Aseptische Techniken in den Umweltwissenschaften

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autor: Luisa Ikner

Aseptischer Technik ist eine grundlegende Fähigkeit, die weit verbreitet im Bereich der Umweltmikrobiologie, die ein ausgewogenes Verhältnis von Achtsamkeit und Praxis im Labor erfordert. Ordnungsgemäße Verwendung dieser Technik reduziert die Wahrscheinlichkeit einer bakteriellen oder Pilzinfektionen Kontamination von Reagenzien, Kultur, Medien und Umweltproben. Aseptische Technik ist auch entscheidend für die Integrität der Daten zu gewährleisten und pflegen die Reinheit des Kultur-Bibliotheken, die sehr selten und schwer zu Kultur Isolate bestehen kann. Kontaminationsquellen in der Laborumgebung gehören luftgetragene Mikroorganismen (einschließlich der Einhaltung von Staub und Fusseln Partikel), Mikroben zu präsentieren, auf den Labor-Bank-Arbeitsbereich oder sterilisierte Gläser oder Ausrüstung und Mikroben aus dem Körper und Haare des Forschers übertragen. Aseptische Technik ist auch eine Sicherheitsmaßnahme, die senkt das Potenzial für die Übertragung von Mikroorganismen an Forscher, was besonders wichtig ist, bei der Arbeit mit Krankheitserregern.

Das Ziel der aseptische Technik ist zu schaffen und aufrechtzuerhalten eine sterile Arbeitsumgebung, Geräte und Reagenzien, um Verunreinigungen von biologischen Proben zu minimieren. Um dies zu tun, die Arbeitsfläche und einige Tools mit Chemikalien wie 70 % Ethanol desinfiziert werden können und Bleichmittel verdünnen. Es ist auch wichtig für den Forscher, persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie ein Kittel, Handschuhe, don und Schutzbrille.

Medien und Reagenzien sterilisierbar mit Filter Sterilisation Apparate mit 0,22-µm-Filter, die effektiv die meisten Mikroorganismen wie Bakterien zu entfernen. Alternativ können viele Reagenzien und Geräte auch bei hoher Hitze sterilisiert werden. Beispielsweise können Mikroben auf oder in Werkzeuge, Glaswaren und flüssigen Medien Hitze getötet in einem Autoklaven werden die eine Kammer, die Inhalte über Exposition gegenüber hohen Temperaturen unter Druck stehende Dampf sterilisiert. Darüber hinaus können einige Tools Hitze sterilisiert mit einer Flamme, wie dem Bunsenbrenner.

Die Verwendung einer Flamme-Quelle ist auch einer der am häufigsten verwendeten Möglichkeiten, um eine aseptische Arbeitsumgebung zu schaffen. Die Hitze der Flamme verursacht Luftkonvektion, einen Aufwind, der Verunreinigungen in der Luft von der Nähe des Brenners anhebt, und schaffen einen "sterilen Bereich" in der aseptischen experimentelles Arbeiten durchzuführen.

1. Vorbereitung für aseptische arbeiten

1. Zu erhalten und PPE Folgendes gelten: Laborkittel, Latex oder Nitril-Handschuhe (ohne Risse oder Löcher) und Schutzbrille (Abbildung 1). Binden Sie für Sicherheit bei der Verwendung von offenen Flammen wieder lange Haare.
   
   Abbildung 1: PPE: einen Laborkittel, Latex-Handschuhe und Schutzbrille.
2. Ein zweiter wichtiger Aspekt der aseptische Technik ist die richtige Sterilisation und Lagerung von Medien/Reagenzien im Labor verwendet werden. Bereiten Sie flüssige Brühe Medium (z.B. tryptic Soja Brühe) und Agar-basierte Medien (z. B.R2A) durch wiegen die richtige Menge an getrockneten Basispulver, die die entsprechende Menge an deionisiertes Wasser hinzugefügt wird.
3. Lösen Sie für das Medium Brühe des Pulvers auf einer heißen Platte mit schwacher Hitze angewendet auf, und verzichten Sie der Flüssigkeit entweder in 100 mL Volumen in Glaskolben Schraubverschluss oder in 10 mL Volumen in Glasröhren Schraubverschluss Test. Mit einer magnetischen rühren, rühren Sie die Agarose-Medium auf der heißen Platte Rührer, bis das Pulver vollständig aufgelöst ist.
4. Autoklaven-Band für die Container und Autoklaven die Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers (z.B.20 min bei 121 ° C) gelten (Abbildungen 2 und 3). Beachten Sie, dass die Farbe der Streifen auf dem Autoklav-Band von weiß (Pre-Autoklav) bis schwarz (Post-Autoklav) ändern sollte. Obwohl die Farbe zu ändern in der Regel zeigt, dass die Sterilisation erfolgreich war, prüft Sterilität mit Spore-Streifen-Kits durchgeführt werden kann, um zu überprüfen, den Autoklavieren Prozess.
   
   Abbildung 2: Autoklav Band auf Material angewendet wird.
   
   Abbildung 3: Beachten Sie die farbliche Veränderung der Streifen auf dem Autoklaven Band von weiß (Pre-Autoklav) bis schwarz (Post-Autoklav).
5. Die flüssigen Brühen auf Raumtemperatur, abkühlen und dann bei Raumtemperatur lagern oder bei 4 ° c gekühlt
6. Cool das Agarose-Medium indem man den Behälter in ein Wasserbad legen auf ~ 50 ° C. Sobald Sie abgekühlt, können die Medien in sterile Petrischalen gegossen werden. Können Sie Mittel-und abkühlen und erstarren, dann für die Lagerung bei Temperaturen, die vom Hersteller angegebenen konsolidieren.
7. Es gibt mehrere Sorten von Kulturmedien, die autoklaviert werden können, da die hohen Temperaturen kritische Inhaltsstoffe beeinträchtigen. Sterilisieren diese Filter-Sterilisation mit einem Vakuumfiltration System mit 0,22 µm Filter, gefolgt von Lagerung bei geeigneten Temperaturen erfordern.
8. Desinfizieren Sie vor arbeiten an der Tischplatte die Oberfläche mit einer geeigneten Lösung (z.B. 500 ppm Bleichmittel). Dies senkt das Risiko von Verunreinigungen von der Arbeitsfläche auf Kulturen und sterilen Medien übertragen.
9. Schalten Sie um einem sterilen Bereich zu etablieren, ein Bunsenbrenner. Die Flamme am besten geeignet für Sterilisation Metall Schleifen impfen ist eine intensive blaue Flamme, mit einem endgültigen blauen Kegel in der Mitte (Abbildung 4) beobachtet.
   
   Abbildung 4: Eine Übertragung von Keimen von einer Petri-Platte anzeigen Wachstum von einem kultivierten isolieren zu einer anderen UN-beimpften Petri-Platte mit einem Wachstum auf Agar-Basis-Medium.
10. Gehen Sie langsam die Impfkeimen Schleife durch das heißeste Teil der Flamme (Spitze des Kegels blau). Die Schleife sollte zum Zwecke der Sterilisation heiß rot.

2. bakterielle Transfers: Von Petri Petri Platte Platte

1. Ein Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Petri-Platte anzeigen Wachstum einer kultivierten isolieren, eine andere, sterile Petri-Platte mit einem Wachstum auf Agar-Basis-Medium.
2. Um zu Beginn öffnen Sie leicht, enthält die reinen Bakterienkultur Petri-Platte, und klopfen Sie leicht die heissen, sterilisierte Impfkeimen Schleife auf die Agar-Oberfläche.
3. Rufen Sie einer isolierten Kolonie von der Oberfläche der Platte mit der gekühlten Impfkeimen Schlaufe ab, und schließen Sie die Petri-Platte.
4. Führen Sie eine Ader für die Isolierung mit einer frischen Petri-Platte mit Nährmedium mit den Deckel leicht geöffnet.
5. Sterilisieren Sie für jeden Teil des Streifens Isolierung (insgesamt pro Platte 3) Flamme-die Impfkeimen Schleife nur vor Gebrauch. Auch, Sterilisieren Sie Flamme-die Schleife nur, nachdem die letzte Streifen durchgeführt wird, um die Verunreinigung von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, die möglicherweise später verwenden oder kommen in Kontakt mit den Impfkeimen Schleifen zu verhindern.
6. Legen Sie die gestreiften Platten in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.

3. bakterielle Transfers: Von Bouillonkultur Petri Platte

1. Ein zweites Szenario der Übertragung von Bakterien ist eine Bouillonkultur Wachstum, wie in der Regel durch Trübung, mit einer sterilen Petri-Platte mit Wachstumsmedium ausstellen.
2. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben), enthält die reinen Bakterienkultur, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters 2-3 X durch die heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, legen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Tischplatte.
3. Setzen Sie vorsichtig die sterilisierte Impfkeimen Schleife in die Tube/Flasche, und drücken Sie leicht gegen die Seite des Behälters vor dem Einlegen in die Bouillonkultur abkühlen lassen.
4. Entfernen einer Impföse Bouillonkultur (Abbildung 5), und die Verschlusskappe wieder sofort.
   
   Abbildung 5: Eine Impföse Bouillonkultur.
5. Führen Sie eine Ader für die Isolierung mit einer frischen Petri-Platte mit Nährmedium mit den Deckel leicht geöffnet.
6. Sterilisieren Sie für jeden Teil des Streifens (insgesamt pro Platte 3) Flamme-die Impfkeimen Schleife nur vor Gebrauch. Auch, Sterilisieren Sie Flamme-die Schleife nur, nachdem die letzte Streifen durchgeführt wird, um zu verhindern, dass Verunreinigungen von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, das später die Impfkeimen Schleifen verwenden dürfen.
7. Legen Sie die gestreiften Platten zur Isolierung in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.

4. bakterielle Transfers: Von Petri Platte mit Wachstum, sterilen flüssigen Medium

1. Ein drittes Szenario der Übertragung von Bakterien ist von einer Petri-Platte mit einem isolierten Kultur Streifen, eine Tube/Flasche mit steriler Flüssigkeit Wachstumsmedium.
2. Leicht öffnen Sie die Petri-Platte mit der reinen Bakterienkultur und Abkühlen der heißen Impfkeimen Schleife durch Antippen sanft auf die Agar-Oberfläche.
3. Rufen Sie einer isolierten Kolonie von der Oberfläche der Platte mit der gekühlten Impfkeimen Schlaufe ab, und schließen Sie die Petri-Platte.
4. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben) mit der sterilen Flüssigkeit Wachstumsmedium, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters 2 bis 3 Mal durch die heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, stellen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Benchtop.
5. Setzen Sie die extrahierte Kolonie vorsichtig in das flüssige Brühe Medium, und schütteln Sie sanft die Schleife um die Bakterien zu befreien. Sofort die Verschlusskappe.
6. Sterilisieren Sie Flamme-Impfkeimen Schleife zur Vermeidung von Kontamination von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, das später die Impfkeimen Schleifen verwenden dürfen.
7. Stelle die Flasche in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.
8. Entfernen Sie die Flasche aus Inkubation am nächsten Tag. Führen Sie eine Verdünnungsreihe um die Kultur aufgelistet werden.
9. Platte die Verdünnungen aus der Serie auf Nährmedien Agarose, und die Platten über Nacht inkubieren.
10. Entfernen Sie am nächsten Tag die Platten, und beobachten Sie für jegliche Kontamination.

(5) bakterielle Transfers: Von Bouillonkultur, Sterile flüssige Wachstumsmedium

1. Eine vierte Szenario der Übertragung von Bakterien ist eine Bouillonkultur Wachstum, eine Tube/Flasche mit steriler Flüssigkeit Wachstumsmedium ausstellen.
2. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben), enthält die reinen Bakterienkultur, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters zweimal durch das heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, legen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Tischplatte.
3. Setzen Sie vorsichtig die Impfkeimen Schleife in die Tube/Flasche, und drücken Sie leicht gegen die Seite des Behälters vor dem Einlegen in die Bouillonkultur abkühlen lassen.
4. Entfernen einer Impföse Bouillonkultur und sofort die Verschlusskappe.
5. Entfernen Sie die Kappe aus dem Reagenzglas (oder Kolben) mit der sterilen Flüssigkeit Wachstumsmedium, und übergeben Sie die Öffnung des Behälters zweimal durch das heißeste Teil der Flamme. Um Verunreinigungen zu vermeiden, legen Sie nicht die Kappe nach unten auf die Tischplatte.
6. Setzen Sie vorsichtig den extrahierten Impföse in das sterile flüssige Brühe Medium, und schütteln Sie sanft die Schleife um die Bakterien zu befreien. Sofort die Verschlusskappe.
7. Sterilisieren Sie Flamme-Impfkeimen Schleife (Abbildung 6) zur Vermeidung von Kontamination von der Arbeitsfläche und als Gegenleistung für andere im Labor, das später die Impfkeimen Schleifen verwenden dürfen.
   
   Abbildung 6: Impfen Schleife drehen rot heiß und mit dem Bunsenbrenner sterilisiert werden.
8. Stelle die Flasche in einem Inkubator für Wachstum über Nacht.
9. Entfernen Sie die Flasche aus Inkubation am nächsten Tag. Führen Sie eine Verdünnungsreihe um die Kultur aufgelistet werden.
10. Platte die Verdünnungen aus der Serie auf Nährmedien Agarose, und die Platten über Nacht inkubieren.
11. Entfernen Sie am nächsten Tag die Platten, und beobachten Sie für jegliche Kontamination.

Das Ergebnis des Verfahrens zeigt richtige aseptische Technik und schlechte aseptische Technik. Abbildung 7 zeigt die Verunreinigungen, die aus armen aseptische Technik entstehen können, wenn Agarose Platten Gießen (top-Platte: steriles Medium; Unterplatten: verunreinigten Medien).

Abbildung 7: Verunreinigungen, die aus armen aseptische Technik entstehen können, wenn Agarose Platten gießen. Top-Platte: steriles Medium; Teller unten: verunreinigten Medien.

Anders als die Anwendung Bunsenbrenner, aseptische Arbeitsumgebungen auch pflegbar in spezialisierten Arbeitsstationen bekannt als Laminar-Flow Hauben, welche Nutzung Luftstrom und filtern, um Sterilität zu halten gerichtet.

Ordnungsgemäße Verwendung der aseptische Technik ist entscheidend für ökologische Mikrobiologen, bei der Probenahme im Feld und im Labor, bei der Arbeit mit Medien, Reagenzien, und kultiviert Isolate.  Armer aseptische Technik im Feld kann die Übertragung von Mikroorganismen von der Techniker auf kritische Umweltproben sowie Cross-Kontamination von Mikroben aus einer Probe zum anderen führen. Solche Ereignisse sind von Bedeutung, z. B. in mikrobiellen Ökologie Studien zu identifizieren und bakterielle und pilzliche Populationen, die möglicherweise vorhanden in einem gegebenen Biom zu vergleichen. Kontamination der Proben kann zu einem Verlust der Integrität der Daten führen. Aseptischer Technik ist auch entscheidend für die Aufrechterhaltung der Labor-Kultur-Isolate aus Bereich Probenahme oder aus etablierten mikrobielle und Zelle-Kultur-Repositories. Die Zeit, Arbeit und finanzielle Kosten, die von einem Labor in dem Bemühen, "clean-Up" oder kontaminierten Kulturen, besonders selten zu ersetzen könnte Isolate von einzigartigen Umgebungen, sehr hoch und kostspielig, da einige Isolate unersetzlich sein können.