Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור

בבעלי חיים עם נוירונים שזוהו גדולים ( לדוגמה רכיכות), ניתוח של ברכות מוטוריות נעשה באמצעות טכניקות תאיות ^1,2,3,4. לאחרונה, פתח טכניקת extracellularly לגרות ולהקליט נוירונים בודדים ב Aplysia californica 5. כעת אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בטכניקה זו כדי לזהות ולאפיין את תאי עצב מוטורי במוסך.

בבעלי חיים עם נוירונים גדולים מזוהות (לדוגמא רכיכות), ניתוח של ברכות מוטוריות נעשה באמצעות טכניקות תאיות ^1,2,3,4. לאחרונה, פתח טכניקת extracellularly לגרות ולהקליט נוירונים בודדים בAplysia californica ^5. כעת אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בטכניקה זו כדי לזהות ולאפיין את תאי עצב מוטורי במוסך.

טכניקה זו יש יתרונות חוץ תאית. אלקטרודות ראשית, תאיות יכולות לגרות ולהקליט הנוירונים דרך המעטה ^5, כך שזה לא צריך להיות מוסר. לפיכך, הנוירונים יהיו בריאים בניסויים תאיים מאשר באלה תאיים. שנית, אם גרעינים הם לסובב על ידי הצמיד לנדן מתאים, אלקטרודות התאית יכולה לגשת לנוירונים בשני הצדדים של גנגליון, שהופך אותו קל יותר ויעיל יותר לזיהוי תאי עצב מרובים באותה ההכנה. שלישית, extracellular אלקטרודות לא צריכות לחדור לתאים, ובכך ניתן להעביר בקלות הלוך ושוב בין הנוירונים, גורמות פחות ניזק להם. זה שימושי במיוחד כאשר מנסה להקליט נוירונים מרובים במהלך דפוסים חוזרים מוטוריים שעלולים להימשך רק לדקות. אלקטרודות הרביעית, תאיות הן גמישות יותר מאשר תאי במהלך תנועות שרירים. אלקטרודות תאיות עשויות לשלוף אותו ולפגוע בתאי עצב במהלך התכווצויות שרירים. לעומת זאת, מאז אלקטרודות התאית נלחצות בעדינות על הנדן מעל הנוירונים, הם בדרך כלל להישאר מעל אותו נוירון בהתכווצויות שרירים, ולכן ניתן להשתמש בתכשירים שלמים יותר.

כדי לזהות תאי עצב מוטורי למאגר הרכב (בפרט, I1/I3 השריר בAplysia) באמצעות אלקטרודות תאיות, ניתן להשתמש בתכונות שאינם דורשות מדידות תאיות כקריטריונים: גודל ומיקום סומה, הקרנת אקסונלית, ועצבוב שרירים ⁴, 6,7. למאגר הרכב המסוים משמש להמחשת הטכניקה, הקליטו מעצבי buccal 2 ו 3 כדי למדוד תחזיות axonal, ומדדנו את כוחות ההתכווצות של שריר I1/I3 כדי לקבוע את הדפוס של עצבוב שרירים לתאי העצב המוטוריים הבודדים.

אנו מדגימים את התהליך המלא של הנוירונים מנוע זיהוי הראשון באמצעות עצבוב שרירים, אז העיתוי שלהם במהלך אפיון דפוסים מוטוריים, יצירת שיטת אבחון פשוטה לזיהוי מהיר. שיטת האבחון הפשוטה ומהירה יותר היא מעולה להכנות יותר שלמות, למשל בהכנת מסת buccal הושעתה ⁸ או ⁹ בגוף חי. תהליך זה יכול להיות מיושם גם בברכות מוטוריות אחרות ^10,11,12 בAplysia או במערכות חיים אחרות ^2,3,13,14.

1. הכנת תבשיל הקלטה

1. במהלך ניסויי מתמר הכח, גרעיני buccal, גנגליון מוחות, ומסת buccal ממוקמים בכלי פיירקס עגול שמתמחה במחקרים בכוח.
2. כדי לגרום לדפוסים ingestive כמו בניסויים, אנחנו צריכים להחיל את carbachol אגוניסט כולינרגית אינה hydrolyzable לגנגליון מוחות ^15. כדי להימנע ממגע ישיר מcarbachol על גרעיני buccal ומסת buccal, תאים נפרדים יש צורך לבודד את גנגליון המוחין מגרעיני buccal ומסת buccal (איור 1).
3. מאז מסת buccal היא הרבה יותר עבה מגרעיני buccal, הם לא ימוקמו באותה הרמה. לכן, המנה הזו צריכה לחזור לתא גנגליון המוח (אזור באיור 1), פלטפורמה לאמצע גרעיני buccal (השטח C באיור 1), והרבה יותר עמוק מול קאמרית למסת buccal (השטח D ב איור 1).
4. כדי ליצור את המאכל הזה, יתחיל בסיבוב 100x15 פיירקס צלחת (15 מ"מ גבוה, 100 מ"מ קוטר). בניית המנה תדרוש כמה שופכת של Sylgard. בצע את ההוראות שסופקו עם מוצר Sylgard. Sylgard יש לאפשר לנקבע בין שונים שופך.
5. המזיגה הראשונה היא ליצור רמה הגבוהה ביותר של Sylgard בצלחת (השטח B באיור 1), המהווה את החומה בין פלטפורמת האמצע ובחזרה הקאמרי.
6. השתמש בשתי אחוריים הפלסטלינה לבודד את האזור לSylgard קיר (השטח B באיור 1). המעייל אחורי הדוגמנות חימר עם ניילון נצמד שבו הם יתקשרו Sylgard להסרה בקלות. ודא חותמות הדוקות בקצוות, בי פלסטלינה תפנה את הצלחת, כדי למזער את הדליפה.
7. יוצק Sylgard לחלק בין שתי אחורי ההפלסטלינה כמעט עד לקצה העליון של המנה. בואו Sylgard להגדיר באופן מלא בין הלילה. שמירה על המנה במקום חם תניעהגדרה יותר מהר. הסר את אחורי ההפלסטלינה ולנקות את כל שאריות חימר בSylgard.
8. בשלב בא, התא האחורי (אזור באיור 1) ופלטפורמת האמצע (האזור C באיור 1) צריכים להיות שפך.
9. הנח גיבוי פלסטלינה כ 5 מ"מ מהמשטח הקדמי של Sylgard לקטע של פלטפורמת האמצע (השטח C).
10. יוצק Sylgard למקטעים לחדר האחורי (אזור) ואמצע הפלטפורמה (האזור C) עד לגובה של כ 3-5 מ"מ מתחת לרמה העליונה של Sylgard החומה הראשונה (השטח B). משטח Sylgard של החדר האחורי צריך להיות מעט נמוך מזה של פלטפורמת האמצע, כדי למנוע דליפה מהתא האחורי המכיל carbachol לפלטפורמת האמצע. שוב, בוא Sylgard להגדיר באופן מלא כל לילה ואז להסיר את גיבוי הפלסטלינה.
11. השלב האחרון הוא סימן חריץ באמצע Sylgard הקיר כדי לספק ערוץ לקישורי ההמוחין-buccal (CBCs) ללכתדרך בין פלטפורמת האמצע והחדר אחורי. רוחב החריץ הזה צריך להיות כ 3-4 מ"מ, שהוא רחב מספיק לCBCs. תחתית החריץ לא צריכה להיות נמוכה יותר ממשטח Sylgard של פלטפורמת האמצע כדי למנוע דליפה. להב סכין מנתחים יכול לשמש כדי לחתוך את החריץ.

2. הכנת האלקטרודה

1. משוך אלקטרודות זכוכית תאיות מזכוכית נימים חד קנים באמצעות Flaming-בראון micropipette חולץ כפי שתואר על ידי מקמאנוס et al. ⁸ בסעיף 3.1. עם נימת FT345B בחולץ, הגדרות התכנית הטיפוסיות שלנו הן חום 480, משוך 50, מהירות 13, ושעה 20, אך שימו לב שההגדרות תהיינה שונות לחוטים שונים. תכנית זו יוצרת את האלקטרודות במשיכה אחת עם שום שלב אש ליטוש. הגודל של קצה האלקטרודה צריך להיות קטן יותר מהגודל של גופי התא. לתאי העצב המוטוריים הנעים בין 50 עד 400 מיקרומטר מיקרומטר בקוטר סומה, diamete הפנימיRS של אלקטרודות הזכוכית התאיות צריך להיות בערך 40 מיקרומטר והתנגדויותיהם צריכות להיות כ -0.1 MΩ כאשר הם מלאים בAplysia מלוח.
2. משוך אלקטרודות יניקה מצינורות פוליאתילן באמצעות מבער בונזן. לחתוך חתיכה של צינורות פוליאתילן אורכו כ 10 סנטימטרים. החזק את הצינור בשני הקצוות ולמקם אותו מאוד קרוב לאש שנוצרה על ידי המבער בונזן תוך סיבוב הצינור עד שהוא הופך רך מהחום. למתוח את הצינורות בזהירות לאורכו תוך כדי התנועה אותו מהאש. החלק האמצעי של הצינורות יהיה להאריך ולצמצם כצינור נמשך.
3. לחתוך את הצינור בחצי כדי ליצור שתי אלקטרודות יניקה. אלקטרודות יניקה מיושמות בדרך כלל כדי לחתוך את הקצוות של עצבים או שרירים, למרות שהם יכולים לפעמים להיות מיושמים דרך הילוך.
4. צור אלקטרודות וו להקלטות עצב בעקבות הפרוטוקול שתואר על ידי מקמאנוס ואח' ⁸ בסעיפים 3.2-3.13. אלקטרודות אלו especiברית שימושית כאשר עצב או שריר אינו מנותק.

3. קובץ מצורף אלקטרודה הוק

1. לנתח את בעל החיים ולהסיר את מסת buccal בעקבות הפרוטוקול המתואר במקמאנוס et al. ⁸ סעיף 4.
2. להקלטה ולגירוי, אלקטרודות וו יכולות להיות מחוברות למספר עצבים שונים.
3. כדי לאפיין את הדפוסים כפי שנעשה בvivo על ידי Cullins ^ו9 Chiel, הקלטות יש לקבל מהעצב ושריר I2 המציין את שלב הארכה של האכלת ^16, עצב radular (RN), שמצביע על סגירת המזון ¹⁷ גספר, buccal עצב 2 (BN2) ועצב buccal 3 (BN3) המציין את שלב ההכחשה ^17,18. חיבור של אלקטרודות הוו כדלקמן הליך דומה לזה שתואר על ידי מקמאנוס ואח' ^8, סעיף 5.
4. את מיקומם של העצבים הללו מתייחסים לסכמטי של מנגנון האכלת Aplysia מוצג באיור 2 של מקמאנוס ואח' ^8. שים לב שBN2 trifurcates לסניפים, B ו-C לפני שהולך מתחת לשריר I1 בחריץ לרוחב. סניף הוא הסניף הראשון להיפרד מהגזע הראשי, והוא סמוך לBN3.
5. המינוח של סניפי A, B, ו-C שמש רמן וChiel ^18. סניפים, ב, ג ומתאימים לסניפים 3, 2, ו 1, בהתאמה, במינוח בשימוש על ידי Nargeot et al. ^19. יתר על כן, RN, BN1, BN2, וBN3 מתאים לעצבים 1, 6, 5, 4, בהתאמה, במינוח בשימוש על ידי ²⁰ קנדל ואח' סקוט ^21.
6. ללמוד עצבוב השרירים של שריר I1/I3, כל העצבים מלבד עצבי buccal 2 יהיו מנותקים ממסת buccal במהלך ניסויים. לפיכך, אנו משמשים האלקטרודה קרס להקליט מBN2.
7. מאחר I2 העצב וRN לא יצורפו למסת buccal, והם מאוד קשים לגישה באמצעות אלקטרודות וו, עדיף ליישם אלקטרודות יניקה להקליט מהם במקום. אנו מתארים את היישום של אלקטרודות יניקה בסעיף 7.
8. השתמש באחת האלקטרודה וו או האלקטרודה יניקה להקליט מBN3, כי זה קל לגישה באמצעות או סוג של האלקטרודה. אנחנו בחרנו להשתמש באלקטרודה וו לBN3 הקלטות כדי למזער את מספר מניפולטורים למחזיק את האלקטרודות היניקה, וכדי לחסוך מקום להמניפולטורים או ציוד אחרים.
9. צרף האלקטרודה וו לסניף של BN2 (BN2-) ליזום דפוסי דחייה דמויים במהלך ניסויים. כדאי לצרף האלקטרודה וו נוספת כדי BN2-בצד השני, משום שנוירונים מסוימים מגיבים באופן שונה לipsilateral לעומת נגדי BN2-הגירוי.
10. כדי לסייע בהבחנת נוירונים עם תחזיות חד צדדיות לעומת דו צדדיות, זהשימושי גם לצרף אלקטרודות וו לBN2 וBN3 בצד השני של גרעיני buccal.

4. גרעינים והכנת שרירים

1. גרעיני buccal, גנגליון מוחות ומסת buccal יהיו מוכנים לניסויי מתמר הכח, שבו גנגליון המוחין מחובר לגרעיני buccal דרך CBCs ומסת buccal מצורפת לגרעיני buccal באמצעות את BN2s בלבד.
2. לאחר שחבר את האלקטרודות הוו, לחתוך עצב buccal 1 (BN1) ועצבי ושט (EN) ילטרלי, חיתוך בנקודת חיבור למסת buccal.
3. משוך את גנגליון המוחין קדימה להזיז אותו מהדרך של שריר I2. לעשות חתך לתוך שריר I2 מעל צק radular, להאריך את הקיצוץ רוחבי וanteriorly בשני הכיוונים, ומושך את הדש של שריר I2 קדימה כדי לחשוף את עצב radular. חותך את שני סניפי RN ולוודא כי סניפים הם מספיק זמן בשביל קובץ מצורף האלקטרודה יניקה.
4. גontinue קיצוץ I2 במעגל רחב סביב גרעיני buccal, נזהר שלא לחתוך את BN2s או BN3s, עד גרעיני buccal וחלק המצורף של שריר I2 ניתן להפריד באופן מלא ממסת buccal. חותך את BN3s הבילטראליים בנקודת ההתקשרות למסת buccal, מעבר לעיקול האלקטרודה הקרס.
5. למרוח שכבה דקה של שומן ואקום לחריץ שבצלחת ההקלטה שתוארה לעיל, המחבר את החדר האחורי ופלטפורמת אמצע, באמצעות קצה פיפטה להרים גוש של שומן ואקום ופזר אותו על הרמה הגבוהה.
6. למרוח שכבה דקה של דבק סופר המהיר ג'ל לתחתית הזכוכית של החדר הקדמי שבו יוצב המוני buccal, ממש מול בסיס Sylgard של פלטפורמת האמצע.
7. בזהירות להעביר גנגליון המוחין, גרעיני buccal ומסת buccal למנת ההקלטה (איור 1) שתוארה בסעיף 2, כדי לוודא שאף אחד מאלקטרודות הוו הם משכו בחוזקה, מה שעלול לגרום ניזק לעצבים.
8. זהירות למקם את מסת buccal על הדבק בתא הקדמי של צלחת ההקלטה, כדי להבטיח ששטח הגחון שלה דבוק לתחתית הצלחת. הקפד לשמור את הגרעינים ואלקטרודות מלגעת בדבק. הוסף Aplysia מלוח ⁸ (460 המ"מ NaCl, 10 mM KCl, 22 המ"מ MgCl _2, 33 המ"מ ₄ MgSO, 10 המ"מימ CaCl _2, גלוקוז 10 מ"מימ, 10 מ"מ מגבים, pH 7.4-7.5) למנה, שיניע את הדבק כדי להגדיר.
9. אם יש להעביר את התבשיל למיקרוסקופ אחר להכנת גרעיני buccal להקלטות soma תאיות, להיות מאוד זהיר עם אלקטרודות הקרס. קבוצת האלקטרודות בצד אחד של מסת buccal יחד, וגם הקבוצה את האלקטרודות בצד השני של מסת buccal יחד. זהירות להחזיק את האלקטרודות על ידי אחיזת קלטת המעבדה שמכסה את הפינים, שוב כדי לוודא שאף אחד מהאלקטרודות משכו בחוזקה.
10. כאשר התבשיל ממוקם מתחת למיקרוסקופ, האלקטרודהזה צריך להיות עטוף בעדינות על צידי הצלחת והמנוחה על הרציף ליד הצלחת.
11. במהלך הפסקות ובין השלבים של הניסוי, לאוורר המלוח בתא ההמוני buccal באמצעות airstone אקווריום.
12. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הנדן של גנגליון המוחין ולמשוך אותו לתוך החדר האחורי, להבטיח כי את CBCs לרוץ דרך החריץ. הצמד גנגליון המוח באמצעות עצבים אחרים מאשר CBCs, כדי למנוע ניזק לCBCs השלם.
13. למרוח משחת ואקום יותר על CBCs, ולאחר מכן להוסיף מלח Aplysia יותר לשני בתי התבשיל, כך שגרעיניהם שקועים לחלוטין. ודא שהחלק העליון של גריז הוואקום גבוה במקצת מSylgard הקיר כך שלא תתרחש דליפה בין התאים.
14. כדי לייצב את גרעיני buccal, להצמיד תחילה את הקצוות של BN3s, לאחר מכן את BN1s וENS על בסיס Sylgard של הפלטפורמה הבינונית (איור 2). מאז BN3s יירשם באמצעות אלקטרודה ווs, הסיכות צריך להיות ממוקם יותר distally מנקודתי חיבור של אלקטרודות הקרס.
15. השתמש שני פינים, כפופה 90 מעלות, כווים למתוח ולעגן את CBCs, כך שCBCs לא ייפגע (איור 2).
16. להצמיד את ענפי RN בין התא האחורי וגרעיני buccal. אז שרירי I2 יהיו בחלק העליון של האחיות המוסמכות. כדי לחשוף את עצב I2, להשתמש במלקחיים כדי לתפוס את שריר I2 ולמשוך אותו מעל גרעיני buccal. להצמיד שתי פינות של I2 שרירים, כדי למנוע ניזק לעצב I2.
17. סבר I2 העצב הדיסטלי לנקודה שבה 2 הסניפים למזג לתוך שריר I2. ודא שרירים עדיין innervated להיות דומה לזה בהקלטות vivo. חתך את השארית של שריר I2 ולהעיף את עצבי I2 גב ולהצמיד אותו בין שני ענפי RN (ראה איור 2, הבלעה).
18. התאם את מיקומם של הסיכות כדי למתוח ולהוסיף מתח אם עצבים רופפים מדי, או לשחרר מתח אם nervהדואר הוא הדוק מדי. על מנת להמשיך ולייצב את גרעיני buccal, להוסיף עוד סיכות בנדן בין עצבים.
19. מאז גרעיני הלחי להציב את צד זנב, לסובב את גרעיני buccal אם הנוירונים של עניין הם בצד המקורי. כדי לסובב אחד מגרעיני 2 buccal, להשתמש במלקחיים עדינים לנדן לתפוס קצת עודף של CBC שבו נמצא בסמוך לגרעיני buccal ולהצמיד אותו בין BN2 וBN3. בגרעינים מסוימים, זה עשוי להיות נוח יותר להצמיד אותו בין CBC וBN3.
20. הוסף סיכה נוספת על הנדן של גנגליון buccal בצד הקרוב לתא הקדמי כדי למזער את התנועה של גנגליון buccal.
21. כדי לחתוך את נדן כיסוי גרעיני buccal, להשתמש במלקחיים עדינים לתפוס את הנדן בצד הקרוב לחדר האחורי, ולאחר מכן לחתוך את הנדן העודף עם מספריים מצוינים בלי לחשוף את גופי התא. כדי למזער את הניזק, הוצא את הסכום המינימאלי של נדן הצורך לראות את גופי תאים בלבד.
22. לאחר tהוא הנדן של גרעיני buccal חיתוך, מושך את עצב I2 ואחיות המוסמכות מעל גרעיני buccal ולהצמיד אותם בין גרעיני buccal והתא קדמי נוסף כדי לסובב את גרעיני buccal. (ראה איור 2).
23. כדי לשטוף את כל מגנזיום כלוריד נותר ⁸ ששמש ללהרדים את החיה לפני הנתיחה, החלף המלוח Aplysia בצלחת עם מלח Aplysia טרי.

5. חשמלית חיבור אלקטרודות Hook

1. לאחר הגרעינים והשרירים מוכנים, להעביר בזהירות את התבשיל לשולחן בידוד הרעידות לניסויים.
2. לצרף את כל סיכות אלקטרודה לאדניהם על כבלי BNC המתחברים למגבר (מגבר 1700 מודל מערכות הבוקר). שוב, לוודא שהאלקטרודות לא משכה בחוזקה בעת עושה את זה. ודא שהאלקטרודות מחוברות נכונה לכבלים המתאימים להן וכי הקוטביות נכונה.

איורים 4, 5 מראים תוצאות טיפוסיות המשמשות לזיהוי 2 I1/I3 תאי עצב מוטורי. איור 4 מראה את הקלטות soma של מנוע תא עצב גדול, B3, במהלך דפוסי egestive דמויים וingestive דמויים (4C דמויות, 4D). אחת לאחת וקוצים מקבילים בערוץ הסומא ותכנית ערוץ BN2 ipsilateral (האיור 4E) שהייחוד של הקלטת סומה B3 נשמר במהלך דפוסים. B3 שריפות בשלב הכחשת האמצע לסוף של הדפוסים. מאיור 4 ותוצאות אחרות (לא מוצג), מצא כי BN2 יחידת B3 תמיד BN2 היחידה הגדולה ביותר. לכן, זה יכול גם להיות מזוהה באופן ישיר מBN2 הקלטות.

איור 5 מראה את הקלטות soma של נוירון קטן, B43, בדפוסי egestive דמויים וingestive דמויים (איורים 5 ג, 5D). אחת לאחת וקוצים מקבילים בערוץ סומה וערוץ BN2 ipsilateral (האיור 5E) מראה גם כי את הספציפיות של הקלטת B43 סומה נשמרו במהלך דפוסים. נוירון B43 התפרצויות בסוף שלב ההכחשה בדפוסים. מאז BN2 יחידת B43 היא קטנה, זה יהיה קשה לזהות אותו מBN2 ההקלטות ללא הקלטת סומה, אך משום שהוא יורה ביותר בעצמה בסוף הדפוס המוטורי BN2, תום הפרץ של B43 עדיין יכול להיות מזוהה מBN2 הקלטות בלבד.

איור 6 מציג עץ אבחון אופטימלי שאינו דורש עצבוב שרירים כקריטריון, מה שהופך את זה הרבה יותר קל לזהות את extracellularly I1/I3 הנוירונים המנוע בהכנת מסת buccal המושעה או בגוף חי. עץ האבחון פותח, עם זאת, על ידי שימוש באמצעים של כוח וEMG, ובכך ממחיש עד כמה הטכניקות בפרוטוקול זה יכול להוביל לנוירון מוטורי זיהוי יעיל.

: לשמור-together.within עמודים = "תמיד">
איור 1. סכמטי של התקנה כללית והצלחת של המחקרים בכח. התמונה העליונה מציגה מבט מלמעלה. התמונה התחתונה מציגה מבט מצד (מקביל לקו המקווקו באמצע המבט מלמעלה). גנגליון המוחין מוצמד לSylgard בתא האחורי (אזור). גרעיני הלחי הצמידו לSylgard על פלטפורמת האמצע (השטח C). התא האחורי ואמצע הפלטפורמה מופרדים ע"י קיר Sylgard מוגבה (השטח B). קישורי ההמוחין-buccal (CBCs) עוברים דרך חריץ בקיר Sylgard, חתם עם גריז ואקום. מסת buccal מודבקת לתחתית הזכוכית של החדר הקדמי (האזור ד '). עצבי buccal 2 (BN2s) מצורפים למסת buccal. שני ווים המחוברים לתפרי משי מוכנסים לתוך האזורים הקדמיים ואחוריים של שריר I1/I3. Tאז הוא תפרי משי קשור למתמר הכח. הדמות משתמשת באפור כהה, אפור בהיר, ולבן כדי לציין את המשטחים של אזורי A, B, C, ו-D כהה הצבע, משטח גבוה יותר מתאים. הדמות משתמשת, B, C, ו-D כדי לציין ממדים חשובים של המנה. אורך הוא מ"מ 3-4, רוחב החריץ שמחבר את החדר האחורי ופלטפורמת אמצע. b הזמן הוא כ 3-5 מ"מ, הבדלי הגובה בין המשטחים של פלטפורמת האמצע (האזור C) וSylgard הקיר (השטח B). ג אורך מציין את אורכו של החריץ, שזה בערך 5 מ"מ. D הזמן מראה את הרוחב של פלטפורמת האמצע (האזור C), שזה בערך 5 מ"מ.

איור 2. סכמטי של גרעיני buccalואלקטרודות התקנה. האיור מציגות את מיקומם של עצבים מרכזיים, ובי עצבי buccal 1, 2, ו 3 (BN1, BN2, וBN3), עצב הוושט (EN), עצב radular (RN), I2 העצב ושריר , וחיבור buccal המוחי (CBC). שים לב שBN2s מצורפים למסת buccal (ראה תרשים 1). את CBCs מחובר לגנגליון המוח, עובר דרך החריץ של Sylgard הקיר ואטום עם גריז ואקום (ראה תרשים 1). RN והעצב ושריר I2 הם משכו מעל הגרעינים והצמידו הפרוקסימלי למסת buccal (כיוון קדמי). קווים כחולים מציינים את מיקומו של פינים. שתי סיכות עקומות (קווים אדומים שכותרת 1) משמשות כדי לעגן את CBCs. שים לב שכנף של נדן של CBC בצד השמאל מקופלת ומשפדים בין BN2 וBN3 לסובב גנגליון buccal השמאל (קו אדום מסומן 2). בגרעינים מסוימים, זה עשוי להיות נוח יותר להצמיד את הנדן למטה בין CBC וBN3. סיכה נוספת הוסיפה to הצד של גנגליון שהוא בקרבה ל( מסומן הקו האדום 3) EN לסיבוב וייצוב נוספים. אלקטרודת הזכוכית התאית ממוקמת בחלק העליון של הנדן לעיל סומה לגירוי והקלטה תאיים. האלקטרודות הוו מחוברות לBN3s ואת הפינים המחזיקים את העצבים האלה במקום צריכים להיות ממוקמים יותר distally מנקודתי חיבור של אלקטרודות וו אלה. שתי אלקטרודות יניקת מחוברי RN והעצב ושריר I2 (ראה הבלעה לתצוגה ברורה יותר של העצב והשריר I2). לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. תמונה ושרטוט של מפת נוירון לזיהוי תאי של I1/I3 המוטוריהנוירונים בגנגליון buccal Aplysia. התמונה העליונה מראה צד גנגליון buccal ימני, הצמידו צד זנב למעלה. כדי לסובב את גרעיני buccal, RN ועצב I2 / השריר משך מעל גרעיני buccal והצמיד הפרוקסימלי לצד של EN. דש נדן CBC גם מקופל והצמיד לסיבוב (ראה איור 2), כך שתאי העצב בצד המקורי או בגבול / הזנב המקורי שניתן לראות. סכמטי התחתונה נמשך מבוססת על התמונה למעלה. התמונה סכמטית ויחד מציינים את מיקומם של הנוירונים המוטוריים I1/I3 B3, B6, B9, B10, B38, B39, B43 ^6,7 וB82 ^22,23, כמו גם כמה נוירונים אחרים. הנוירונים B8a וB8b אחראים ליחידה הגדולה ביותר בRN, וinnervate I4 שריר שליטת גספר ^6,17. הנוירונים B4 ו-B5 אחראים ליחידה הגדולה ביותר בBN3 ^18. למרות הגדלים והמיקומים של I1/I3 הנוירונים המנוע משתנים מחיה לאo חיה, הגדלים ומיקומים יחסיים אמינות למדי עבור רוב הנוירונים: B3, B6, B9, B38, B43, וB82. ראה דיון לפרטים נוספים על I1/I3 תאי העצב המוטורי, ובמיוחד חלק מהקשיים של זיהוי B10 וB39 באופן ייחודי.

איור 4. זיהוי ואפיון I1/I3 מנוע נוירון B3). גירוי תאי של B3 (1 בחץ) והקלטה מB3 סומה (החל משעת החץ 2), כמו גם מעצבי שרירים המתאימים והאזורים. מלמעלה עד למטה, הערוצים הם הקלטות מB3 סומה, BN2 הנגדי, BN2 ipsilateral, BN3 ipsilateral, כוח ההתכווצות של האזור הקדמי של שריר I1/I3, וכוח ההתכווצות של האזור האחורי של I1/I3 שריר.קופסה כחולה מדגישה את משך הזמן של כוחות באזורים הקדמיים ואחוריים של שריר I1/I3. במקרה הספציפי הזה, הכח האחורי גדול מהכח הקדמי. ב ') תצוגה מורחבת של האזור המוגדר על ידי התיבה האדומה בA1. אחד ואחד לפוטנציאל פעולה המתאים בB3 _הסומא וiBN2 הערוצים מראה כי רק פרויקטי B3 על BN2 ipsilateral. C) הקלטה תאית מB3 הסומא ועצבים בדפוס מוטורי egestive דמוי. ד) הקלטה מתאית B3 הסומא ועצבים בדפוס מוטורי ingestive דמוי. ב C ו-D, מלמעלה עד למטה, הערוצים הם הקלטות מB3 סומה, עצב I2, RN, BN2 ipsilateral, וBN3 ipsilateral. הקופסות הכחולות מצביעות ארכה ושלבי נסיגה של הדפוסים. הברים האדומים בערוץ B3 _הסומא בשני C ו-D להדגיש את סיר הפעולהentials נרשם מB3 סומה. הברים האדומים בערוץ iBN2 גם C ו-D מצביעים על העיתוי המתאים כאשר B3 יורה בBN2 ipsilateral בדפוסים המוטוריים ההאכלה. ה) תצוגה מורחבת של B3 _הסומא וiBN2 ערוצים שמסומנים על ידי הקווים האדומים. הקווים מהקווקווים מראים אחד לאחד את הקשר בין פוטנציאל הפעולה בB3 _הסומא וiBN2 ערוצים. שים לב שBN2 היחידה של B3 היא הגדולה ביותר של כל היחידות. לפיכך, אנו יכולים גם לזהות את יחידות BN2 של B3 ישירות מBN2 הקלטות ללא הקלטות soma. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5. זיהוי ואפיון I1/I3 המנוע נוירון, B43. גירוי) תאי של B43 (1 בחץ) והקלטה מסומאה (החל משעת החץ 2), כמו גם מעצבי שרירים המתאימים והאזורים. מלמעלה עד למטה, הערוצים הם הקלטות מB43 _סומה, BN2 הנגדי, BN2 ipsilateral, BN3 ipsilateral, כוח ההתכווצות של האזור הקדמי של שריר I1/I3, וכוח ההתכווצות של האזור האחורי של I1/I3 שריר. הקופסה הכחולה מדגישה את מדידת הכח של I1/I3 השריר במהלך הפעילות B43. הפעלת B43 יוצרת כוח אחורי קטן, אבל אין לו כוח קדמי. ב ') תצוגה מורחבת של האזור המוגדר על ידי התיבה האדומה ב. הקווים מהקווקווים מראים אחד לאחד את הקשר בין פוטנציאל פעולה _בסומא B43 וiBN2 ערוצים, המצביע על כך B43 פרויקטים על BN2 ipsilateral בלבד. ג) הקלטה תאיתמB43 הסומא ועצבים בדפוס מוטורי egestive דמוי. ד) הקלטה תאית מB43 הסומא והעצבים בדפוס מוטורי ingestive דמוי. ב C ו-D, מלמעלה עד למטה, הערוצים הם הקלטות מB43 סומה, עצב I2, RN, BN2 ipsilateral, וBN3 ipsilateral. הקופסות הכחולות מצביעות ארכה ושלבי נסיגה של הדפוסים. הברים האדומים בערוץ B43 _הסומא בשני C ו-D להדגיש את פוטנציאל הפעולה שנרשם מB43 סומה. הברים האדומים בערוץ iBN2 גם C ו-D מצביעים על העיתוי המתאים כאשר B43 יורה בBN2 ipsilateral בדפוסים אלה. ה) תצוגה מורחבת של B43 _הסומא וiBN2 ערוצים, מסומנים על ידי הפס האדום בד. הקווים מהקווקווים להראות את הקשר אחד לאחד בין פוטנציאל הפעולה _בסומא B43 וiBN2 ערוצים. שים לב שBN2 יחידות של B43 הם קטנים ומאוד קשים לזהות בלי הקלטות soma, אלא אש באופן עקבי בסוף התכנית המוטורית BN2, מתן בדרך אחרת כדי לזהות אותם. שימו לב גם שהיחידה הגדולה יותר שמוצגת בלוח התחתון בE היא התנגשות של יחידת B43 _סומה עם יחידה תאית אחרת. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 6. העץ אופטימלי האבחון לזיהוי כמה מI1/I3 הנוירונים המנוע באמצעות סומה תאית והקלטות עצב. שיטת אבחון זו דורש מידע המינימאלי לזיהוי I1/I3 הנוירונים המנוע, מה שהופך את זה הרבה יותר קל identiהנוירונים פ.י. המנועיים בהכנת מסת buccal המושעה או in vivo. B3 יש BN2 היחידה הגדולה ביותר בין I1/I3 תאי העצב המוטורי שזוהו. בשאר תאי העצב המוטורי, B6 ו B9 הם רק שני נוירונים שפרויקט הוא על BN2 וBN3. B9 הוא רוחבי יותר B6. שאר הנוירונים מקרינים רק על BN2 גם ניתן לחלק לשתי קבוצות. קבוצה אחת של פרויקטי נוירונים ילטרלי דרך BN2s, הכוללת B10 וB39 ונוירונים מסוימים לא ידועים. הקבוצה האחרת של תאי עצב מקרינה ipsilaterally על BN2 בלבד, הכוללת B38, B43, וB82. B38 קרוב B3 ו B9. B82 קרוב B8 (ראה איור 3). B43 קרוב B6. יחידת BN2 שלו קטנה והתפרצויות בסוף תבניות אכילה.

איור 7. השוואה בין שיעורי הצלחה של נוירון identification במהלך ניסויי כוח או באמצעות טכניקה התאית או טכניקה התאית. עם התקנה הזהה מתמרים כוח, עשה 35 ניסויים תוך השימוש בטכניקה התאית (נקודות כחולות קטנות) ו27 ניסויים תוך שימוש בטכניקה התאית הקונבנציונלית (נקודות סגולות גדולות) כדי לזהות את I1/I3 תאי עצב מוטורי. ציר ה-X מציין את המספר הנמוך ביותר של תאי עצב מוטורי לשריר I1/I3 שזוהו בכל סוג של ניסוי. ציר y מציין את שיעור הצלחת האחוז של כל סוג של ניסוי. לדוגמה, בשנת 19 מתוך 35 (54%) מהניסויים התאיים, הצליח לזהות לפחות חמש I1/I3 נוירונים מוטוריים שונים. רק ב 1 מתוך 27 (4%) מהניסויים התאיים, הצליח לזהות לפחות חמש I1/I3 נוירונים מוטוריים. ברור כי שיעור ההצלחה בזיהוי הנוירונים הוא הרבה יותר גבוה מכל מספר נתון של נוירונים בטכניקה התאית.

בבעלי חיים עם נוירונים גדולים מזוהים, כגון רכיכות (לדוגמה, Lymnaea, הליקס, וAplysia), ניתוח של ברכות מוטוריות נעשה בדרך כלל באמצעות הקלטה תאית ^1,2,3,4. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תהליך לזיהוי תאי העצב המוטורי למאגר רכב באמצעות טכניקה ייחודית תאית. אנחנו השתמשנו במדידות הכח כהמחשה לתהליך זה. אפשר גם להשתמש EMG למדוד עצבוב שרירים. בקצרה, לשם כך, הפרוטוקול צריך לשנות כדי לצרף אלקטרודות וו לאזורים שונים של שרירי I1/I3 להקלטות EMG.

הטכניקה התאית יש יתרונות מסוימים על פני טכניקות תאיות, שחלקם כבר תוארו לעיל. ראשית, הטכניקה התאית דורשת פחות זמן ומאמץ כדי להכין את הגרעינים לניסויים ויגרום פחות ניזק לתאי עצב. בדרך כלל, זה ייקח 20-30 דקות להכין הבוקגרעיני קלוריות לניסויים תאיים וכ -1.5 שעות כדי להכין את גרעיני buccal שמצורפים למסת buccal לניסויים תאיים. מאז שרירים יהיו פחות פעילים ככל שהזמן עובר, פרש הזמן בין ההכנות לניסויי הגרעינים תאיים ואלה תאיים עשוי להיות קריטיים להצלחת ניסויים. איור 7 מציג השוואה של שיעורי הצלחה לזיהוי תאי העצב המוטורי לI1 / שרירי I3 באמצעות טכניקה תאית או תאית בלימודי כוח. בכל 35 ניסויי הכח התאיים (100%), הצליח לזהות נוירון המוטורי אחד לפחות לשרירי I1/I3. ב31 מתוך 35 (89%) ניסויים תאיים, הצליח לזהות לפחות שלוש I1/I3 תאי עצב מוטורי. ב 19 מתוך 35 (54%) ניסויים תאיים, הצליח לזהות לפחות חמש I1/I3 נוירונים מוטוריים שונים. לעומת זאת, אחוזי ההצלחה של הניסויים התאיים עם סםדואר התקנת מתמר כוח הייתה נמוכה יותר. ב23 מתוך 27 (85%) ניסויים תאיים, הצליח לזהות נוירון אחד לפחות I1/I3 מנוע. ב8 מתוך 27 (30%) ניסויים תאיים, הצליח לזהות לפחות שלוש I1/I3 תאי עצב מוטורי. רק ב 1 מתוך 27 (4%) ניסויים תאיים, הצליח לזהות 5 I1/I3 תאי עצב מוטורי. לכן, סבירות לזיהוי תאי עצב מרובים באותה גנגליון היא גבוהה יותר תוך שימוש בטכניקות תאיות בניגוד לטכניקות תאיות.

בנוסף, הטכניקה התאית יכולה לגשת רבים נוירונים בשני הצדדים של גרעינים במהלך אותו הניסוי. בדרך כלל, לאחר desheathing, אלקטרודות התאית יכולה לגשת לנוירונים בצד של גנגליון שכבר desheathed בלבד. לדוגמה, כאשר אחד מגרעיני buccal 2 (למשל hemiganglion בצד השמאל) ואסוף למעלה צד זנב, זה יהיה קל עבור אלקטרודות תאיות לגשת לתאי עצב שבצד של גנגליון, למשל B6, B9, B10, B39, וB43, אבל הקשה לגישת הנוירונים בצד המקורי של גנגליון, כגון, B5 B4, B8a, B8b, B38 וB82. לעומת זאת, אלקטרודות התאית יכולה לגשת רבים נוירונים בשני הצדדים של אותו גנגליון buccal עם סיבוב ראוי של גנגליון. זווית הסיבוב היא מתכווננת והפיכה. זה גם מעלה את הסבירות לזיהוי תאי עצב מרובים באותה גנגליון.

מאז אלקטרודות התאית נלחצות בעדינות על הנדן מכסה את הנוירונים, אלקטרודות אלה לא הוציאו של נוירונים, שעלול ליצור חורים גדולים בקרום ולגרום לניזק, כפי שקורה עם אלקטרודות תוך תאיים במהלך תנועות שרירים. גודל האות ישתנה כמהלך הגרעינים בתנועות השרירים. שים לב, לעתים במהלך תנועות שרירים גדולות, אותות הקלטת soma התאיים יהיו ירידה או אפילו הפסידו. עם זאת, אנחנו יכולים בקלות מוve חזרה אלקטרודה תאיים אל הנוירון ולשחזר את האותות המקוריים. זה עושה את זה אפשרי ליישם את השיטה התאית להכנת מסת buccal הושעה ⁸ למחקרים התנהגותיים, שבמהלכו יוצרים התכווצויות שרירים גדולות כהכנה יוצרת תגובות התנהגותיות שונות. לדוגמה, בשנת 47 מתוך 48 ניסויים המוניים buccal מושעה (98%), שהיינו מסוגל לזהות את הנוירון מוטורי אחד לפחות לשרירי I1/I3. ב 23 מתוך 48 (48%) ניסויים המוניים buccal מושעה, היינו יכול לזהות לפחות שלוש I1/I3 נוירונים מוטוריים. ב 11 מתוך 48 (23%) ניסויים המוניים buccal מושעה, הצליח לזהות לפחות חמישה תאי עצב מוטורי לשריר והשיא I1/I3 מהם בדפוסים מוטוריים כמסת buccal הייתה ביצוע התנהגויות האכלה דמוית. הטכניקה התאית היא ישימה גם לתכשירים אחרים יותר מסובכים למחצה שלמים, כגון הכנות האכלת הראש המבודדות הכוללות tהוא זרועות, שפות, לסתות, מסת buccal, גרעיני buccal, וגנגליון מוחות ^12,24,25,26. מאז הקלט החושי הוא מאוד חשוב להפקה את התנהגויות האכלה בהכנות כאלה, הטכניקה התאית תהיה שימושית במיוחד בגלל הפשטות שלו והתכונות פחות מזיקות. מחקרים קודמים הראו גם כי ניתן לזהות ולתעד כרוניים B4/B5 in vivo ^18. בניסויים אלה קודם לכן, החוקרים השתמשו נמוך נוכחי (10-20 μA) BN2-גירוי סלקטיבי כדי להפעיל B4/B5 והדביקו את צינור פוליאתילן קצר לנדן לעיל B4/B5 להקלטה, שלתוכו הוכנסו זוג שזור חוטי פלדה אל חלד. כך, אפשר גם לזהות ולהקליט מהנוירונים מנוע in vivo באמצעות אלקטרודה צינור פוליאתילן שדבוק אל הנדן מכסה את הגרעינים (Chestek וChiel, תוצאות שלא פורסמו).

הטכניקה התאית יש גם כמה limitatיונים. ראשית, זה יהיה קשה עבור אלקטרודות תאיות כדי לעורר נוירונים או להקליט כי הם קטנים מדי או עמוקים מדי בתוך גנגליון. שים לב שזה עדיין אפשרי כדי להפעיל נוירונים שאינם על פני השטח באמצעות גירוי חוץ תאי. עם זאת, המודל שלנו יש ⁵ הראה שהגירוי עלול לאבד את הספציפיות כאשר נוירון היעד הוא עמוק יותר מאשר תאי העצב הסמוך. כאשר תא העצב הוא עמוק יותר, מרחק אלקטרודה לסומה יהיה גדול וגבוה נוכחי יהיה צורך להפעיל את הנוירון הזה, שעשוי להיות גבוה מספיק כדי להפעיל נוירונים משטח אחרים בקרבת מקום. שנית, אם נוירון extracellularly עם מדי נוכחי הרבה, זה עשוי להיות פגום ולא להגיב; זרמים הרבה יותר קטנים נמצאים בשימוש בגירוי תאי, אם כי יותר מדי נוכחי intracellularly יכול גם להרוס תאי עצב. לפעמים הקלטת סומה תכלול יחידות מרובות משני נוירון היעד ונוירונים סמוכים, שהוא פחות ספציפי מintracelהקלטת lular. בנוסף, זה עלול להיות קשה יותר דווקא לשלוט ולפקח על תדירות הירי של נוירון אדם המשתמש תאי ולא הטכניקה התאית, משום שהאלקטרודה התאית לא יכולה לגרות ולהקליט אותו תא העצב בו זמנית. יתר על כן, הטכניקה התאית לא תהיה מסוגל להקליט את הקלט הסינפטי מתא עצב premotor. בנוסף, ייתכן שיהיה קשה ליישם נוירוטרנסמיטורים iontophoretically לנוירון ספציפי אלא גנגליון הוא desheathed, למרות שהראינו כי ניתן לעורר גנגליון באמצעות carbachol מבלי להסיר את המעטה ^27.

המגבלות של שיטות זיהוי תאיות עשו כמה נוירונים בברכה קשה לזהות המוטורית. בדוגמא הספציפית הזה, הטכניקה התאית המזוהית ביותר של הנוירונים המוטוריים לI1/I3 השריר באופן מהימן Aplysia: B3, B6, B9, B38, B43, וB82, המבוסס on גודל סומא ומיקום, הקרנה עצבית, ועצבוב שרירים. עם זאת, אנחנו לא היינו מסוגלים לזהות באופן מהימן B10 וB39. העבודה תאית קודמת ^6,7 הראתה כי B10 וB39 שני נוירונים סמוכים בצד הזנב של גרעיני buccal, בין B4/B5 האזור וB6 האזור. שני נוירונים להקרין על גבי BN2s ילטרלי. B10 innervates האזור האמצעי ואחורי של I1/I3 השריר, ואילו B39 innervates האזור הקדמי של שריר I1/I3. על סמך מיקום הסומא וקריטריוני הקרנה עצבית, מצא יותר משני תאי עצב מוטורי שפרויקט ילטרלי על את BN2s בארבעה ניסויים שונים. מאז מיקומם סומה, עצבוב שרירים, והעיתוי של פעילות במהלך דפוסים מוטוריים היו משתנה מחיה לחיה, לא היינו בטוחים אם הם היו אותם תאי עצב. לפיכך, לא היינו מסוגל לזהות באופן מהימן B10 וB39 באמצעות טכניקה התאית בגלל חוסר העקביות. כדי לזהות אותם,אנחנו צריכים לעשות סקר מעמיק יותר של נוירונים בגרעיני buccal, וייתכן שיהיה צורך בקריטריונים נוספים, כגון קלט הסינפטי מpremotor נוירונים B4/B5, ותשובות על משדרים, אשר דורשים טכניקות תאיות.

עם שינויים מתאימים, טכניקה זו היא גם לברכות רכב אחרות, כמו למשל בשריר I5 ^10, I2 שריר ^11, וI4 השריר ¹² בAplysia או למערכות אחרות, למשל Lymnaea stagnalis ^{2, 3} הליקס pomatia, ¹³ מקק, ו דג זברה ^14. לדוגמה, אם רוצה ליישם את הטכניקה לתאי העצב המוטורי לשריר I5 (הידוע גם כאבזר radular שריר או ARC ^10,28 קרוב) בAplysia, אחד צריך לשמור על BN3s המצורף למסת buccal במקום BN2s , משום שהנוירונים המוטוריים i5 B15 וB16 הפרויקט בBN3 ^6,7 ipsilateral. אז לאהוא מסת buccal צריך להיות מוכן לחשוף את שרירי I5 ללימודי הכח EMG או. לאחר הנוירונים זוהו באופן אמין בהכנה המופחתת, שיטת אבחון אופטימלית יכולה גם להיות שנוצרה עבור מחקרים התנהגותיים בעתיד.

הטכניקה שתארנו משווה לטובה עם טכניקות תאיות אחרות כגון מערכים רב ואלקטרודות וצבעי מתח רגיש. ²⁹ טכניקה לצבוע מתח הרגישה משמשת רק לצורך ההקלטה, ואילו אלקטרודות התאיות שלנו ומערכים רבים ואלקטרודות ³⁰ יכולים לשמש הוא לגירוי וצריבה. שניהם מערך מרובה האלקטרודה ²⁹ וצבעי מתח רגיש ³⁰ יכולים להקליט אותות מתא עצב רב בו זמנית. למרות האלקטרודה תאית אחד יכולה להקליט רק מתא עצב אחד או שניים תלוי בגודל קצו והמיקום האלקטרודה, זה בהחלט אפשרי כדי למקם כמה בגנגליון בו זמנית, ושאנחנו צריכים לעשותזה בהצלחה. הסטנדרטי במערך מרובה האלקטרודה מבחנה יש 8 × 8 או 6 x 10 אלקטרודות ^29. מאז את האלקטרודות מופצת באופן שווה במערך, הוא לעתים קרובות מאתגר כדי לקבוע את זהותם של נוירונים הבסיסיים שמתוך הקלטות מתקבלות, שכן תאי העצב אינו מתחלקים באופן שווה, ולאחר העיבוד של האותות המשמעותיים, שחלקם עדיין ידני, צריך לעשות כדי לפתור את העמימות הזו. בניגוד לכך, כי את האלקטרודות התאית ממוקמת מעל somata היחיד, את זהותו של נוירון הבסיסי היא ברורה. לפיכך, נראה כי מערכים רב ואלקטרודות וצבעי מתח רגיש עשויים להיות יעילים יותר להקלטות בו זמנית מספר. עם זאת, טכניקת האלקטרודה התאית שלנו עשויה לספק סלקטיביות טובה יותר הוא בגירוי וצריבה.

אין לנו מה למסור.

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH NS047073 ומענק NSF DMS1010434.