Method Article
هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد عضيات معوية قمية من الثقافات العضوية القياسية المضمنة في المصفوفة. كما يحدد الدمج اللاحق ل EdU في الخلايا التي تتكاثر بنشاط والقياس الكمي شبه التلقائي للخلايا الإيجابية ل EdU.
هنا ، نصف توليد الثقافات العائمة للعضيات المعوية القمية من الثقافات العضوية المعوية المضمنة في الهيدروجيل. في الوقت نفسه ، يتم إنشاء الثقافات العضوية القاعدية العائمة للمقارنة المباشرة بين العضيات القمية للخارج والقاعدية. تخضع العضيات القمية والقاعدية لاحقا لنظير الثايميدين 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، والذي يتم دمجه في الحمض النووي المركب حديثا خلال المرحلة S من انقسام الخلية. يمكن تصور هذا الدمج في الحمض النووي في العضيات السليمة شكليا باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر. ثم يتم قياس الخلايا المسماة ب Hoechst33342 و EdU بطريقة شبه تلقائية باستخدام برنامج تحليل الصور. يسمح حساب النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل EdU من إجمالي عدد الخلايا بتحليل تكاثر الخلايا في العضيات ثلاثية الأبعاد (3D). على الرغم من استخدامه هنا لتحليل التكاثر في العضيات المعوية ، إلا أن البروتوكول قابل للتطبيق على تحليل البقع الخاصة بالنواة من أنواع مختلفة في العضيات الأخرى أو مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد أيضا.
العضيات المعوية هي نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر تلخص ظهارة الأمعاء التي تشتمل على أنواع مختلفة من الخلايا. يمكن إنشاء هذه العضيات بسهولة من الخلايا الجذعية البالغة المعزولة من الخبايا المعوية1. نظرا لأن العضيات أقرب بكثير إلى ظهارة الجسم الحي ، فقد أصبحت ذات أهمية متزايدة في البحوث الطبية الحيوية. لا تستخدم عضيات الأمعاء فقط لتحليل الآليات الفسيولوجية (على سبيل المثال ، إشارات المعويةالمتخصصة 2،3 وتمايز الخلايا4،5) ولكن أيضا للبحث عن الأمراض المعدية6،7. ومع ذلك ، فإن زراعة الخلايا المستقطبة في 3D التي تحيط بالتجويف المركزي يمثل تحديا ، حيث ينتهي الأمر بسطح الخلية القمية بحيث لا يمكن الوصول إليه داخل التجويف العضوي. يمكن أن يكون فحص الاختلافات بين أسطح الخلايا القمية والقاعدية الجانبية مهما في دراسات التمثيل الغذائي ، كما يتضح من الاختلافات في امتصاص الأحماضالدهنية 8 وأبحاث الأمراض المعدية9،10،11،12.
يعد توليد ما يسمى بالعضيات القمية خيارا سهلا للتغلب على هذه المشكلة. عن طريق إزالة المصفوفة خارج الخلية من الثقافات العضوية القياسية (أي العضيات القاعدية المضمنة في المصفوفة) وبذر هذه العضيات في وسط خال من المصفوفة ، يمكن إحداث مفتاح قطبية9.
كما نشرنا سابقا ، فإن معظم العضيات تعكس قطبيتها في غضون 12 ساعة. ومع ذلك ، يستغرق الأمر 48-72 ساعة للحصول على ثقافة تحتوي على أكثر من 90٪ من العضوية القمية. على الرغم من ميزتها المتمثلة في تمكين الوصول إلى سطح الخلية القمية ، إلا أن العضيات القمية تظهر انخفاضا كبيرا في الانتشار بعد انعكاس القطبية بينما تزداد معدلات موت الخلايابمقدار 13. يمكن أن يمثل عامل النشاط التكاثري متغيرا مربكا في التحليلات المختلفة ويجب أن يؤخذ في الاعتبار عند تصميم التجربة.
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لإنشاء الثقافات العضوية القمية المعوية وعضويات التحكم القاعدية العائمة لتحليلات المصب. علاوة على ذلك ، نصف وضع العلامات باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، المدمج في الحمض النووي المركب حديثا وبالتالي يشير إلى الخلايا المتكاثرة بنشاط. نصف أيضا تحليل الصور شبه التلقائي لمعدل تكاثر العضيات باستخدام برنامج arivis Pro (Zeiss) عن طريق القياس الكمي لخلايا EdU + . تم توضيح مخطط العملية في الشكل 1.
تم استخدام العضيات المعوية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة من ، والتي تم إنشاؤها وفقا ل Kramer et al. ، 202014 . بناء على إرشادات لجنة الأخلاقيات المؤسسية ، يتم تضمين استخدام مواد الأنسجة التي تم جمعها أثناء الاستئصال العلاجي أو ما بعد الوفاة في "موافقة المالك على العلاج" للجامعة ، والتي تم توقيعها من قبل جميع مالكي المرضى.
1. الثقافة العضوية
2. تحريض انعكاس القطبية ووضع العلامات على EdU
3. انقر فوق تفاعل تلطيخ EdU وتلوين Hoechst 33342
4. تحليل الصور شبه التلقائي
ملاحظة: في هذا التحليل ، تم استخدام الإصدار 4.2.2 من arivis Pro (برنامج تحليل الصور).
5. تحديد معدلات الانتشار العضوي
يجب أن تكون العضيات المزروعة لمدة 3 أيام بعد التربسين بين 50-250 ميكرومتر ، كما هو موضح في الشكل 2أ. قد لا تعكس العضيات الأكبر بكثير من ذلك قطبيتها بكفاءة. قد تبدأ العضيات الأكبر حجما أيضا في التبرعم ، وقد لاحظنا أن هذه العضيات يمكن أن تواجه مشاكل في انعكاس القطبية الفعال أيضا. تقدم العضيات القاعدية والقمية اختلافات مورفولوجية واضحة بالفعل في تصوير المجال الساطع. بينما تحتفظ العضيات القاعدية بالتجويف الكبير (الشكل 2ب) بعد 3 أيام من ثقافة التعليق ، تبدو العضيات القمية (الشكل 2ج) أكثر إحكاما. ميزة محددة للغاية لثقافات التعليق القمي هي عدد الخلايا الميتة التي تطفو حول العضيات. ويرجع ذلك إلى بثق الخلايا العضوية القمية للخارج الخلايا المتمايزة والميتة في الوسط المحيط ، بينما تتراكم العضيات القاعدية الخلايا الميتة في التجويف العضوي.
يمكن تصوير العضيات المعوية التي أدرجت EdU في الحمض النووي المركب حديثا قبل انقسام الخلية باستخدام مجهر متحد البؤر. تظهر العضيات القاعدية إشارات EdU أعلى بكثير بمرور الوقت من نظيراتها القمية (الشكل 3). من المهم ملاحظة أنه لا تظهر جميع العضيات خلايا EdU + على الرغم من نموها في الحجم. ويرجع ذلك إلى عدم وجود خلايا EdU + في طبقة التصوير المحددة.
يمكن تحليل هذه الصور متحدة البؤر كميا باستخدام برنامج تحليل الصور وخط أنابيب التحليل المقدم (الملف التكميلي 1). أثناء تنفيذ بروتوكول التحليل ، يجب أولا تطويق العضيات (الشكل 4أ) قبل استبعاد مناطق معينة من التحليل الفعلي (الشكل 4ب). قد تشير مناطق الاستبعاد هذه إلى الخلايا الميتة داخل التجويف العضوي ، والتي لا تهم القياس الكمي لإشارات EdU. يؤدي التنفيذ اللاحق لخط أنابيب التحليل التلقائي إلى تجزئة جميع النوى المكتشفة ، والتمييز بين نوى Hoechst33342+ و EdU + . بالإضافة إلى ذلك ، يتم استبعاد جميع النوى التي تقل عن قطع 15 ميكرومتر2 لأنها على الأرجح خلايا ميتة أو نوى لا تظهر بالكامل في طبقة الصورة هذه (الشكل 4ج).
بعد تحليل الصور باستخدام البرنامج وتصدير قياسات القياس الكمي ، يتم حساب هذه البيانات بشكل أكبر لتحليل النسبة المئوية لإشارة EdU + من الكتلة الكلية للحمض النووي (الشكل 5). في الحالة المعروضة في هذه المخطوطة ، تظهر العضيات المعوية القمية مستويات منخفضة بشكل كبير من التكاثر مقارنة بالعضيات القاعدية العائمة.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على البروتوكول الموصوف. يتضمن التخطيطي زراعة العضيات ، وتحريض انعكاس القطبية ، ووضع العلامات على EdU ، وتحليل الصور شبه التلقائي. الشكل الذي تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العضيات قبل وبعد تحريض انعكاس القطبية. (أ) العضيات المعوية المضمنة في المصفوفة بعد ثلاثة أيام من زرع الخلايا المكرونة بالتربسين في وسط النمو. (ب) العضيات القاعدية العائمة بعد ثلاثة أيام من البذر في ثقافة المعلقة. (ج) العضيات القمية بعد 3 أيام من البذر في ثقافة التعليق بدون BME لتحريض انعكاس القطبية. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: العضيات المعوية القاعدية والقمية المسماة ب EdU. تقدم اللوحة العلوية التي تصور صورا متحدة البؤر للعضيات القاعدية بمرور الوقت العديد من خلايا EdU + مقارنة بالعضيات القمية (اللوحة السفلية) في نفس النقاط الزمنية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الصور الكمي للعضيات المعوية الملطخة ب EdU. (أ) العضيات المحيطة باستخدام الوضعين Sphere و Polygon . (ب) تم تمييز المنطقة المراد استبعادها من التحليل باللون الأبيض (يشار إليها بالسهم). تشير هذه المنطقة إلى التجويف العضوي ، الذي يحتوي على عدد من الخلايا الميتة ، والتي سيتم استبعادها من التحليل اللاحق. (ج) تظهر الصورة بعد التحليل جميع النوى المجزأة. يتم تمييز Hoechst33342 + النوى باللون السماوي ، ويتم تمييز نوى EdU + باللون الأصفر ، ويتم تمييز النوى التي لا تصل إلى 15 ميكرومتر2 باللون الأخضر (Hoechst33342) والبرتقالي (EdU). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: معدل الانتشار العضوي. النسبة المئوية للحمض النووي EdU + من إجمالي الحمض النووي التي تعمل كوكيل لمعدل التكاثر العضوي التي تظهر انتشارا أعلى في العضيات القاعدية مقارنة بالعضيات القمية. يتم تقديم البيانات على أنها متوسط التسويق عبر محرك البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
متوسطة قاعدية | |
مكونات الوسائط | التركيز النهائي |
DMEM-F12 | |
مكمل بنسلين ستربتومايسين 100X للوسائط | 1x |
مكمل GlutaMAX | 2 مللي |
محلول عازلة HEPES 1 متر ، سائل | 10 ملم |
متوسط مكرر | |
مكمل B27 SerumFree (50x) ، سائل | 1x |
N-Acetyl-L-cysteine ، تم اختبار زراعة الخلايا | 1 ملي متر |
[Leu15] - Gastrin I الإنسان | 10 نانومتر |
أ 83-01 | 500 نانومتر |
HGF البشري | 50 نانوغرام / مل |
نوجين البشري (الثدييات) | 100 نانوغرام / مل |
منتدى إدارة الإنترنت البشري | 100 نانوغرام / مل |
FGF البشري الأساسي | 50 نانوغرام / مل |
R-Spondin وسط مكيف | 10 ٪ (حجم حجمي) |
Wnt-3a وسط مكيف | 50 ٪ (حجم حجمي) |
متوسطة قاعدية | الحجم المتبقي لتخفيف عوامل النمو المذكورة أعلاه / الوسط المكيف |
الجدول 1: تكوين الوسائط القاعدية والمكررة.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إحداث انعكاس القطبية في المزارع العضوية المعوية القياسية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة. تخدم العضيات القمية الغرض من الوصول إلى سطح الخلية القمية ، والتي عادة ما تكون موجهة نحو التجويف العضوي. يمكن أن تكون القدرة على فحص السطح القمي ذات أهمية كبيرة لتطبيقات معينة لأن هذا هو جزء غشاء الخلية الذي يتعرض لجميع محتويات الجهاز الهضمي في ظل الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي. الطرق الأخرى لتحدي السطح القمي على وجه التحديد هي الحقنالمجهري 16 ، واستخدام الطبقات الأحادية المشتقة من العضوية17 ، والتجزئة العضوية18. ومع ذلك ، فإن كل طريقة من هذه الطرق لها عيوب وعيوب محددة ، حيث قمنا نحن وآخرون بمراجعة أكثر تفصيلا سابقا19,20.
تتميز طريقة توليد العضيات القمية بالعديد من المزايا: 1) يعد توليد العضيات القمية أمرا سهلا نسبيا مقارنة بالطرق الأخرى ولا يتطلب أي أجهزة أو معدات متخصصة. لذلك ، فإن العضيات القمية هي طريقة فعالة من حيث التكلفة للوصول إلى سطح الخلية القمية. 2) يمكن استزراع العضيات القاعدية العائمة بالتوازي واستخدامها كعضيات تحكم ذات مغزى ، خاصة لتحليل التأثيرات الخاصة بالقطبية ؛ 3) يمكن أن تخضع عضيات BO و AO العائمة لتطبيقات المصب القياسية كما يتضح من دمج EdU في هذا التقرير ولكن أيضا التلوين الكيميائي المناعي (النسيجي) بالإضافة إلى المقايسات القائمة على اللمعان والفلورة كما تم الإبلاغ عنه سابقا13 والتصوير المباشر للخلاياالحية 12. تسمح التحليلات النهائية ، مثل تحليل دمج EdU أو البقع الكيميائية المناعية (النسيجية) ، أيضا ببعض المرونة من حيث الوقت ، حيث يمكن تخزين العضيات عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
على الرغم من سهولة انعكاس القطبية ، إلا أن هناك بعض النقاط الحرجة في بروتوكولنا التي يجب مراعاتها عند تطبيق هذه الطريقة. أولا ، العضيات المستخدمة في الخطوة 2.1. يجب أن يكون بحجم معين. في تجربتنا ، فإن استخدام العضيات بعد 3 أيام من التربسين يعمل بشكل جيد. ومع ذلك ، قد تختلف هذه المرة باختلاف عضويات الأخرى بسبب الاختلافات في تكاثر الخلايا أو اعتمادا على كثافة البذر لمجموعات الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، فإن تفكك BME باستخدام محلول الحصاد العضوي تدريجي. كما وصفه Co et al. ، 20199 ، قد تكون تركيزات BME المنخفضة التي تصل إلى 2.5٪ كافية للحفاظ على العضيات في مورفولوجيا قاعدية في ثقافة التعليق. لذلك ، يجب إزالة أكبر قدر ممكن من BME لضمان انعكاس القطبية بكفاءة. نقطة أخرى مهمة هي الاستخدام الصحيح لألواح زراعة الأنسجة غير المعالجة لتقليل الارتباط العضوي أثناء ثقافة التعليق. في تجربتنا ، تتيح الألواح المسبقة المصنوعة من محلول مضاد للالتصاق (الخطوة 2.4) استخدام أي لوحة تقريبا لثقافة العضيات القمية. ومع ذلك ، يمكن استكشاف خيارات أخرى تجعل ألواح الطلاء المسبق زائدة عن الحاجة.
تصبح أهمية تقييم التأثيرات على سطح الخلية القاعدية والقمية للخلايا الظهارية المستقطبة واضحة في كثير من الحالات. على سبيل المثال ، قمنا سابقا بتحليل تأثيرات سموم البكتيريا اللاهوائية Clostridioides difficile على عضويات BO و AO. تظهر نتائج هذه الدراسة أن المطثية العسيرة السم B (TcdB) تلحق الضرر فقط بسلامة الحاجز الظهاري المعوي في عضيات BO في الأمعاء الدقيقة ولكن ليس في عضيات AO. تسلط العديد من التقارير الأخرى التي تظهر تفاعلات خاصة بالمجال لمختلف الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض الضوء على أهمية تقييم جانبي الخلايا الظهارية9،16،21،22،23،24،25.
أحد العوائق الرئيسية للعضيات القمية هو سلوكها المتغير فيما يتعلق بتكاثر الخلايا. كما هو موضح أعلاه ، تظهر عضيات AO معدلات انخفاضا كبيرا في تكاثر الخلايا مقارنة بنظيراتها من BO. لقد أبلغنا سابقا أن هذا النقص في الانتشار يسير جنبا إلى جنب مع زيادة طفيفة في مستويات موت الخلايا13. في النهاية ، هذا لا يسمح بثقافة طويلة الأمد للعضيات AO ما لم يتم العثور على طريقة لإطالة عمر عضيات AO ومع ذلك ، فإننا نعتبر أن عضيات AO أداة مفيدة للغاية للوصول بسهولة إلى سطح الخلية القمية طالما أن الباحثين حريصون على الاستنتاجات التي قد تتأثر بانخفاض تكاثر الخلايا.
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
تم دعم هذا البحث باستخدام موارد مرفق VetImaging الأساسي (VetCore ، Vetmeduni ، النمسا). نود أن نشكر أورسولا ريشارت على دعمها في تحليل الصور شبه الكمي. حصلت GC على زمالة DOC (رقم المنحة 26349) من الأكاديمية النمساوية للعلوم (ÖAW) في قسم الطب الباطني للحيوانات الصغيرة في Vetmeduni.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24 well plates | Biologix | 07-6024 | |
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC) | Sigma-Aldrich | G-9145 | |
µ-Slide 18 Well Glass Bottom | ibidi | 81817 | |
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media | Gibco/Thermo | 15140122 | |
A 83-01 | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
arivis Pro | Zeiss | Version 4.2.2 | |
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid | Gibco/Thermo | 17504044 | |
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | Abcam | ab145597 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Scientific | C10340 | |
DMEM-F12 | Gibco/Thermo | 11320033 | |
Geltrex | Gibco/Thermo | A1413202 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco/Thermo | 35050061 | |
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid | Gibco/Thermo | 15630056 | |
Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B-100µG | |
Human HGF | PeproTech | 100-39-100µG | |
Human IGF-I | PeproTech | 100-11-100µG | |
Human NOGGIN (Mammalian) | PeproTech | 120-10C-200µG | |
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
Organoid Harvesting Solution | Thermo | C10340 | |
Triton(TM) X-100,for molecular biology | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco/Thermo | 25300054 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved