使用光学和共聚焦显微镜成像生物样本

光学显微镜使用至少两个放大元件功能。主透镜（称为目标）确定总放大倍率，而称为目镜的辅助镜头聚焦虚拟图像以进行查看。总放大倍数是通过乘以两个镜头的放大倍数来确定的。通过这些光源对光的对焦，加上从灯到样品的光对焦，为放大倍率和灯灯都在同一点相遇，从而给出图像的最佳分辨率。下图演示了标本的焦点平面如何通过不同的透镜产生。由于照明面积较大，焦平面外的对象将具有来自样品其他部分的光束干扰。这会导致图像中模糊。因此，要聚焦于高度差异很大的样本的不同 z 位置，必须将 z 方向切片移动到焦平面中。

图 1.光学显微镜透镜和焦平面。

数字显微镜与光学微镜的原理相同，只不过它不依赖于目镜。这是一台装有数码相机的光学显微镜。数码相机充当探测器，图像显示在计算机监视器上。这些显微镜非常适合在研发（研发）、制造和检测、质量控制和保证 （QC/QA） 以及故障分析 （FA） 期间分析和记录样品。他们通常提供允许用户分析示例图像的软件。图 2 显示了典型的数字显微镜设置。

图 2.数字显微镜的主要部件。

该系统的主要组件包括:

1. 光学引擎:包含用于放大图像的图像采集传感器和镜头。
2. 目的:从样品中获取和聚焦光线。三个不同的目标可用于各种图像采集任务。
3. 扫描阶段:样品放置位置。
4. 显微镜支架:为光学引擎和扫描级提供支持。还控制附加组件与计算机之间的通信。
5. 计算机:支持用户软件，允许在监视器上查看图像。
6. 控制器:使用多点触控手势和触摸感应的上下文特定图标控制显微镜和工作流程。控制旋钮控制变焦、对焦和显微镜图像位置。

共聚焦显微镜或共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 是具有更高的光学分辨率和对比度的显微镜。共聚焦意味着"具有相同的焦点"。对象及其图像为"共聚焦"。

图 3.模糊及其对图像的影响。左图显示边缘模糊的焦点外图像。右图演示了在成像对焦样本时穿过镜头的光路径。

与一般光学显微镜照亮和成像整个样品的视图相反，共聚焦显微镜利用样品级和探测器之间的针孔，以便一次只聚焦一个狭窄的深度水平的较小光束。因此，样本的唯一可见区域是焦点。然后，共聚焦显微镜用这种更聚焦的光束（或激光）扫描样品表面。然后，数据被组装成一个 2D 图像，其分辨率优于经典光学显微镜。此外，由于光线集中在非常狭窄的高度范围内，因此当 Z 方向移动时，用户可以将不同的平面置于焦点上。通过图像处理技术和自动化软件共聚焦显微镜辅助多平面聚焦复合图像的三维重建。

共聚焦显微镜能够通过图像处理提供以前在光学显微镜中不可用的样品的 Z 方向数据。例如，在下面描述的演示中，用户可以定义样本的上部和下部焦点范围，然后不仅开发显示 z 方向测量值的热图，而且还创建一个复合图像，在重点。这些功能在获取有关示例的三维数据时特别有用。

图 4.共聚焦显微镜的主要成分。

共聚焦显微镜的主要组件包括:

1. 带精细 Z 驱动器和 400 万像素摄像头的扫描头，使用粗 Z 驱动器站立
2. 目标:2.5x/5x/10x/20x/50x/100x
3. 阶段:扫描阶段和固定阶段
4. 计算机系统:PC系统成像软件
5. 控制器: x， y， z 运动

下图概述了使用共聚焦显微镜小鼠大脑可获得的结果。它们显示了如何获得不同级别的信息，以及结果的地形图如何显示样本的高度。

图5:50倍放大倍率的共聚焦图像，显示被分割的小鼠大脑。左侧的图像是一个复合图像，可在断层扫描过程中拍摄所有对焦平面，并创建一个高分辨率和深度聚焦的图像。右侧的图像显示示例的地形图。

图6:作为共聚焦显微镜3D应用的一个比较具有代表性的例子，对塑料孔进行了成像和分析。原始地形图位于左侧，3D 重建位于右侧。

图 7: 显示了 ConfoMap 软件分析的范围，用于从 3D 重建中观察配置文件。显示了振幅参数、粗糙度轮廓、曲线表征。

下图概述了在同一小鼠大脑切片上使用数字光学显微镜可以获得的结果。数字显微镜提供更大的视野，但分辨率较低的图像从共聚焦显微镜，这是理想的看较大的成分或生物结构。该软件具有测量样品的有用分析工具。

图8:显示整个器官切片的概述图像。

图9:缩小被分割的鼠标大脑的图像。这里有一个300微米的视野，通过混合同轴和环形照明以及电子图像稳定获得。

图10:演示数字光学显微镜的测量能力。样品的直径在左侧测量，右侧显示用于计算切片小鼠大脑内部面积的用户定义的轮廓。这些工具在分析生物样本时非常有用，生物样本的边可能与预定义的形状不同。

在本演示中，优化了光学和共聚焦显微镜的对焦深度、视野以及最大分辨率和放大倍率，以观察生物样品。本演示旨在帮助学员决定哪种显微镜模块最适合特定应用。这两种显微镜模式在分析生物样品时具有优点，易于制备和高分辨率复合图像。

光学和共聚焦显微镜的应用意义深远。由于样品制备有限，集成运动平面和使用超采样光技术的能力，这些工具能够从大多数数据集获取信息。显微镜在成像活细胞（如用荧光处理的细胞）时一直很受欢迎，但应用范围从生物医学设备的成像表面到在植入体内之前检测缺陷和粗糙度。共聚焦和光学显微镜是成像生物样品的现行标准。

最后，共聚焦显微镜通过荧光技术提供了改进的成像技术。样品中的荧光团的寿命有限，在暴露于高光照下时，可以进行光漂白。在传统的光显微镜中，整个样品在成像过程中被照亮，从而快速进行光漂白。然而，由于只有一小部分样品同时通过共聚焦显微镜进行照明，因此荧光团的寿命更长，与光漂白相关的挑战也较少。