Raccolta di tessuti sterili

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN

Nel 1959 le 3 R furono introdotte da W.M.S. Russell e R.L. Burch nel loro libro The Principles of Humane Experimental Technique. Le 3 R sono la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dell'uso degli animali nella ricerca. ¹ L'uso di linee cellulari e colture tissutali originate da animali da ricerca è una tecnica sostitutiva, in quanto consente di condurre molti esperimenti in vitro. Il prelievo di tessuti e organi per l'uso in colture cellulari e tissutali richiede una tecnica asettica per evitare la contaminazione dei tessuti. La raccolta sterile è necessaria anche per l'analisi di proteine e RNA e la profilazione metabolica dei tessuti. Questo manoscritto discuterà il processo di prelievo di organi sterili in ratti e topi.

La tecnica asettica deve essere seguita per garantire la sterilità dei tessuti. La raccolta viene eseguita in una cappa a flusso laminare che è stata disinfettata con alcool. Tutti i materiali utilizzati devono essere sterilizzati. Il tecnico che esegue la raccolta deve indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui maschera, bouffant, camice chirurgico sterile e guanti chirurgici sterili. L'abito deve coprire i polsi per prevenire lo spargimento di cellule della pelle nella cavità del corpo aperta, nelle piastre di Petri o nel mezzo sterile. Per mantenere la sterilità del tecnico, questa procedura richiede che un secondo tecnico non sterile assista il tecnico sterile con l'eutanasia degli animali.

Negli esperimenti che richiedono i profili metabolici dei tessuti, il metodo di raccolta dei tessuti ha un grande impatto sulla qualità dei dati raccolti. ² Sia la procedura di eutanasia che la durata del raccolto possono influire sull'integrità dei tessuti. L'ipossia, una conseguenza dell'eutanasia con anidride carbonica, ha dimostrato di avere un profondo effetto sui metaboliti nei tessuti. L'emorragia dei vasi nel tessuto polmonare è anche causata dall'uso di anidride carbonica per l'eutanasia. L'ordine di rimozione dei tessuti quando viene eseguita la dissezione sequenziale dei tessuti mirati può causare cambiamenti metabolici, poiché i tessuti iniziano a invecchiare o decadere durante il raccolto.

Mentre la maggior parte dei prelievi sterili mira a un singolo organo, ci possono essere momenti in cui è necessario più di un organo. Durante la dissezione sequenziale, i tessuti richiesti determineranno l'ordine in cui devono essere rimossi. ² I tessuti che si degradano rapidamente devono essere raccolti il più rapidamente possibile dopo l'eutanasia. Per mantenere la sterilità degli strumenti, gli organi prelevati dalla cavità addominale vengono rimossi nel seguente ordine: milza, fegato, rene, ghiandole surrenali, ovaie o testicoli, organi sessuali accessori (prostata, vescicole seminali, utero, tube di Falloppio), tessuto pancreatico, linfonodi, vescica urinaria e tratto intestinale (stomaco, intestino tenue e crasso). L'ordine del prelievo di organi dalla cavità toracica è quello di rimuovere prima il cuore e i polmoni seguiti dalla raccolta di timo, linfonodi ed esofago. ³ Per ogni mouse sono necessari nuovi guanti.

Alcuni degli organi prelevati sterili potrebbero dover essere conservati. La conservazione dei tessuti avviene mediante congelamento flash con azoto liquido (LN₂) o con una combinazione di LN₂ e 2-metilbutano. Per la sola LN_2, i tessuti vengono risciacquati in soluzione salina sterile, asciugati su un panno assorbente sterile per esaurire l'umidità in eccesso, posti in quadrati di foglio di alluminio sterile e immediatamente immersi nella LN₂. ² Per i campioni immunologici, viene aggiunto 2-metilbutano. Il tessuto è in realtà immerso nel 2-metilbutano che è stato raffreddato dal LN₂. Quando i tessuti sono diventati bianchi, vengono rimossi dal 2-metilbutano, posti in confezioni sterili e quindi collocati direttamente nel LN₂.

1. Preparazione

1. I materiali comunemente usati includono alcol al 70% in una bottiglia di schizzo, aghi sterili da 20-25 gauge, due confezioni di strumenti sterili di forbici per l'iride e pinza per il pollice (una per la pelle e una per i tessuti interni), asciugamani di carta, guanti da chirurgo sterili, una capsula di Petri sterile, un mezzo sterile e una soluzione salina sterile.
2. La ventola del cappuccio deve essere in funzione per almeno 15 minuti prima della procedura e deve essere disinfettata con alcol al 70%.
3. Se la cappa è dotata di una lampada di sterilizzazione UV, può essere utilizzata per disinfettare ulteriormente la superficie di lavoro.
4. I guanti puliti sono indossati per la configurazione del cappuccio. L'attrezzatura viene caricata nel cofano nell'ordine in cui verranno utilizzati, di solito da sinistra a destra. Ciò consente di condurre il lavoro in un flusso di lavoro unidirezionale, evitando che gli oggetti sporchi contaminino gli articoli puliti. Ciò proteggerà i tessuti o gli organi prelevati dalla contaminazione accidentale delle carcasse animali.
5. Le confezioni sterili degli strumenti vengono aperte, rispettando l'interno sterile delle confezioni. Per mantenere la sterilità, la confezione viene posizionata al centro del tavolo e ogni lembo viene aperto senza attraversare il campo sterile o l'interno della confezione. La persona non sterilista apre il primo lembo superiore riflettendolo per lui / lei. I lembi laterali vengono quindi aperti utilizzando entrambe le mani , una su ciascun lembo - e allontanandoli dalla confezione. Il lembo finale viene quindi tirato verso la persona che apre la confezione, avendo cura di evitare di toccare una qualsiasi delle superfici interne della confezione.
6. Metti gli asciugamani di carta nel cappuccio e bagnali con alcool.
7. La persona non sterilizza gli animali.
8. La persona sterile indossa due serie di guanti chirurgici sterili.
9. La persona non sterilista posiziona la carcassa sugli asciugamani di carta e immerge completamente la carcassa con il 70% di alcol.
10. Usando un set di forbici sterili e pinza, fai un taglio orizzontale nella pelle appena anteriore al prepuzio (nei maschi) o all'osso pelvico (nelle femmine). Evitare di tagliare la muscolatura addominale.
11. Mettere da parte gli strumenti.

2. Raccolta dei tessuti

1. Fai un piccolo taglio appena anteriore al bacino nelle femmine e sopra il prepuzio nei maschi.
2. Posizionare il pollice sotto il taglio e afferrare il bordo cranico del taglio. Usando l'altra mano, tenere saldamente gli arti posteriori e la coda mentre si tira la pelle verso la testa.
3. La pelle si strappa via dal corpo appena sopra gli arti posteriori e può essere girata dentro e fuori sopra la testa e le zampe anteriori. Questo rimuove efficacemente i contaminanti dei capelli durante il prelievo di organi.
4. Immergere nuovamente il corpo con alcol al 70% e rimuovere il paio di guanti superficiali che non sono più sterili.
5. Aprire la cavità addominale utilizzando strumenti sterili.
   1. Milza
      1. Per raccogliere la milza, il corpo è posizionato nella posizione laterale destra.
      2. La milza può essere visualizzata attraverso il muscolo addominale.
      3. Un taglio a forbice viene effettuato direttamente sopra la milza.
      4. La milza viene delicatamente ritratta dalla cavità corporea.
      5. Quando si tagliano tutti gli attacchi tra la milza, lo stomaco e il tessuto pancreatico, evitare di perforare o strappare l'organo.
   2. Fegato
      1. Per raccogliere qualsiasi altro organo addominale, il corpo viene posto in reclinenza dorsale.
      2. Il muscolo addominale viene sollevato e tagliato via, lasciando un'apertura ovale direttamente sopra la cavità addominale.
      3. Dopo aver esposto la cavità addominale, riflettere il fegato caudale lontano dal diaframma.
      4. Tagliare con cura eventuali membrane che attaccano il fegato al diaframma.
      5. Fare un taglio perpendicolare alla colonna vertebrale attraverso i vasi sanguigni visibili tra il fegato e il diaframma.
      6. Sollevare il fegato e rifletterlo verso il diaframma per visualizzare gli attacchi sottostanti.
      7. Ci saranno membrane sottili che attaccano i lobi epatici più piccoli allo stomaco e all'intestino tenue, che dovranno essere interrotti.
      8. Afferrare il nodo fibroso al centro del fegato sul lato inferiore e sollevare l'organo per trovare tutti gli allegati. Separare il fegato dagli organi e dai tessuti sottostanti.
      9. Si noti che il fegato è fragile e può essere facilmente perforato, con conseguente rilascio di sangue; pertanto, deve essere maneggiato con attenzione.
   3. Reni
      1. Dopo aver esposto la cavità addominale, spingere l'intestino a sinistra per visualizzare il rene destro o a destra per visualizzare il rene sinistro.
      2. Per rimuovere il rene, utilizzare le lame della pinza per afferrare sotto il rene per isolare l'organo dal corpo. Usando le forbici o una lama di bisturi, tagliare il rene lontano dal corpo. Fai il taglio sotto la pinca per evitare di danneggiare il rene.
      3. Una volta rimosso il rene, qualsiasi grasso può essere tagliato dall'organo.
   4. Ovario
      1. Dopo aver esposto la cavità addominale, spostare l'intestino cranicamente per visualizzare l'utero.
      2. Seguire le corna a sinistra, e poi a destra, dell'utero alle ovaie.
      3. Le ovaie sono piccole. Negli animali più anziani, possono essere immersi nel grasso.
      4. Far scorrere la pinca sotto l'ovaio per isolarla dal corpo e tagliarla libera dal grasso e dalla tuba di Falloppio.
   5. Testicoli
      1. Dopo aver aperto la cavità addominale, afferrare delicatamente il cuscinetto di grasso inguinale e tirarlo anteriormente.
      2. Questo tirerà il testicolo dallo scroto.
      3. Una volta che il testicolo è esposto, tagliare gli attacchi allo scroto e al dotto deferente per liberarlo dal corpo.
      4. Questo viene fatto per ogni testicolo.
6. La cavità toracica viene aperta per rimuovere gli organi toracici
   1. Il corpo è posto in reclinenza dorsale. È imperativo che la pelle si rifletta ben sopra la testa se gli organi della cavità toracica devono essere prelevati.
   2. Afferrare il processo xifoide e sollevare per consentire un taglio attraverso il muscolo addominale appena caudale alle costole. Estendere il taglio lungo la curva inferiore della gabbia toracica su entrambi i lati. Ciò consentirà la visualizzazione del diaframma.
   3. Forare il diaframma facendo un piccolo taglio nella gabbia toracica nel punto più laterale possibile su ciascun lato. Tagliare il diaframma lontano dalle costole.
   4. Sollevare le costole allo xifoide per visualizzare gli organi toracici.
   5. Estendere il taglio laterale fino alla parte superiore dello sterno su entrambi i lati e aprire il torace.
   6. Il cuore e i polmoni sono più facilmente rimossi insieme.
      1. Posizionare la pinna perpendicolare alla trachea e afferrare saldamente la trachea.
      2. Usando le forbici, fare un taglio perpendicolare alla trachea appena anteriore alla pinza. Questo taglio dovrebbe tagliare la trachea e l'esofago.
      3. Senza allentare la presa sulla trachea, sollevare la trachea e caudally. Snip qualsiasi attacco dei polmoni alla superficie spinale nella gabbia toracica.
      4. L'esofago potrebbe aver bisogno di essere tagliato per essere in grado di sollevare il cuore e i polmoni liberi dalla cavità toracica.
   7. Solo cuore
      1. Sollevare il cuore e tagliare con cura il sacco pericardico.
      2. L'aorta si trova all'aspetto cranico del cuore alla sinistra dell'animale.
      3. Tenendo l'aorta con la pinica, fare un taglio distale alla pinica, mantenendo una presa sull'aorta e sul cuore.
      4. Afferrare l'aorta mentre si recide la vena cava anteriore e le arterie e le vene polmonari.
      5. Sollevare il cuore libero dalla cavità toracica dall'arteria aortica.
   8. Altri organi toracici
      1. Gli organi vengono prelevati nel seguente ordine per mantenere la sterilità degli strumenti: timo, linfonodi ed esofago.
7. Cervello
   1. In circostanze speciali, il cervello dovrà essere raccolto per una coltura sterile.
   2. Il cervello viene prelevato per ultimo dopo qualsiasi altro prelievo di organi.
   3. Nei casi in cui il cervello è l'unico organo da raccogliere, la pelle non viene strappata dal corpo, ma invece viene effettuato un taglio alla nuca e si estende lungo la linea mediana dalla zona cervicale dorsale alla punta del naso.
   4. Dopo aver allontanato la pelle dal cranio lateralmente, l'osso esposto viene imbevuto di alcol al 70% e i guanti superiori sporchi vengono rimossi.
   5. Usando un paio dedicato di forbici sterili per la raccolta del cervello, fai un taglio attraverso la colonna vertebrale alla base del cranio.
   6. Apri il cranio posizionando la punta delle forbici nel forame magnum e tagliando lungo la linea mediana.
   7. Utilizzare l'estremità piatta della lama a forbice per allontanare le ossa parietali dal cervello.
   8. Interrompere attentamente gli attaccamenti nervosi al tronco cerebrale e il chiasma ottico sotto il cervello, usando il punto chiuso della pinna del pollice.
   9. In modo simile, far scorrere la pinca chiusa anteriormente sotto il cervello e rompere gli attacchi ai bulbi olfattivi.
   10. Il cervello può quindi essere lasciato cadere dal cranio in mezzo sterile.
   11. Quando si raccoglie il cervello, una mano sarà considerata non sterilizzante in quanto afferra la pelle dal cranio riflessa sotto il mento per stabilizzare la testa, mentre il cranio viene tagliato e il cervello rimosso.
8. Pelle
   1. Tessuto mammario
      1. Il tessuto mammario si trova dalla parte superiore dello sterno al manubrio all'apertura genitale sulla superficie ventrale e si estende lateralmente su entrambi i lati, quasi toccando la superficie dorsale ai fianchi e alle spalle.
      2. Esaminare il tessuto mammario per cercare masse, scolorimento o anomalie. Le femmine in allattamento o in gravidanza avranno un aumento del volume del tessuto mammario e il latte potrebbe essere presente.
      3. L'escissione delle ghiandole mammarie richiede di afferrare il bordo della ghiandola con una pinna per il pollice e l'uso di una dissezione smussata per allentare gli attaccamenti alla pelle. Una volta che la ghiandola è stata separata dalla pelle, le forbici dell'iride possono essere utilizzate per tagliare eventuali attacchi rimanenti.
      4. Immergere le superfici esposte con il 70% di alcol e iniziare la raccolta dei tessuti utilizzando una nuova serie di strumenti sterili.
      5. Il tessuto raccolto viene risciacquato con soluzione salina sterile prima di metterlo in terreno di coltura.
   2. Tumori sottocutanei
      1. Spesso, le cellule tumorali vengono ripetutamente impiantate negli animali e quindi il tumore risultante viene raccolto per mantenere la linea cellulare del tumore.
      2. È imperativo che la raccolta di tessuti sterili di tumori sottocutanei venga eseguita prima della violazione dell'integrità della pelle.
      3. Se la massa è abrasa o è necrotica, il tessuto raccolto non sarà di buona qualità e potrebbe non essere sterile.
      4. Il corpo è posizionato per esporre l'area di interesse. La pelle viene tagliata lungo un lato del tumore.
      5. Riflettere attentamente la pelle per esporre il tumore. Posizionare gli strumenti della pelle di lato e immergere i tessuti esposti con il 70% di alcol.
      6. Con nuovi strumenti sterili, seziona la massa dagli attacchi sottostanti e seziona tutti i vasi sanguigni che alimentano la massa.
      7. Il tumore viene quindi posto nel terreno di coltura.

Sebbene molte delle procedure per il prelievo di organi sterili siano simili a un'autopsia standard, l'uso della tecnica sterile è imperativo affinché i tessuti siano di valore per le procedure sperimentali, che includono il prelievo di cellule dai tessuti asportati. La profilazione o la raccolta di RNA dai tessuti può essere compromessa se la sterilità non viene mantenuta.