Method Article
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים במעי אפיקליים מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות משובצות מטריצה. הוא גם מתאר את השילוב הבא של EdU בתאים המתרבים באופן פעיל ואת הכימות האוטומטי למחצה של תאים חיוביים ל-EdU.
כאן, אנו מתארים את הדור של תרביות צפות של אורגנואידים במעי הקודקודים מתרביות אורגנואידים במעי משובצות הידרוג'ל. במקביל, תרביות אורגנואידים צפות בבסיס החוצה נקבעות להשוואה ישירה בין אורגנואידים קודקודיים ובזאליים החוצה. אורגנואידים אפיקליים ובסיסיים כפופים לאחר מכן לאנלוגי התימידין 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המשולב ב-DNA החדש שסונתז במהלך שלב ה-S של חלוקת התא. ניתן לדמיין שילוב זה ב-DNA באורגנואידים שלמים מבחינה מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר. תאים המסומנים ב-Hoechst33342 ו-EdU מכומתים לאחר מכן בצורה חצי אוטומטית באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. חישוב אחוז התאים החיוביים ל-EdU ממספר התאים הכולל מאפשר ניתוח של התפשטות תאים באורגנואידים תלת מימדיים (3D). למרות שהוא משמש כאן לניתוח התפשטות באורגנואידים במעי, הפרוטוקול ישים לניתוח של כתמים ספציפיים לגרעין מסוגים שונים גם באורגנואידים אחרים או בתרביות תאים דו-ממדיות.
אורגנואידים במעי הם מודלים תלת מימדיים במבחנה המסכמים את אפיתל המעי המורכב מסוגי תאים שונים. ניתן ליצור אורגנואידים אלה בקלות מתאי גזע בוגרים המבודדים מקריפטות מעיים1. מכיוון שאורגנואידים קרובים הרבה יותר לאפיתל in vivo, הם הופכים חשובים יותר ויותר במחקר ביו-רפואי. אורגנואידים של המעי משמשים לא רק לניתוח מנגנונים פיזיולוגיים (למשל, איתות נישת מעיים 2,3 והתמיינות תאים 4,5) אלא גם למחקר על מחלות זיהומיות 6,7. עם זאת, גידול תאים מקוטבים בתלת מימד הסוגר לומן מרכזי הוא מאתגר, מכיוון שמשטח התא האפיקלי בסופו של דבר אינו נגיש בתוך לומן האורגנואיד. בחינת ההבדלים בין משטחי תאים אפיקליים ובסיסיים יכולה להיות חשובה במחקרים מטבוליים, כפי שמודגם על ידי הבדלים בספיגת חומצות שומן8 ומחקר מחלות זיהומיות 9,10,11,12.
יצירת מה שנקרא אורגנואידים אפיקליים היא אפשרות קלה להתגבר על בעיה זו. על ידי הסרת המטריצה החוץ-תאית מתרביות אורגנואידים סטנדרטיות (כלומר, אורגנואידים בסיסיים, משובצים במטריצה) וזריעת אורגנואידים אלה בתווך נטול מטריצה, ניתן לגרום למתג קוטביות9.
כפי שפרסמנו בעבר, רוב האורגנואידים הופכים את הקוטביות שלהם תוך 12 שעות. עם זאת, לוקח 48-72 שעות להשיג תרבית עם יותר מ-90% אורגנואידים אפיקליים. למרות יתרונם בכך שהם מאפשרים גישה למשטח התא האפיקלי, אורגנואידים אפיקליים מראים ירידה משמעותית בהתפשטות לאחר היפוך הקוטביות בעוד ששיעורי מוות התאים עולים13. גורם הפעילות הפרוליפרטיבית יכול לייצג משתנה מבלבל בניתוחים שונים ויש לזכור אותו בעת תכנון ניסוי.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להקמת תרביות אורגנואידים אפיקליים במעי ואורגנואידים בקרה בזאליים צפים לניתוחים במורד הזרם. יתר על כן, אנו מתארים תיוג עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המשולב ב-DNA שסונתז לאחרונה ובכך מסמן תאים מתרבים באופן פעיל. אנו מתארים עוד את ניתוח התמונה החצי אוטומטי של קצב התפשטות האורגנואידים באמצעות התוכנה arivis Pro (Zeiss) על ידי כימות של תאי EdU+ . סכימה של התהליך מתוארת באיור 1.
נעשה שימוש באורגנואידים במעי שמקורם בתאי גזע בוגרים מכלבים, שהוקמו על פי Kramer et al., 202014 . בהתבסס על הנחיות ועדת האתיקה המוסדית, השימוש בחומר רקמה שנאסף במהלך כריתה טיפולית או לאחר המוות נכלל ב"הסכמת הבעלים לטיפול" של האוניברסיטה, שנחתמה על ידי כל בעלי המטופלים.
1. תרבות אורגנואידים
2. אינדוקציה של היפוך קוטביות ותיוג EdU
3. תגובת צביעה של Click-it EdU וצביעה של Hoechst 33342
4. ניתוח תמונה חצי אוטומטי
הערה: לצורך ניתוח זה, נעשה שימוש ב-arivis Pro גרסה 4.2.2 (תוכנת ניתוח תמונות).
5. קביעת שיעורי התפשטות אורגנואידים
אורגנואידים שגדלו במשך 3 ימים לאחר טריפסיניזציה צריכים להיות באופן אידיאלי בין 50-250 מיקרומטר, כפי שמתואר באיור 2A. אורגנואידים גדולים בהרבה מזה עשויים שלא להפוך את הקוטביות שלהם ביעילות. אורגנואידים גדולים יותר עשויים גם להתחיל לנבוט, ושמנו לב שלאורגנואידים אלה יכולות להיות בעיות גם בהיפוך קוטביות יעיל. אורגנואידים בסיסיים וקודקודיים מציגים הבדלים מורפולוגיים ברורים כבר בהדמיית שדה בהיר. בעוד שאורגנואידים בסיסיים שומרים על לומן גדול (איור 2B) לאחר 3 ימים של תרבית תרחיף, אורגנואידים קודקודיים (איור 2C) נראים קומפקטיים יותר. מאפיין ספציפי מאוד של תרביות תרחיף אפיקליות הוא מספר התאים המתים הצפים סביב האורגנואידים. הסיבה לכך היא אורגנואידים אפיקליים החוצה המוציאים תאים מובחנים ומתים סופניים לתווך שמסביב, בעוד שאורגנואידים בסיסיים צוברים תאים מתים בלומן האורגנואיד.
ניתן לדמות אורגנואידים במעי ששילבו EdU ב-DNA החדש שלהם לפני חלוקת התא באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אורגנואידים בזאליים מראים אותות EdU גבוהים בהרבה לאורך זמן מאשר עמיתיהם הקודקודיים (איור 3). חשוב לציין שלא כל האורגנואידים מראים תאי EdU+ למרות הגידול בגודלם. הסיבה לכך היא שאין תאי EdU+ בשכבת ההדמיה הספציפית.
ניתן לנתח את התמונות הקונפוקליות הללו באופן כמותי באמצעות תוכנת ניתוח תמונות וצינור הניתוח המסופק (קובץ משלים 1). בזמן ביצוע פרוטוקול הניתוח, תחילה יש להקיף אורגנואידים (איור 4A) לפני הוצאת אזורים מסוימים מהניתוח בפועל (איור 4B). אזורי אי הכללה אלה עשויים להתייחס לתאים מתים בתוך לומן האורגנואיד, שאינם מעניינים לכימות אותות EdU. ביצוע לאחר מכן של צינור הניתוח האוטומטי מוביל לפילוח של כל הגרעינים שזוהו, תוך הבחנה בין גרעיני Hoechst33342+ ו-EdU+ . בנוסף, כל הגרעינים מתחת לחתך של 15 מיקרומטר2 אינם נכללים מכיוון שסביר להניח שאלו תאים מתים או גרעינים שאינם מוצגים במלואם בשכבת תמונה זו (איור 4C).
לאחר ניתוח תמונה באמצעות התוכנה וייצוא מדידות הכמות, נתונים אלה מחושבים עוד יותר כדי לנתח את אחוז אות EdU+ מהמסה הכוללת של ה-DNA (איור 5). במקרה המוצג בכתב יד זה, אורגנואידים במעי הקודקודים מראים רמות מופחתות באופן דרסטי של התפשטות בהשוואה לאורגנואידים בסיסיים צפים.
איור 1: סקירה סכמטית של הפרוטוקול המתואר. הסכימה כוללת גידול אורגנואידים, אינדוקציה של היפוך קוטביות, תיוג EdU וניתוח תמונה חצי אוטומטי. דמות שנוצרה באמצעות Biorender.com. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אורגנואידים לפני ואחרי אינדוקציה של היפוך קוטביות. (A) אורגנואידים במעי משובצים במטריקס שלושה ימים אחרי שתאים טריפסינים נזרעו במצע גידול. (B) אורגנואידים בסיסיים צפים שלושה ימים לאחר הזריעה בתרבית תרחיף. (C) אורגנואידים אפיקליים 3 ימים לאחר הזריעה בתרבית תרחיף ללא BME לאינדוקציה של היפוך קוטביות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אורגנואידים במעי עם בסיס החוצה והחוצה האפיקלי מסומנים ב-EdU. הפאנל העליון המתאר תמונות קונפוקליות של אורגנואידים בזאליים לאורך זמן מציג הרבה יותר תאי EdU+ בהשוואה לאורגנואידים אפיקליים (פאנל תחתון) באותן נקודות זמן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח תמונה כמותי של אורגנואידים במעי מוכתמים ב-EdU. (A) אורגנואידים מוקפים באמצעות מצבי Sphere ו-Polygon . (B) האזור שלא ייכלל בניתוח מסומן בלבן (מסומן על ידי החץ). אזור זה מסמן את לומן האורגנואיד, המכיל מספר תאים מתים, אשר לא ייכללו בניתוח שלאחר מכן. (C) התמונה לאחר הניתוח מציגה את כל הגרעינים המפולחים. גרעיני Hoechst33342 + מסומנים בציאן, גרעיני EdU+ מסומנים בצהוב, וגרעינים שאינם מגיעים ל -15 מיקרומטר2 מסומנים בירוק (Hoechst33342) וכתום (EdU). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: קצב התפשטות האורגנואידים. אחוז ה-DNA של EdU+ מכלל ה-DNA המשמש כפרוקסי לקצב התפשטות האורגנואידים מראה התפשטות גבוהה יותר באורגנואידים בסיסיים בהשוואה לאורגנואידים אפיקליים. הנתונים מוצגים כ-SEM ממוצע. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
מדיום בזאלי | |
רכיבי מדיה | ריכוז סופי |
DMEM-F12 | |
תוסף פניצילין-סטרפטומיצין 100X למדיה | 1x |
תוסף GlutaMAX | 2 מ"מ |
תמיסת חיץ HEPES 1 מ', נוזל | 10 מ"מ |
מדיום מעודן | |
תוסף תזונה ללא סרום B27 (פי 50), נוזלי | 1x |
N-אצטיל-L-ציסטאין, נבדק בתרבית תאים | 1 מ"מ |
[Leu15]-גסטרין הראשון אנושי | 10 ננומטר |
א 83-01 | 500 ננומטר |
HGF אנושי | 50 ננוגרם/מ"ל |
נוגין אנושי (יונקים) | 100 ננוגרם/מ"ל |
IGF-I אנושי | 100 ננוגרם/מ"ל |
FGF אנושי בסיסי | 50 ננוגרם/מ"ל |
מדיום מותנה R-Spondin | 10% (אנכי/אנכי) |
מדיום מותנה Wnt-3a | 50% (אנכי/אנכי) |
מדיום בזאלי | נפח שנותר לדילול גורמי הגדילה שהוזכרו לעיל / מדיום מותנה |
טבלה 1: הרכב המדיה הבסיסית והמעודנת.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לגרום להיפוך קוטביות בתרביות אורגנואידים סטנדרטיות שמקורן בתאי גזע בוגרים. אורגנואידים אפיקליים משרתים את המטרה של קבלת גישה למשטח התא האפיקלי, המכוון בדרך כלל לכיוון לומן האורגנואיד. היכולת לחקור את המשטח האפיקלי יכולה להיות בעלת חשיבות גבוהה עבור יישומים מסוימים מכיוון שזהו החלק של קרום התא החשוף לכל תכולת מערכת העיכול בתנאים פיזיולוגיים in vivo. שיטות אחרות לאתגר את המשטח האפיקלי באופן ספציפי הן מיקרו-הזרקה16, שימוש בחד-שכבות שמקורן באורגנואיד17 ופיצול אורגנואיד18. עם זאת, לכל אחת מהשיטות הללו חסרונות וחסרונות ספציפיים, כפי שסקרנו ביתר פירוט בעבר 19,20.
לשיטה ליצירת אורגנואידים אפיקליים יש מספר יתרונות: 1) יצירת אורגנואידים אפיקליים היא קלה יחסית בהשוואה לשיטות אחרות ואינה דורשת מכשור או ציוד מיוחד. לכן, אורגנואידים אפיקליים הם דרך חסכונית לגשת למשטח התא האפיקלי; 2) ניתן לגדל אורגנואידים בזאליים צפים במקביל ולהשתמש בהם כאורגנואידים בקרה משמעותיים, במיוחד לניתוח השפעות ספציפיות לקוטביות; 3) אורגנואידים צפים של BO ו-AO יכולים להיות נתונים ליישומים סטנדרטיים במורד הזרם כפי שמודגם על ידי שילוב EdU בדוח זה, אך גם צביעה אימונולוגית (היסטו) כימית כמו גם בדיקות מבוססות זוהר ופלואורסצנטי כפי שדווח בעבר13 והדמיה ישירה של תאים חיים12. ניתוחים במורד הזרם, כגון ניתוח שילוב EdU או צביעה אימונולוגית (היסטו) כימית, מאפשרים גם גמישות מסוימת מבחינת זמן, שכן ניתן לאחסן אורגנואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
למרות הקלות של היפוך הקוטביות, קיימות כמה נקודות קריטיות בפרוטוקול שלנו שיש לקחת בחשבון בעת יישום שיטה זו. ראשית, אורגנואידים ששימשו בשלב 2.1. צריך להיות בגודל מסוים. מניסיוננו, שימוש באורגנואידים 3 ימים לאחר הטריפסיניזציה עובד היטב. עם זאת, זמן זה עשוי להשתנות עם אורגנואידים של בעלי חיים אחרים עקב הבדלים בריבוי התאים או בהתאם לצפיפות הזריעה של אשכולות תאים בודדים. יתר על כן, הדיסוציאציה של BME באמצעות תמיסת קצירת האורגנואידים היא הדרגתית. כפי שתואר על ידי Co et al., 20199, ריכוזי BME נמוכים עד 2.5% עשויים להספיק כדי לשמור על אורגנואידים במורפולוגיה בסיסית בתרבית תרחיף. לכן, יש להסיר כמה שיותר BME כדי להבטיח היפוך קוטביות יעיל. נקודה חשובה נוספת היא שימוש נכון בלוחות תרבית רקמה לא מטופלים כדי למזער את ההתקשרות האורגנואידית במהלך תרבית השעיה. מניסיוננו, ציפוי מראש של צלחות בתמיסה נגד היצמדות (שלב 2.4.) מאפשר שימוש כמעט בכל צלחת לתרבית של אורגנואידים אפיקליים. עם זאת, ניתן לבחון אפשרויות אחרות ההופכות את לוחות הציפוי מראש למיותרים.
החשיבות של הערכת ההשפעות על פני התא הבסיסי כמו גם על פני התא האפיקלי של תאי אפיתל מקוטבים מתבררת במקרים רבים. לדוגמה, ניתחנו בעבר את ההשפעות של רעלנים של החיידק האנאירובי Clostridioides difficile על אורגנואידים BO ו-AO. תוצאות מחקר זה מראות כי רעלן C. difficile B (TcdB) פוגע רק בשלמות מחסום האפיתל של המעי באורגנואידים BO של המעי הדק אך לא באורגנואידים של AO. מספר דיווחים אחרים המציגים תגובות ספציפיות לתחום של מיקרואורגניזמים פתוגניים שונים מדגישים את החשיבות של הערכת שני הצדדים של תאי אפיתל 9,16,21,22,23,24,25.
חיסרון מרכזי אחד של אורגנואידים אפיקליים הוא ההתנהגות המשתנה שלהם לגבי התפשטות התאים. כפי שתואר לעיל, אורגנואידים של AO מראים שיעורי התפשטות תאים מופחתים באופן דרסטי בהשוואה לעמיתיהם ב-BO. דיווחנו בעבר כי חוסר התפשטות זה הולך יד ביד עם רמות מוגברות מעט של מוות תאי13. בסופו של דבר, זה לא מאפשר תרבית ארוכת טווח של אורגנואידים AO אלא אם כן נמצאה דרך להאריך את חיי האורגנואידים של AO עם זאת, אנו רואים באורגנואידים של AO כלי שימושי ביותר לגישה קלה למשטח התא האפיקלי כל עוד החוקרים נזהרים עם מסקנות שעלולות להיות מושפעות מירידה בהתפשטות התאים.
המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.
מחקר זה נתמך באמצעות משאבים של מתקן הליבה של VetImaging (VetCore, Vetmeduni, אוסטריה). אנו רוצים להודות לאורסולה רייכרט על תמיכתה בניתוח תמונה כמותי למחצה. GC הוא זוכה מלגת DOC (מענק מספר 26349) של האקדמיה האוסטרית למדעים (ÖAW) במחלקה לרפואה פנימית של בעלי חיים קטנים ב-Vetmeduni.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24 well plates | Biologix | 07-6024 | |
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC) | Sigma-Aldrich | G-9145 | |
µ-Slide 18 Well Glass Bottom | ibidi | 81817 | |
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media | Gibco/Thermo | 15140122 | |
A 83-01 | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
arivis Pro | Zeiss | Version 4.2.2 | |
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid | Gibco/Thermo | 17504044 | |
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | Abcam | ab145597 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Scientific | C10340 | |
DMEM-F12 | Gibco/Thermo | 11320033 | |
Geltrex | Gibco/Thermo | A1413202 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco/Thermo | 35050061 | |
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid | Gibco/Thermo | 15630056 | |
Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B-100µG | |
Human HGF | PeproTech | 100-39-100µG | |
Human IGF-I | PeproTech | 100-11-100µG | |
Human NOGGIN (Mammalian) | PeproTech | 120-10C-200µG | |
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Organoid Harvesting Solution | Thermo | C10340 | |
Triton(TM) X-100,for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco/Thermo | 25300054 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved