procedura chirurgica. Il piano III crea la paralisi dei muscoli intercostali che si traduce in respirazione diaframmatica. Sebbene inizialmente nel Piano III ci sia solo un'analgesia parziale, progredisce fino a completare l'amnesia e l'analgesia man mano che il livello di anestesia si approfondisce. È a questo livello che l'animale viene completamente anestetizzato per una procedura chirurgica. Al Piano IV, l'animale è stato sovradosato e può seguire rapidamente lo Stadio IV.

Man mano che il livello di anestesia si approfondisce ulteriormente, ci sono complicazioni che possono causare la morte dell'animale. Nello stadio IV c'è una paralisi completa sia dei muscoli intercostali che del diaframma, che causa una grave apnea. Ciò si traduce in arresto respiratorio, paralisi midollare, collasso vasomotorio e infine la morte. Le pupille si dilatano, rimanendo fisse nella dilatazione mentre i muscoli si rilassano.

La scelta corretta degli anestetici per la chirurgia e altre procedure potenzialmente dolorose deve essere determinata da un veterinario. Questo si basa su numerosi aspetti, tra cui l'estensione e la durata della procedura, la specie e il ceppo, l'età e lo stato fisiologico dell'animale.

Gli anestetici sono disponibili come inalanti o iniettabili. L'anestesia chirurgica può essere eseguita utilizzando una combinazione di anestetici iniettabili e inalanti. ²

1. Induzione dell'anestesia inalante

L'anestesia inalante comprende isoflurano, sevoflurano e desflurano, con l'isoflurano usato più comunemente. Questi anestetici sono usati più spesso perché, con loro, è più facile controllare la profondità dell'anestesia. L'induzione dell'anestesia mediante anestetici per inalazione può essere effettuata con un barattolo a campana o una camera di induzione montata su un vaporizzatore di precisione.

1. Vaso a campana
   1. Attrezzatura: un barattolo a campana o un barattolo di essiccazione con una piattaforma perforata in ceramica o plastica, un batuffolo di cotone, un anestetico liquido (isoflurano, sevoflurano o desflurano) e una cappa aspirante ventilata all'esterno.
   2. Preparazione
      1. Utilizzare il barattolo a campana sotto un cappuccio, e non sul banco, per evitare l'esposizione del personale ai gas anestetici.
      2. Assemblare il barattolo a campana con la piattaforma nella parte inferiore, creando uno spazio tra il fondo del barattolo e la piattaforma. Questo è necessario per evitare che l'animale entri in contatto con l'anestetico liquido.
      3. Indossando guanti in nitrile o altri guanti impermeabili, saturare il batuffolo di cotone con anestetico.
      4. Posiziona il batuffolo di cotone sotto la piattaforma nel barattolo della campana.
      5. Fissare il coperchio al barattolo a campana per evitare la fuoriuscita del vapore anestetico.
   3. Induzione
      1. Metti l'animale nel barattolo della campana facendo scorrere il coperchio da un lato.
      2. Una volta che l'animale è nel barattolo, sarà necessario osservare la sua attività e la respirazione per determinare la profondità dell'anestesia.
      3. L'animale è esposto all'anestetico, per effetto.
      4. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, far scorrere il coperchio da un lato, lasciando uno spazio sufficiente per consentire l'introduzione di una mano. Afferra la coda, la collottola o il corpo dell'animale anestetizzato e rimuovilo delicatamente dal barattolo della campana.
2. Vaporizzatori di precisione
   I vaporizzatori di precisione possono essere utilizzati con una camera a induzione o una maschera facciale. La macchina anestetica deve essere ispezionata prima di ogni procedura. L'anestetico corretto dovrebbe essere aggiunto se i livelli sono bassi. Il sistema di scavenging dovrebbe essere controllato per garantire che i gas di scarico siano completamente rimossi. Per i sistemi passivi di anestesia con gas di scarico, il contenitore di scavenging deve essere pesato per determinare se è ancora efficace. Generalmente, un aumento di peso di 50 grammi sopra il peso iniziale è il punto in cui viene speso il contenitore.
   1. Attrezzatura
      1. Una camera di induzione, un vaporizzatore di precisione, un'unità di spurgo dei gas di scarico (passiva o attiva) e un anestetico liquido (isoflurano, sevoflurano o desflurano, come determinato dal tipo di vaporizzatore in uso).
   2. Preparazione
      1. Assemblare la camera di induzione in modo tale che l'ingresso provenga dal vaporizzatore e l'uscita sia dal sistema di scarico dei gas di scarico.
   3. Induzione
      1. Posizionare l'animale nella camera di induzione. Alcune camere hanno un coperchio scorrevole e altre hanno un coperchio incernierato che si blocca.
      2. Una volta che l'animale è nella camera, il flusso di ossigeno viene avviato e il vaporizzatore di precisione viene acceso a un livello di induzione di 3-4 per l'isoflurano. Livelli di consegna anestetici più bassi si tradurranno in un tempo di induzione più lungo.
      3. L'animale è esposto all'anestetico, per effetto.
      4. Una volta che l'animale è completamente anestetizzato, lavare la camera con ossigeno prima di rimuovere l'animale per prevenire l'esposizione del personale ai gas anestetici. Se la camera di induzione è collocata in una cappa aspirante, non è necessario il lavaggio con ossigeno per eliminare l'anestetico dalla camera prima dell'apertura.
      5. Afferrare la coda, la collottola o il corpo dell'animale anestetizzato e rimuoverlo delicatamente dalla camera.
3. Maschera per il viso
   1. L'attrezzatura comprende un cono o una maschera per il naso del roditore, un vaporizzatore di precisione, un'unità di scavenging dei gas di scarico (passiva o attiva) e un anestetico liquido (isoflurano, sevoflurano o desflurano, come determinato dal tipo di vaporizzatore in uso).
   2. Preparazione
      1. Assemblare il cono nasale o la maschera in modo tale che l'ingresso provenga dal vaporizzatore e l'uscita sia dal sistema di spurgo dei gas di scarico.
      2. Le macchine per anestesia dei roditori hanno spesso un interruttore per commutare l'erogazione del vapore anestetico dalla camera di induzione al cono o alla maschera del naso del roditore. Assicurarsi che questo sia impostato correttamente per la consegna anestetica del cono del naso.
   3. Induzione
      1. Poiché i gas anestetici hanno un odore sgradevole, molti animali si opporranno all'essere mascherati per induzione. Il metodo preferito è quello di utilizzare la scatola di induzione seguita dalla manutenzione con il cono del naso. Una volta che il naso o il viso dell'animale è saldamente nella maschera, il flusso di ossigeno viene avviato e il vaporizzatore di precisione viene acceso a un livello di induzione di 5 per l'isoflurano. Livelli di consegna anestetici più bassi si tradurranno in un tempo di induzione più lungo e un aumento della lotta da parte dell'animale.
      2. È imperativo che l'animale sia monitorato per la respirazione, poiché una presa troppo ferma durante l'induzione può causare asfissia.
      3. Non appena l'animale inizia a rilassarsi, il naso o il viso possono essere regolati nel cono del naso o nella maschera e la consegna dell'anestetico viene ridotta a un livello di mantenimento di 1,5-0,5 per l'isoflurano una volta raggiunto il completo rilassamento.

2. Induzione dell'anestesia con anestetici iniettabili

Gli anestetici iniettabili sono principalmente una miscela di ketamina e sedativi o rilassanti muscolari.

Le combinazioni comuni sono: 1) Rodent Cocktail, che consiste di ketamina (100 mg / ml), xilazina (20 mg / ml), acepromazina (10 mg / ml) e soluzione salina sterile (0,9% NaCl); 2) ketamina / xilazina 2: 1, che consiste di ketamina (100 mg / ml), xilazina (20 mg / ml) e soluzione salina sterile (0,9% NaCl); e 3) ketamina / xilazina Mouse Mix, che consiste di ketamina (100 mg / ml), xilazina (20 mg / ml) e soluzione salina sterile (0,9% NaCl). Quando si utilizza la combinazione di ketamina / xilazina, il potenziamento deve essere fatto solo con ketamina, non con xilazina, a causa dell'emivita di questi farmaci.

La combinazione di ketamina con sedativi e/o miorilassanti deve essere preparata come soluzione stock da cui possono essere prelevate dosi individuali. Gli agenti devono essere misurati con precisione e diluiti con soluzione salina sterile per garantire che agli animali vengano somministrate dosi adeguate. Poiché la ketamina è una sostanza controllata, la quantità utilizzata dalle bottiglie deve essere annotata su un "Registro dei farmaci controllati" e le miscele devono avere singoli "Registri delle sostanze controllate". Quando si preparano le miscele, aggiungere lentamente la ketamina alla bottiglia, poiché tende a schiumare se iniettata con forza. Per la miscela viene utilizzato un flacone sterile da 20 ml con tappo. Le bottiglie devono essere adeguatamente etichettate con il nome dei composti, la data miscelata, la data di scadenza, il numero di lotto di ketamina (in quanto si tratta di una sostanza controllata) e il dosaggio suggerito. La data di scadenza può essere determinata dalla data di scadenza dell'ingrediente (dipende dalle regole / linee guida della struttura / stato). Per una registrazione accurata della ketamina, sia la bottiglia vuota che la bottiglia piena devono essere pesate. Quindi, i pesi devono essere registrati sull'etichetta della miscela e sul singolo foglio di registro della sostanza controllata che viene preparato per ogni bottiglia. Conservare le miscele di ketamina in un'area buia e a temperatura controllata per mantenere la potenza.

1. Preparazione del cocktail di roditori
   1. L'attrezzatura per la preparazione della soluzione anestetica comprende siringhe da 3 cc, una siringa da 12 cc, aghi da 22 g x 1", 1,8 cc di ketamina iniettabile 100 mg/ml, 1,8 cc di xilazina iniettabile 20 mg/ml, 0,6 cc di acepromazina iniettabile 10 mg/ml, 15,8 cc di soluzione salina sterile per iniezione e un'etichetta anestetica.
   2. Prelevare 15,8 cc di soluzione salina sterile e iniettarla nel flacone. Utilizzare la siringa da 12 cc e una siringa da 3 cc ed eliminare le bolle d'aria per misurazioni accurate.
   3. Aggiungere la ketamina, la xilazina e l'acepromazina alla bottiglia.
2. Induzione del cocktail di roditori
   1. In generale, Rodent Cocktail viene utilizzato per l'anestesia del topo. A causa della variazione in risposta al cocktail di roditori nei ratti adulti, è meglio usato nei ratti sotto le 5 settimane di età. Rodent Cocktail può essere usato in combinazione con l'anestesia per inalazione, specialmente nei ratti.
   2. Il cocktail di roditori viene generalmente somministrato ai topi in base al peso, utilizzando il seguente calcolo: (BW x 10) - 50 = microlitri Cocktail di roditori da pazienti da pazienti. Questo varierà in base allo sforzo, all'età e allo stato di salute.
   3. Questa soluzione viene somministrata solo per via intraperitoneale. Se iniettato per via intramuscolare, ci può essere una grave reazione nel tessuto.
3. Preparazione di ketamina/xilazina 2:1
   1. L'attrezzatura per la preparazione della soluzione anestetica comprende siringhe da 3 cc, aghi da 22 g x 1", 10 cc di ketamina iniettabile 100 mg/ml, 5 cc di xilazina iniettabile 20 mg/ml, un flacone sterile da 20 ml con tappo e un'etichetta anestetica.
   2. Aggiungere la ketamina e la xilazina alla bottiglia.
4. Induzione
   1. Ketamina / xilazina 2: 1 è usato per l'anestesia per i ratti e può essere usato in combinazione con l'anestesia per inalazione.
   2. Ketamina/xilazina 2:1 viene generalmente somministrata a partire da una dose di 0,3 cc e aumentata di 0,02 cc con successivi eventi anestetici. Questo varierà in base allo sforzo, all'età e allo stato di salute.
   3. Ketamina/xilazina 2:1 viene somministrata solo per via intramuscolare.
5. Preparazione di ketamina / xilazina Mouse Mix
   1. L'attrezzatura Ketamine/xylazine Mouse Mix necessaria per la preparazione della soluzione anestetica comprende siringhe da 3 cc, aghi da 22 g x 1", 3,6 cc di ketamina iniettabile da 100 mg/ml, 0,4 cc di xilazina iniettabile 20 mg/ml, soluzione salina sterile da 16 cc (0,9% NaCl), un flacone sterile da 20 ml con tappo e un'etichetta anestetica.
   2. Aggiungere la ketamina e la xilazina al flacone, facendo una soluzione 9:1 di ketamina a xilazina.
   3. Aggiungere la soluzione salina al flacone, ottenendo una miscela 1:4 di ketamina / xilazina 9: 1 a soluzione salina.
6. Induzione di ketamina/ xilazina Mouse Mix
   1. Ketamina / xilazina Mouse Mix può anche essere usato in combinazione con l'anestesia per inalazione.
   2. Ketamina/xilazina Mouse Mix viene generalmente somministrato ai topi in base al peso, utilizzando il seguente calcolo: (BW x 10) - 50 = microlitri ketamina/xilazina Mouse Mix da venire somministrato. Questo varierà in base allo sforzo, all'età e allo stato di salute.
   3. Ketamina/ xilazina Mouse Mix può essere somministrato per via intraperitoneale.

3. Valutazione dell'anestesia

La profondità anestetica può essere valutata testando la risposta a vari stimoli. Il movimento volontario deriverà da stimoli fisici del corpo. Vedere la Tabella 1 per un elenco dei metodi fisici utilizzati per la valutazione della profondità anestetica.

Tabella 1. Metodi di stimoli fisici per la valutazione della profondità anestetica. ²

Dovrebbero essere utilizzati anche indicatori fisiologici come frequenza cardiaca, frequenza respiratoria, pressione sanguigna, colore delle mucose e tempo di ricarica capillare. Mentre le osservazioni generali possono essere utili per rilevare i cambiamenti nella frequenza respiratoria degli animali, per utilizzare la frequenza cardiaca o la pressione sanguigna per la valutazione della profondità, sono necessarie attrezzature specializzate. Se è disponibile un elettrocardiografo, è possibile misurare la velocità e la forza dei battiti cardiaci. Per misurare la pressione sanguigna, ci sono una varietà di dispositivi che sono montati sopra la coda o anche su tutto il corpo. Gli stimoli fisici descritti nella Tabella 1 causeranno un aumento di tutti e tre questi parametri.

Il colore delle mucose, degli occhi, delle orecchie, della bocca, del naso, dell'ano e, in misura minore, delle zampe e della coda sono osservati per i cambiamenti. Le aree dovrebbero essere rosa, indicando un'adeguata respirazione e funzione cardiaca. Quando l'animale passa all'anestesia allo stadio IV, le respirazioni cessano, con conseguente cianosi - indicata da un colore blu o grigio - alle mucose e alla pelle circostante.

Il tempo di ricarica capillare è definito come la quantità di tempo impiegata affinché il colore ritorni a un letto capillare esterno dopo che è stato sbollentato dall'applicazione di pressione sull'area. Un bastoncino applicatore o un dito viene premuto sulle gengive, sulla pinna o sui letti ungueale degli animali anestetizzati. Il numero di secondi necessari affinché l'area sbollentata ritorni a un colore rosa non deve essere superiore a 1-2 secondi. Un tempo di ricarica prolungato suggerisce una riduzione della frequenza cardiaca o della forza delle contrazioni cardiache, indicando che l'animale potrebbe essere troppo profondamente anestetizzato e vicino alla morte.

È importante utilizzare diversi parametri per valutare la profondità anestetica. L'uso dello stesso dito o orecchio per pizzichi ripetuti desensibilizzerà l'area e la risposta sarà repressa e non fornirà una valutazione accurata della profondità dell'anestetico. Utilizzare siti alternativi per le valutazioni del pizzico delle dita dei dita e dell'orecchio. La profondità dell'anestetico deve essere rivalutata ogni 10-30 minuti durante l'intervento chirurgico. ²

Gli studi hanno dimostrato che ci sono cambiamenti cardiorespiratori in un animale anestetizzato. Mentre anestetizzati con farmaci iniettabili, gli animali sperimentano una frequenza respiratoria stabile; tuttavia, dimostrano variabilità nella gittata cardiaca. La risposta agli anestetici iniettabili è stata segnalata per variare notevolmente tra i diversi ceppi, quindi è difficile standardizzare il dosaggio. ⁷ Gli agenti inalanti tendono a diminuire la frequenza respiratoria ma hanno un impatto minore sul sistema cardiovascolare. Poiché il dosaggio dell'anestesia inalante è facilmente regolabile per tutta la durata della procedura, è spesso il metodo preferito.

L'uso corretto degli anestetici per la chirurgia, o altre procedure potenzialmente dolorose, è fondamentale non solo per il benessere dell'animale, ma anche per l'integrità dei dati scientifici raccolti durante la procedura. Ci sono molte variabili che influiscono sulla scelta del reggimento anestetico appropriato. La profondità dell'anestesia deve essere attentamente monitorata, poiché ogni singolo animale può rispondere in modo diverso al farmaco. Con l'uso dell'anestetico adeguato e un attento monitoraggio, è possibile eseguire procedure dolorose senza dolore e cambiamenti fisiologici minimi nell'animale.

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3. Kent Scientific Corporation. Retrieved from https://www.kentscientific.com/products/productView.asp?productID=6468&Mouse_Rat=CODA+High+Throughput&products=MouseSTAT%AE+Pulse+Oximeter+%26+Heart+Rate+Monitor+Module (accessed 10/15/15)
4. Szczepan B et al. Intraoperative Physiological Monitoring in Rodent Surgical Research. Retrievd from https://www.alnmag.com/article/2012/10/intraoperative-physiological-monitoring-rodent-surgical-research  (accessed 10/15/15)
5. Preanesthesia, Anesthesia, Analgesia, and Euthanasia. Laboratory Animal Medicine, 2^nd ed. Ed Fox, J. G., Anderson, L. C., Loew, F. M., and Quimby, F. W. 2002. Academic Press. San Diego, CA.
6. Ho, David et al. 2011. Heart Rate and Electrocardiography Monitoring in Mice. Current protocols in mouse biology. 1: 123-139. PMC. Web. 15 Sept. 2016.
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