Quelle: Peiman Shahbeigi-Roodposhti und Sina Shahbazmohamadi, Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, Storrs, Connecticut

Optische Mikroskope gibt es schon seit Jahrhunderten, und obwohl sie vor Jahrzehnten ihre theoretische Auflösungsbeschränkung erreicht enden, haben neue Geräte und Techniken, wie konfokale und digitale Bildverarbeitung, neue Nischen im Bereich der optischen Imaging. Die besten optischen Mikroskope haben in der Regel eine Auflösung von bis zu 200 nm unter idealen Bedingungen. Optische Mikroskope werden jedoch durch die Beugung von Wellen begrenzt, eine Funktion der Wellenlänge, die für sichtbares Licht etwa 500 nm beträgt. Die Auflösung optischer Mikroskope erreicht zwar nicht die von Elektronenmikroskopen, aber sie sind die wertvollsten Werkzeuge bei der Abbildung biologischer Makrostrukturen und ein Grundnahrungsmittel in jedem biologischen Labor.

Bei herkömmlichen Lichtmikroskopen stammt das signal des abgebildeten Objekts aus der vollen Dicke der Probe, was es nicht zulässt, dass der größte Teil davon im Fokus des Betrachters steht. Dadurch ist das Bild "aus dem Fokus verschwimmen". Das konfokale Mikroskop hingegen beleuchtet die Probe durch ein Pinloch und ist somit in der Lage, das außer fokussierte Licht von oben und unterhalb des Fokuspunkts im Objekt herauszufiltern.

Diese Demo bietet eine Einführung in die Bildaufnahme mit optischen und konfokalen Mikroskopiemethoden. Hier wird ein geschnittenes Stück Maushirn untersucht.  Die Bildaufnahme und -analyse, einschließlich der Werkzeuge zum Generieren topografischer Karten und zusammengesetzter Bilder, wird behandelt. Die Vor- und Nachteile verschiedener bildgebender Verfahren, die sich auf Auflösung, Schärfentiefe und Probentyp beziehen, werden ebenfalls erörtert. Der Zweck dieser Demonstration besteht darin, mehr Informationen über optische und konfokale Mikroskope bereitzustellen, um festzustellen, ob diese Mikroskopiemodule für eine Art biologischer Proben am besten geeignet sind.

Optische Mikroskope funktionieren mit mindestens zwei Elementen der Vergrößerung. Die primäre Linse, das als Objektiv bezeichnet wird, bestimmt die Gesamtvergrößerung, und die sekundäre Linse, das okular genannt, fokussiert das virtuelle Bild für die Anzeige. Die Gesamtvergrößerung wird durch Multiplikation der Vergrößerungen der beiden Linsen bestimmt. Die Fokussierung des Lichts durch diese Quellen, gekoppelt mit der Fokussierung des Lichts von der Lampe auf die Probe, geben eine bestimmte Fokusebene, wo die Vergrößerung und das Lampenlicht alle an der gleichen Stelle treffen, was die beste Auflösung im Bild ergibt. Die folgende Abbildung zeigt, wie die Brennebene der Probe durch die verschiedenen Linsen erzeugt wird. Objekte außerhalb der Brennebene haben Lichtstrahlen, die aufgrund des größeren Beleuchtungsbereichs von anderen Teilen der Probe stören. Dies führt zu Unschärfe im Bild. Um sich daher auf verschiedene Z-Positionen einer Probe mit sehr unterschiedlichen Höhen zu konzentrieren, müssen die Z-Richtungsscheiben in die Brennebene bewegt werden.

Abbildung 1. Optische Mikroskopielinsen und Brennebenen.

Digitale Mikroskope arbeiten nach dem gleichen Prinzip wie optische Mikroposkope, mit der Ausnahme, dass sie nicht auf ein Okular angewiesen sind. Es ist ein optisches Mikroskop mit einer Digitalkamera ausgestattet. Die Digitalkamera fungiert als Detektor, und Bilder werden auf einem Computermonitor angezeigt. Diese Mikroskope eignen sich ideal für die Analyse und Dokumentation von Proben während Forschung und Entwicklung (F&E), Herstellung und Inspektion, Qualitätskontrolle und -sicherung (QC/QA) sowie Fehleranalyse (FA). Sie bieten in der Regel Software, die es Benutzern ermöglicht, das Beispielbild zu analysieren. Abbildung 2 zeigt eine typische digitale Mikroskop-Einrichtung.

Abbildung 2. Hauptkomponenten des digitalen Mikroskops.

Die Hauptkomponenten des Systems sind:

1. Optische Engine: Enthält den Bildaufnahmesensor und Objektive zum Vergrößern des Bildes.
2. Ziel: Erwirbt und fokussiert das Licht aus der Probe. Für verschiedene Bildaufnahmeaufgaben stehen drei verschiedene Ziele zur Verfügung.
3. Scanphase: Ort, an dem das Beispiel platziert werden soll.
4. Mikroskopständer: Unterstützt die optische Engine und die Scanstufe. Steuert auch die Kommunikation zwischen den angeschlossenen Komponenten und dem Computer.
5. Computer: Unterstützt Benutzersoftware und ermöglicht die Anzeige von Bildern auf dem Monitor.
6. Controller: Steuert das Mikroskop und den Workflow mit Multitouch-Gesten und berührungsempfindlichen, kontextspezifischen Symbolen. Die Steuerknöpfe steuern die Zoom-, Fokus- und Mikroskopbildposition.

Ein konfokales Mikroskop oder konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) ist ein Mikroskop mit erhöhter optischer Auflösung und Kontrast. Konfokal bedeutet "den gleichen Fokus haben". Das Objekt und sein Bild sind "konfokale".

Abbildung 3. Unschärfe und seine Wirkung auf ein Bild. Das linke Bild zeigt ein nicht fokussiertes Bild mit verschwommenen Kanten. Das rechte Bild zeigt den Lichtpfad durch die Linse, wenn eine Probe im Fokus dargestellt wird.

Im Gegensatz zu allgemeinen Lichtmikroskopen, die die gesamte Probe beleuchten und abbilden, nutzen konfokale Mikroskope ein Loch zwischen Der Probenstufe und Detektor, so dass jeweils nur ein kleinerer Lichtstrahl auf eine schmale Tiefe fokussiert wird. Daher ist der einzige sichtbare Bereich der Stichprobe der Fokuspunkt. Das konfokale Mikroskop scannt dann die Oberfläche der Probe mit diesem viel fokussierteren Lichtstrahl (oder einem Laser). Die Daten werden dann zu einem 2D-Bild zusammengesetzt, das eine bessere Auflösung als die klassische optische Mikroskopie hat. Da das Licht auf einen sehr engen Höhenbereich fokussiert ist, kann der Benutzer verschiedene Ebenen in den Fokus rücken, wenn die Z-Richtung bewegt wird. Durch Bildverarbeitungstechniken und Automatisierungssoftware helfen konfokale Mikroskope bei der 3D-Rekonstruktion von multiebenen verbundischen Bildern.

Konfokale Mikroskope haben die Fähigkeit, durch Bildverarbeitung Z-Richtungsdaten über eine Probe zu geben, die zuvor in der optischen Mikroskopie nicht verfügbar war. In der unten beschriebenen Demo kann der Benutzer z. B. den oberen und unteren Fokusbereich für eine Stichprobe definieren und dann nicht nur eine Heatmap mit Messungen der Z-Richtung erstellen, sondern auch ein zusammengesetztes Bild erstellen, das alle Teile des Bildes in Fokus. Diese Funktionen sind besonders hilfreich, wenn Sie 3D-Daten zu einem Beispiel erhalten.

Abbildung 4. Hauptkomponenten eines konfokalen Mikroskops.

Zu den Hauptkomponenten des konfokalen Mikroskops gehören:

1. Scankopf mit feinem Z-Laufwerk und 4-Megapixel-Kamera, Ständer mit grobem Z-Laufwerk
2. Objektive: 2.5x/ 5x/ 10x/ 20x/ 50x/ 100x
3. Stufen: Scan- und Feststufe
4. Computersystem: PC-System-Imaging-Software
5. Regler: x, y, z Bewegung

1. Konfokale Bildgebung

1. Laden Sie das Sample auf die Bühne. Zentrieren Sie es unter der Linse. Sie sollte die Gewichtsbeschränkung der Stufe, die in diesem Fall 5 kg beträgt, nicht überschreiten. Die Probe sollte nicht mehr als 100 mm dick sein.
2. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie "Auftrag erstellen".
3. Wählen Sie unter der Spalte Topographiendie Assistentenschaltfläche aus.
4. Erstellen Sie ein Übersichtsbild bei der niedrigsten Vergrößerung, 2.5X. Stellen Sie vor dem Wechseln der Vergrößerungen sicher, dass die Probe im Fokus steht, indem Sie die Z-Position ändern, bis Sie ein klares Bild sehen. Dies kann durch Drücken oder Nachziehen des 3D-Mikroskopmanipulators erfolgen. Eine feinere Z-Bewegung wird erreicht, indem man die Taste an der Seite einnimmt, was ein blaues Licht um die Ränder verursacht.
5. Erhöhen Sie langsam die Linsenvergrößerung und spielen Sie kontinuierlich mit der Lichtintensität und dem Fokus, bis Sie bei der gewünschten Vergrößerung sind. Wählen Sie bei Bedarf einen anderen Interessenbereich aus, indem Sie die Bühne mithilfe des Manipulators in die x- und y-Richtung verschieben.
6. Sobald ein Übersichtsbild bei der niedrigen Vergrößerung aufgenommen wurde, drücken Sie die nächste Schaltfläche, um zum Referenzpunktschritt zu gelangen. Geben Sie bei Bedarf einen bestimmten Bezugspunkt für die Messung an (d. h. die Ecke der Stichprobe), obwohl der Standardreferenzpunkt zu diesem Zweck in Ordnung ist.
7. Klicken Sie auf den nächsten Pfeil, um zum nächsten Teil des Assistenten zu gelangen.
8. Ändern Sie das Ziel wie gewünscht, um eine für Ihre Stichprobe geeignete Auflösung anzuzeigen. In diesem Fall wird die 50X Objektivlinse verwendet, um die Zellen in der Probe zu visualisieren. Das 50X ist das Objektiv, das der Probe am nächsten ist, also nach und nach bis zum 50X-Objektiv bewegen, um sicherzustellen, dass es noch Raum gibt, um den Arbeitsabstand nach dem 20X-Objektiv zu verringern.
9. Verschieben Sie auf der Seite "Messbereichsdefinition" die Z-Position leicht (klicken Sie auf die Seitentaste am Manipulator für Feineinstellungen), sodass nur die Spitze der Probe im Fokus steht, und klicken Sie auf "Letzte einstellen". Bewegen Sie dann die Bühne in Z-Richtung (nach unten), bis nur der bodenlange Teil der Probe im Fokus ist und drücken Sie "Set First". Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der berechneten Slices 1000 nicht überschreitet oder das Programm fehlschlägt.
10. Stellen Sie sicher, dass die Intensität des Lichts nicht übersättigt (verursacht rote Pixel) im Bild auf einer der Ebenen und dann drücken Fertig. Dies wird das Tomographie-Bild nehmen und die Tomographie-Software öffnen.
11. Öffnen Sie in der Tomographie-Software Tabs wie die Registerkarte Studien, um die Daten in 3D anzuzeigen und Messungen im 2D- oder 3D-Raum durchzuführen.

2. Digital optische Mikroskop-Bildgebung

1. Laden Sie das Sample auf die Bühne. Zentrieren Sie die Probe unter der Linse. Das Probengewicht sollte die Gewichtsbeschränkung der Stufe, die in diesem Fall 4 kg beträgt, nicht überschreiten. Die Probe sollte nicht höher als 12 cm sein.
2. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware.
3. Wählen Sie einen Auftrag aus der Liste der bereitgestellten Vorlagen aus. Es ist auch möglich, außerhalb eines Jobs zu arbeiten, indem Sie freie Prüfung drücken, wodurch Sie eine Probe außerhalb eines Jobs studieren können.
4. Erfassen Sie ein Übersichtsbild, das die gesamte Bühne anzeigt. Dies dient später als Karte, um den Teil des Beispiels anzuzeigen, der angezeigt wird. Verwenden Sie beim Erfassen des Bildes den Controller, um den Fokus und die Bildposition zu ändern.
5. Platzieren Sie ein Koordinatensystem. Das Standardkoordinatensystem stammt aus der hinteren linken Ecke der Bühne und ist für diese Anwendung in Ordnung. Wenn die Probe schief ist, können Sie die Koordinaten hier anpassen.
6. Benennen Sie das Beispiel und den Auftrag, dies fügt es der Liste der Aufträge hinzu, damit andere Benutzer zu ihm zurückkehren können.
7. Wählen Sie die Kamerataste unter Erwerben. Nehmen Sie ein erstes Bild, und drücken Sie dann die Live-Taste, während Sie im Beispiel navigieren.
8. Bewegen Sie den Fokus nach unten, bis die Stichprobe klar im Fokus steht. Es kann notwendig sein, auch die Beleuchtung unter der Registerkarte Beleuchtung und Blende einzustellen.
9. Optimieren Sie das Bild mit den Werkzeugen unter dem Bedienfeld Bildoptimierung. Sie können mit verschiedenen Parametern unter der Registerkarte Bildverbesserungen spielen, z. B. die Neigung des Objektivs, die Beleuchtungsstärken auf der Probe sowie Helligkeit und Kontrast, bis das Bild die gewünschte Schärfe aufweist.
10. Führen Sie Messungen durch Tippen auf das Bleistift-Werkzeug auf der Software durch. Von dort aus haben Sie Zugriff auf mehrere Messwerkzeuge, einschließlich Entfernungen, Winkel und Fläche. Verwenden Sie die Entfernungs- und Flächenwerkzeuge, um die Größe der Stichprobe zu messen.
11. Wechseln Sie zur Registerkarte Ergebnisworkflow, und überprüfen Sie das Workflowlayout, um das Layout des Berichts zu konfigurieren.
12. Tippen Sie auf die Schaltfläche Speichern, um Ihren Auftrag zu speichern, damit andere den gleichen Workflow verwenden können.

Die folgenden Bilder geben einen Überblick über die Ergebnisse, die mit einem konfokalen Mikroskop von einem Maushirn erzielt werden können. Sie zeigen, wie unterschiedliche Informationsebenen erreicht werden können und wie eine topografische Karte der Ergebnisse die Höhe der Stichprobe aufzeigt.

Abbildung 5: Konfokale Bilder bei 50-facher Vergrößerung, die ein geschnittenes Maushirn zeigen. Das Bild auf der linken Seite ist ein zusammengesetztes Bild, das alle Fokusebenen während der Tomographie aufnimmt und ein hochauflösendes und tief fokussiertes Bild erzeugt. Das Bild rechts zeigt die topografische Karte des Beispiels.

Abbildung 6: Als besseres repräsentatives Beispiel für die 3D-Anwendungen des konfokalen Mikroskops wurde ein Loch aus Kunststoff abgebildet und analysiert. Die ursprüngliche topographische Karte befindet sich auf der linken Seite und die 3D-Rekonstruktion auf der rechten Seite.

Abbildung 7: Zeigt den Umfang der ConfoMap-Softwareanalyse zum Beobachten eines Profils aus einer 3D-Rekonstruktion. Die Amplitudenparameter, das Rauheitsprofil und die Kurvencharakterisierung werden angezeigt.

Die folgenden Bilder geben einen Überblick über die Ergebnisse, die mit der Verwendung eines digitalen optischen Mikroskops auf derselben Maus-Gehirnscheibe gewonnen werden können. Das digitale Mikroskop bietet ein größeres Sichtfeld, aber Bilder mit niedrigerer Auflösung aus dem konfokalen Mikroskop, das sich ideal für die Betrachtung größerer Komponenten oder biologischer Strukturen eignet. Die Software verfügt über nützliche Analysewerkzeuge zur Messung der Probe.

Abbildung 8: Übersichtsbild mit der gesamten Orgelscheibe.

Abbildung 9: Im Bild eines geschnittenen Maushirns vergrößert. Hier ist ein 300 Mikron Sichtfeld mit gemischter Koaxial- und Ringbeleuchtung sowie elektronischer Bildstabilisierung.

Abbildung 10: Demonstration der Messmöglichkeiten des digitalen optischen Mikroskops. Der Durchmesser der Probe wird auf der linken Seite gemessen, und auf der rechten Seite wird eine benutzerdefinierte Gliederung angezeigt, die zur Berechnung des inneren Bereichs des geschnittenen Maushirns verwendet wird. Diese Werkzeuge sind nützlich bei der Analyse biologischer Proben, die möglicherweise keine Kanten aufweisen, die mit vordefinierten Formen identisch sind.

In dieser Demonstration wurden die Schärfentiefe, das Sichtfeld und die maximale Auflösung und Vergrößerung von optischen und konfokalen Mikroskopen optimiert, um biologische Proben zu sehen. Diese Demonstration sollte dem Teilnehmer helfen, zu entscheiden, welches Mikroskopisierungsmodul für eine bestimmte Anwendung das beste ist. Beide Mikroskopie-Modi haben Vorteile bei der Analyse biologischer Proben auf ihre einfache Herstellung und hochauflösende zusammengesetzte Bilder.

Die Anwendungen für die optische und konfokale Mikroskopie sind weitreichend. Aufgrund der begrenzten Probenvorbereitung und der Fähigkeit, Bewegungsebenen zu integrieren und Lichttechniken über der Probe zu verwenden, sind diese Tools in der Lage, Informationen aus den meisten Datensätzen zu erhalten. Mikroskopie war eine sehr beliebte Option bei der Abbildung von lebenden Zellen, wie sie mit Fluoreszenz behandelt werden, aber die Anwendungen können von bildgebenden Oberflächen biomedizinischer Geräte bis hin zur Erkennung von Defekten und Rauheit reichen, bevor sie im Körper implantatiert werden. Konfokale und optische Mikroskopie sind der aktuelle Standard für bildgebende biologische Proben.

Schließlich bietet die konfokale Mikroskopie eine verbesserte Bildgebung mit Fluoreszenztechniken. Fluorophore in einer Probe haben eine begrenzte Lebensdauer und können fotobleichen, wenn sie hohen Lichtmengen ausgesetzt sind. In der traditionellen Lichtmikroskopie wird die gesamte Probe während der Bildgebung beleuchtet, was zu einer schnellen Photobleichung führt. Da jedoch nur ein winziger Teil der Probe gleichzeitig mit konfokaler Mikroskopie beleuchtet wird, ist die Lebensdauer des Fluorophors länger und es gibt weniger Herausforderungen im Zusammenhang mit der Photobleiche.