Quelle: Peiman Shahbeigi-Roodposhti und Sina Shahbazmohamadi, Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, Storrs, Connecticut

Nanopartikel wurden zunehmend in der Forschung zur gezielten Medikamentenabgabe und kontrollierten Freisetzung von Arzneimitteln eingesetzt. Während die meisten dieser Partikel aufgrund ihrer Biokompatibilität als polymere oder liposomale Partikel entwickelt wurden, gibt es in der aktuellen Forschung einen Trend zur Verwendung von metallischen und magnetischen Nanopartikeln. Diese metallischen Nanopartikel wurden ursprünglich als Kontrastmittel in der Bildgebung verwendet, aber die jüngsten Fortschritte haben gezeigt, wie wichtig sie bei der Medikamenten- und Genabgabe und in Therapeutika sein können. Gold, Silber und paramagnetische Nanopartikel haben den größten Anteil an der Forschung. Es hat sich gezeigt, dass sie eine gute Biokompatibilität haben, und bestimmte Sorten magnetischer Nanopartikel wurden bereits als therapeutische Zielmedikamente entwickelt und vertrieben.

Diese schweren Elemente werden in der Regel für die Forschung mit Fluoreszenz zur Bewertung der Lieferung und Verteilung abgebildet, aber ihre atomaren Gewichte sind gute Voraussetzungen für einen erhöhten Kontrast in der Rückstreuelektronenanalyse mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM ). Die energiedispersive Röntgenspektroskopie, die charakteristische Röntgenstrahlen verwendet, die bei Elektronenstrahl-Wechselwirkung mit der Probe zur Identifizierung der chemischen Zusammensetzung emittiert werden, kann auch mit dem SEM verwendet werden. Diese Methoden haben die Vorteile einer erhöhten Auflösung und eines erhöhten Vertrauens in die Detektion, da das EDS sicherstellen kann, dass das Motiv eines Bildes die richtige Zusammensetzung aufweist, während sich aktuelle Fluoreszenzmethoden von den Nanopartikeln lösen und schnell verblassen können. während der Bildgebung.

Diese Demonstration wird die größenabhängige Metall-Nanopartikelverteilung in Organen des Körpers im Laufe der Zeit untersuchen. Ausgeschnittene Organe werden mit SEM auf verschiedene Partikelgrößen in einem Bereich von Zeitpunkten nach der Partikelabgabe an den Körper untersucht.

Es ist schwer, die Bedeutung von Nanopartikeln (NPs) für medizinische Anwendungen zu überschätzen. Sie werden als Drogen, Drogenträger, Kontrastmittel usw. verwendet. Um jedoch eine bestimmte Art von Nanopartikeln zu verwenden, ist es notwendig zu wissen, wie und wo es in jedem Organ nach der Anwendung verteilt wird und wie lange es dauern wird, bevor das Organ und anschließend der Körper verlassen wird. Dies wird als Bioverteilung bezeichnet.

Der Prozess der Verabreichung von Nanopartikel-Medikamenten kann in seiner Komplexität stark variieren, von passiven Medikamenten, die nicht auf das Gewebe abzielen, sondern stattdessen in den ganzen Körper freigesetzt werden, bis hin zu einer aktiveren Manipulation der Targeting von Medikamenten zu einem sehr präzisen Organ oder Ort. Die meisten Medikamente und Therapien werden passives Targeting verwenden, was aufgrund der verbesserten Durchlässigkeit und Retention (EPR-Effekt) bei Tumoren mit großen Mengen an Blutfluss und hohen Mengen an Gefäßlecks immer noch großen Erfolg zeigt. Neben passivem Targeting kann aktives Targeting bei der Verarbeitung der Nanopartikel durch die Befestigung tumorstandortspezifischer Liganden oder nach der Injektion durch Zugabe einer magnetischen Kraft zu den magnetischen Nanopartikeln erfolgen. Dieses Magnetfeld zieht die Nanopartikel aus dem Blutkreislauf in Richtung des betroffenen Bereichs, wodurch die Zeit des Arzneimittels, die im Blut verbringt, verringert und die Dosis für den betroffenen Bereich erhöht wird. Diese unterschiedlichen Verabreichungsmethoden sollten die Verteilung der Nanopartikel nach der Behandlung erheblich beeinflussen, und dieses Experiment zielt darauf ab, sowohl ihre anfängliche Verteilung als auch ihre Verteilung im Laufe der Zeit zu untersuchen.

Aktuelle Methoden der Nanopartikelverteilungsmessung beinhalten in der Regel die Anhaftung von Fluoreszenzpartikeln an den Nanopartikeln. Abhängig von der Konzentration der Nanopartikel, der Größe des Zielbereichs und der Intensität der Fluoreszenz können transluzente Mäuse mit hilfe optischer Bildgebung analysiert werden, während sie noch am Leben sind, um festzustellen, ob sich die Partikel im richtigen Bereich befinden. Post-mortem Fluoreszenz kann auch verwendet werden, um Nanopartikelspiegel in verschiedenen Organen von Mäusen zu bestimmen. Diesen Methoden fehlt jedoch die Auflösung von Nanopartikeln und die Bestätigung, dass sich die Fluoreszenz nicht von den Nanopartikeln gelöst hat.

Die aktuelle Demonstration nutzt die rückgestreute Elektronenmikroskopie (BEM) und die energiedispersive Spektroskopie (EDS) basierende Analyse, um die Bioverteilung von magnetoelektrischen Nanopartikeln (MENs) in Abhängigkeit von ihrer Größe und der Zeit, die in der Körper. Die MENs in der Probe sind Barium- und Titan-Magnetoelektrische Nanopartikel, die durch Injektion in Mausorgane eingeführt und dann passiv auf die Organe gezielt wurden. Die Mäuse wurden bewusstlos gemacht und ihre Organe entfernt und bei 1 Woche, 4 Wochen und 8 Wochen nach der Injektion konserviert. Die Organe: Leber, Milz, Lunge, Nieren und Gehirn, wurden dann mit einer Mikrotom-Maschine geschnitten und mit Probenvorbereitungsmethoden hergestellt, die im Lernvideo "SEM Imaging of Biological Samples" beschrieben sind.  Als Sncanelektronenmikroskopie (SEM) bietet BEM zusammen mit der EDS-Analyse eine hochauflösende Kompositionsanalyse, die es ermöglicht, einzelne Nanopartikel mit einem Durchmesser von bis zu 10 nm zu erkennen. In der Zwischenzeit kann diese Demonstration veranschaulichen, wie verschiedene Detektoren verwendet werden können, um verschiedene Elemente und Partikel in einer Forschungsumgebung zu erkennen, zu bestätigen und abzubilden, und wie sich verschiedene Parameter auf das resultierende Bild auswirken können.

1. Nanopartikel-Injektion und Organentnahme

1. Injizieren Sie Nanopartikel in eine anästhesierte Maus intravenös, um passives Targeting zu ermöglichen.
2. Zu den gewünschten Zeitpunkten, d.h. 1, 4 und 8 Wochen, nach der Injektion, die Mäuse nach den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) human einschläfern.
3. Öffnen Sie die Körperhöhle und entfernen Sie operativ die Organe von Interesse. Die Organe in 10% Phosphat gepuffertes Formalin in einen Polypropylenbehälter legen, bis die Probenvorbereitung.

2. Gewebeprobenvorbereitung

1. Verwenden Sie Zangen, um das Mausgewebe vom Fixativ in Phosphatgepufferte Saline (PBS) zu übertragen. Gestein die Probe für 30 min, ersetzen Sie die PBS alle 10 min.
2. Entfernen Sie das Gewebe und trocknen Sie mit einem Kimwipe. Dann legen Sie es in eine Kunststoffform mit optimaler Schnitttemperaturverbindung (OCT). Über Nacht bei -80 °C lagern.
3. Am nächsten Tag die Probe auf den Kryostat übertragen und die Temperatur auf -23 °C einstellen.
4. Etikettgleitet mit dem Organtyp und der Nanopartikelgröße und legen Sie sie in ein Regal im Kryostat.
5. Bedecken Sie das Kryostatfutter mit OCT und legen Sie die Probe darüber. Senken Sie den Extraktorkolben über die Probe und lassen Sie ihn für 3-5 min ausdemieren.
6. Montieren Sie das Futter auf den Probenhalter und richten Sie es so aus, dass die Klinge direkt über die gefrorene Probe geschnitten werden kann. Bringen Sie die Probe in die Nähe der Klinge für grobe Verkleidung. Stellen Sie die Dicke auf 30 m ein und schneiden Sie mehrere Abschnitte, bis eine gleichmäßig geschnittene Scheibe hergestellt wird.
7. Wechseln Sie zu feiner Verkleidung, indem Sie die Schnittdicke auf 7-8 m verringern. Sammeln Sie einen in Scheiben geschnittenen Abschnitt, indem Sie eine beschriftete Glasrutsche auf die Scheibe drücken. Platzieren Sie zwei Folien auf jeder Folie, und lagern Sie sie in einem Schiebeträger. Bei Raumtemperatur trocknen lassen.
8. Nach dem Trocknen die Proben dehydrieren, indem Sie das Schiebegestell in 50% Ethanol für 3 min tauchen, um OCT zu entfernen. Dann das Rack für 3 min auf 80% Ethanol übertragen, bevor es das Rack in einem 1:1-Verhältnis von kaltem Methanol zu Aceton für 10 min bei -20 °C legt.
9. Entfernen Sie das Schiebegestell und entleeren Sie das überschüssige Lösungsmittel auf einem Papiertuch. Nach 20–30 min die Dias in eine Diabox legen und bis zur Bildgebung bei -20 °C in einem Gefrierschrank aufbewahren.

3. Hochauflösende Bildgebung mit SEM und EDS

1. Bereiten Sie die Probe wie in "SEM Imaging of Biological Samples" beschrieben vor. Dann laden Sie die Probe in das SEM.
2. Schalten Sie das SEM ein, und stellen Sie den Arbeitsabstand auf etwa 5 mm und die Beschleunigungsspannung und den Strahlstrom auf 25 keV ein, was normalerweise zu hoch für eine biologische Probe wäre. Die Probe ist jedoch zur Leitfähigkeit und zum Schutz beschichtet.
3. Beginnen Sie mit der Bildgebung und zoomen Sie auf etwa 1.000-2.000X Vergrößerung, um die Strukturen zu sehen, die die Nanopartikel enthalten würden. Beachten Sie, dass man sie ohne Rückstreuung (BSD) nicht unter einer bestimmten Tiefe unterscheiden kann.
4. Setzen Sie den BSD unter den gleichen Parametern ein und verschieben Sie die Bühne in z-Richtung auf den gleichen Arbeitsabstand wie zuvor.
5. Beginnen Sie mit der Bildgebung bei etwa der gleichen Vergrößerung und überprüfen Sie, ob Sie in der Lage sind, einen hohen Kontrast in Gegenwart von Nanopartikeln zu sehen. Speichern Sie die Bilder.
6. Verwenden Sie verschiedene BSD-Konfigurationen (bei denen sich die Ladungen auf dem Detektor ausrichten), um diejenige auszuwählen, die den höchsten Kontrast für die Nanopartikel anzeigt.
7. Zoom-in auf einem kontrastreichen Bereich, der ein Nanopartikel oder einen Klumpen von Nanopartikeln zeigt.
8. Öffnen Sie die^2. Kamera der Kammer und beobachten Sie, wie Sie den EDS in das System einlegen, indem Sie die Abwärtstaste am SEM-Aufsatz drücken. Sobald der EDS nah ist, aber nicht den BSD oder die Pistole berührt, lassen Sie die Taste los.
9. Öffnen Sie das Aztec-Programm auf dem EDS-Computer (noch am Arbeitsplatz) und erfassen Sie ein Bild vom SEM. Verwenden Sie die "Point and Shoot"-Methode, um auf einen Bereich zu klicken, der sehr dicht an Kontrast- und Nanopartikeln ist.
10. Das EDS zeigt von diesem Punkt an das Spektrum der charakteristischen Röntgenstrahlen. Suchen Sie nach Barium- und Titanspitzen, die im Diagramm identifiziert werden sollen. Dies bestätigt, dass das, was Sie betrachten, in der Tat die Nanopartikel und nicht irgendeine Art von Kontamination sind.
11. Kehren Sie zum Beispiel zurück und verwenden Sie die Atlas-Software, um die Ränder des Organs auf der Folie zu kartieren. Wählen Sie das "Organ"-Protokoll zum Erstellen eines Mosaikbildes des Bereichs aus, und lassen Sie es laufen (dies kann höchstens ein paar Stunden dauern).
12. Sobald das zusammengesetzte Bild von der Software erstellt und genäht wurde, exportieren Sie es als Tif-Datei.
13. Öffnen Sie die Tif-Datei in ImageJ, einer Open-Source-Software, und passen Sie Kontrastschwellenwerte an, um die Bereiche mit sehr hohem Kontrast (d. h. die Nanopartikel) hervorzuheben. Verwenden Sie integrierte Funktionen, um das Volumen von Nanopartikeln mithilfe der im Organprotokoll definierten Pixelgröße zu quantifizieren (sollte etwa 100 nm betragen).
14. Während sich dieses Verfahren nur auf die 1-Wochen-Probe der Mauslunge bezieht, wird dieses Verfahren mit den Proben aus anderen Wochen und anderen Organen wiederholt, um ein Diagramm zu erstellen, das die Verteilung zeigt.
15. Nach der Berechnung der Bioverteilung für jedes Organ für jede Woche zeigen Bioverteilungsdiagramme die Veränderungen in der Bioverteilung und Konzentration von Nanopartikeln im Laufe der 8 Wochen. Diese zeigen die Spitzenkonzentration und geben auch Auskunft darüber, wie lange es dauert, bis die Nanopartikel aus dem Organ entfernt sind.

Die folgenden Bilder veranschaulichen, wie die Bioverteilungsdaten aus den Bildern extrahiert werden können. Der Kontrast der Nanopartikel wird mit Hilfe des BSE-Detektors nachgewiesen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die IN Abbildung 2 dargestellten EDS-Daten zeigen, wo Titan- und Bariumcluster in den mit dem BSE-Detektor gesammelten Bildern kontrastreichen Bereichen entsprechen.

Abbildung 1: Sekundäres Elektronenbild der Lunge (links) und Rückstreuelektronenbild desselben Bereichs (rechts).

Abbildung 2: EDS-Daten, die Titan- und Bariumcluster in der unteren Mitte und am oberen Bildrand zeigen, entsprechend den kontrastreichen Bereichen, die mit dem BSE-Detektor beobachtet wurden.

In einem zusammengesetzten Bild, wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigen die roten Kreise Bereiche mit hohem Kontrast an und deuten auf die Positionen hin, die Nanopartikel enthalten. Das Volumen der weißen Nanopartikelbereiche kann dann über die Größe des Organs selbst berechnet und gemittelt werden. Dies liefert eine Berechnung der Fläche, die von den Nanopartikeln belegt wird. Dann können Daten von mehreren Organen über mehrere Wochen aggregiert werden, um die durchschnittliche Partikelverteilung in einem quadratischen Mikron des Bildes zu zeigen. Diese Daten sind in Abbildung 4 dargestellt, die eine gesamte Abnahme der 30 nm Größe Nanopartikel im Laufe der 8 Wochen zeigt, ein Hinweis auf Clearance. Eine weitere Sache zu beachten ist die Erhöhung der Nanopartikelkonzentration in der Leber nach 4 Wochen. Dies gibt Informationen darüber, wie der Körper die Nanopartikel verarbeitet, und die große Migration von Partikeln in die Leber zeigen, dass der Körper die Nanopartikel als Toxine verarbeiten kann. Dies ist eine wichtige Information, die Sie bei der Entwicklung und Prüfung von Nanopartikeln in vivo kennen sollten.

In ähnlicher Weise sind daten über die Organverteilung von Partikeln unterschiedlicher Größe in Abbildung 5 dargestellt. Dieses Diagramm zeigt, wie die sich verändernde Größe der Nanopartikel die Gesamtaufnahme in zellender der Nanopartikel erhöhen oder die Clearance-Rate erhöhen kann.

Abbildung 3: Abschnitte des zusammengesetzten Bildes, die mit der Atlas-Software erstellt wurden.

Abbildung 4: Bioverteilung von 30 nm Nanopartikeln in Lunge, Leber, Milz und Niere nach Injektion in eine Maus.

Abbildung 5: Bioverteilung von Nanopartikeln unterschiedlicher Größe im Laufe der Zeit.

Nanopartikel werden häufig in der biomedizinischen Ingenieurforschung eingesetzt und haben Anwendungen als bildgebende, diagnostische und therapeutische Wirkstoffe. So werden beispielsweise Nanopartikel für den Einsatz in der Impfstoffabgabe entwickelt. Durch die Verkapselung des Impfstoffs in Nanopartikeln werden Impfstoffkomponenten vor Abbau geschützt und stimulieren die maximale Immunantwort.

In Magnetresonanztomographieanwendungen werden metallische Nanopartikel häufig als Kontrastmittel zur Visualisierung von Gewebestruktur und -funktion eingesetzt. Sie sind nützliche diagnostische Sonden bei der Detektion von artherosklerotischen Plaques.

Nanopartikel, die diagnostische und therapeutische Fähigkeiten integrieren, werden Theranostik genannt. Dort detektieren Nanopartikel gleichzeitig Tumoren im Frühstadium und liefern Chemotherapeutika.

Dieses Experiment zeigte, wie SEM verwendet werden kann, um die Bioverteilung von Nanopartikeln zu berechnen, die im Laufe der Zeit in den Körper injiziert werden. Dieses Experiment kann auf andere Nanopartikelproben oder Zellkulturen repliziert werden, die Nanopartikel haben, um Konzentrationen, Zelldurchdringung oder Clearance von Nanopartikeln zu analysieren.

Diese Demonstration konzentrierte sich auf die Untersuchung und Messung der Bioverteilung von Nanopartikeln mit SEM. Die Ergebnisse solcher Messungen können in vielen Bereichen wichtig sein. Pharmaunternehmen und Forschungseinrichtungen können diese Studien für die Arzneimittelentwicklung und Kontrastmittelforschung nutzen.

Materialliste

1. Hadjikhani, Ali. "Nanofabrication and Spectroscopy of Magnetic Nanostructures Using a Focused Ion Beam." (2016).