Kultivierung und Auflisten von Bakterien aus Bodenproben

Quelle: Labors von Dr. Ian Pfeffer und Dr. Charles Gerba - Arizona University
Demonstrierende Autoren: Bradley Schmitz und Luisa Ikner

Oberböden sind eine heterogene Mischung von anorganischen und organischen Partikeln, die sekundäre Form Aggregate kombinieren. Innerhalb und zwischen den Aggregaten sind Hohlräume oder Poren, die visuell beide enthalten Luft und Wasser. Diese Bedingungen stellen ein ideales Ökosystem für Bakterien, so dass alle Böden große Populationen von Bakterien, in der Regel mehr als 1 Million pro Gramm Boden enthalten.

Bakterien sind die einfachsten von Mikroorganismen, bekannt als Prokaryoten. Innerhalb dieser prokaryotische Gruppe sind die faserigen Mikroben Aktinomyceten genannt. Aktinomyceten sind tatsächlich Bakterien, aber sie gelten häufig als eine einzigartige Gruppe innerhalb der Klassifikation von Bakterien wegen ihrer faserigen Struktur besteht aus mehrere Zellen aneinandergereiht, Form Hyphen. Dieses Experiment verwendet Glycerin Fall Medien, die auswählen für gelangte Kolonien, während Verdünnung und Beschichtung. Aktinomyceten sind in der Regel etwa 10 % der gesamten Bakterienpopulation. Bakterien und Actinomyceten sind in jeder Umgebung auf der Erde gefunden, aber die Fülle und Vielfalt dieser Mikroben im Boden ist beispiellos. Diese Mikroben sind auch Voraussetzung für menschliches Leben und beeinflussen, was die Leute Essen, trinken, atmen oder berühren. Darüber hinaus gibt es Bakterienarten, die Menschen infizieren und Krankheiten verursachen können, und gibt es Bakterien, die Naturprodukte, die Heilung von Menschen erzeugen können. Aktinomyceten sind besonders wichtig für die Herstellung von Antibiotika wie Streptomycin. Bakterien sind entscheidend für die Nährstoff Radfahren, Pflanzenwachstum und Abbau der organischen Verunreinigungen.

Bakterien sind sehr unterschiedlich in Bezug auf die Anzahl der Arten, die teilweise im Boden gefunden werden können, da sie physiologisch und metabolisch vielfältig sind. Bakterien können heterotrophen, was bedeutet, dass sie organische Verbindungen wie Glucose, für Nahrung und Energie, nutzen oder autotroph, was bedeutet, dass sie anorganische Verbindungen, wie z. B. elementarem Schwefel, nach Nahrungsmitteln und Energie zu nutzen. Sie können auch aerobic, Verwendung von Sauerstoff für die Atmung, oder anaerob, Nutzung kombiniert werden Formen des Sauerstoffs wie Nitrat oder Sulfat, zum aufatmen. Manche Bakterien können Sauerstoff oder kombinierte Formen von Sauerstoff und sind bekannt als fakultative Anaerobier.

Eine Möglichkeit, die Anzahl der Bakterien in einer Bodenprobe aufzuzählen ist Verdünnung und Plattieren Methodik zu nutzen. Diese Methode nutzt Agar als Medium für Bakterienwachstum, ein Prozess bezeichnet, "kultivierbarer Technologie." Weil die überwiegende Zahl der Bakterien in Böden wird eine kleine Probe des Bodens im Wasser vor als auf Agar in einer Petri-Platte vergoldet seriell verdünnt. In der Regel ist eine kleine Menge des Bodens in 0,1 bis 1 mL der Suspension verdünnt Boden enthaltenen "über die Oberfläche der Agar-Platte verteilen". Die Platten enthalten Agar, die geschmolzenen bei heiß ist, aber solide nach dem Abkühlen. Neben dem Agar werden Nährstoffe, wie Pepton Hefe oder ein Produkt im Handel erhältlich als R₂A, das Medium, um das Wachstum von heterotrophen Bakterien ermöglichen hinzugefügt.

Verdünnung und Beschichtung ist eine relativ einfache und kostengünstige Technologie für die Enumeration von Bodenbakterien. Es gibt jedoch einige Nachteile, die Technik. Einige allgemeine Fehler und Annahmen, die Verdünnung und Beschichtung Assays zugeordnet sind wie folgt: Es wird davon ausgegangen, dass jeder einzelne Bodenbakterium Anlass zu einer Kolonie gibt, aber in Wirklichkeit kann eine Kolonie ein Büschel von Zellen, was zu einer Unterschätzung der wahren kultivierbarer Graf entspringen. Während serielle Verdünnung des Bodens können Bodenpartikel sich (Sturz auf den Boden), absetzen, damit der wahre Aliquote des Bodens nicht in die nächste Verdünnung übergeben wird. Viele Bodenmikroben sind lebensfähig, aber nicht kultivierbare. Langsamere wachsende Bakterien führen nicht sichtbaren Kolonien innerhalb einer angemessenen Zeit (1-2 Wochen).

Auch anaerobe Bakterien wachsen nicht unter aeroben Bedingungen, und Bakterien, die wachsen werden für durch die Nährstoffe hinzugefügt, um das Medium ausgewählt. Somit wählt R₂A für Heterotrophe Bakterien während elementarem Schwefel für autotroph Schwefel Oxidationsmitteln wählt. Insgesamt wird es geschätzt, dass nur 0,1 bis 1 % aller Boden-Bakterien kultiviert werden können. Daher, Verdünnung und Beschichtung von Böden Bakterien nur entfallen kultivierbarer Bakterien und unterschätzt die wahre tragfähige Boden Bevölkerung um ein bis zwei Größenordnungen. Abbildung 1zeigt ein Beispiel der heterotrophen Bakterienkolonien, die aus Boden Verdünnung und Beschichtung geführt. Beachten Sie, dass etwa 1 Million bakterielle Zellen für eine Kolonie mit dem bloßen Auge sichtbar sind.

Dieses Experiment zeigt die Verdünnung und Ausbreitung plating-Methode verwendet, um die Anzahl der Bakterien innerhalb einer Bodenprobe aufzulisten. Insbesondere werden zwei Medien verwendet: ausgelegt für alle Bakterien, und andere, die für Aktinomyceten auswählt. Sobald die Bakterienkolonien auf den Agarplatten gewachsen sind, isolieren Sie die Reinkulturen von ausgewählten Kolonien mit einer Streifen-Platte-Technik. Diese Reinkulturen können dann weiter analysiert und bestimmte Merkmale und Funktionen gekennzeichnet.

Abbildung 1:  Heterotrophe Kolonien auf eine R-₂eine Agarplatte. Eine Reihe von diskreten Kolonien mit vielfältigen Morphologie entstehen nach der Verdünnung und Beschichtung aus dem Boden. Erlaubnis für die Verwendung von Academic Press gewährt.

1. Vorbereitung des Bodens Verdünnungen

1. Um den Vorgang zu starten, 10 g Bodenprobe Abwiegen und 95 mL entionisiertem Wasser hinzufügen. Die Suspension gut schütteln, und als "A" zu kennzeichnen.
2. Bevor der Boden absetzt, 1 mL der Suspension mit einer sterilen Pipette entfernen und überträgt es auf 9 mL deionisiertes Wasser leer. Vortex gründlich, und Label als "B".
3. Diese Verdünnungsschritt dreimal wiederholen, jeweils mit 1 mL der vorherigen Suspension und eine 9-mL entionisiertem Wasser leer. Beschriften Sie diese nacheinander, wie Rohre, C, D und E. Dies führt in Verdünnungsreihen 10^-1 bis 10^-5 Gramm Erde pro mL

2. Ausbreitung Platten für Bakterienkultur

1. Um bakterielle Kolonien wachsen, nehmen Sie drei vorbereiteten Pepton-Hefe Agarplatten und Label als C, D und E. Vortex Proben C, D und E und Pipette 0,1 mL auf jeder Platte. Dies erhöht die Verdünnung Wert weiter, um den Faktor zehn (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Tauchen Sie als nächstes eine Glas-Streuer in Ethanol. Legen Sie die Streuer in eine Flamme für ein paar Sekunden zu entzünden und das Ethanol verbrennt. Dies wird den Streuer sterilisieren.
3. Den Streuer über die erste Platte zu halten, bis die Flamme erloschen ist. Öffnen Sie die Platte schnell, halten den Deckel in der Nähe. Tippen Sie auf den Streuer zu Agar entfernt das Inokulum (Inokulum = Zellen verwendet, um eine Kultur zu beginnen) abkühlen lassen und dann die Tropfen des Inokulums um die Oberfläche des Nährbodens zu verbreiten, bis Spuren der freien Flüssigkeit verschwinden. Die Platte Deckel.
4. Re Flamme den Streuer und wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Platte schnell arbeiten um nicht verunreinigen das Agar mit zerstreute Organismen
5. 1 Woche inkubieren Sie die Bakterien-Platten bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Platten während der Inkubation, Tropfen Feuchtigkeit durch Kondensation der Luftfeuchtigkeit auf die Agar-Oberfläche fallen zu verhindern invertiert werden.

3. machen Platten für Aktinomyceten verbreiten

1. Zum wachsen Aktinomyceten, nehmen drei vorbereiteten Glycerin-Kasein-Platten und beschriften Sie sie als B, C und D. unter Verwendung der zuvor gezeigten Techniken verbreiten Sie Platte 0,1 mL aus Suspensionen, B, C und D. Die niedrigeren Verdünnungen werden verwendet, da Actinomyceten in der Regel als 1/10^th von der Bakterienpopulation vorhanden sind (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Inkubieren Sie die gelangte Platten (invertiert) bei Raumtemperatur für 2 Wochen.

4. bakterielle und gelangte zählt

1. Prüfen Sie nach der Inkubation aller Bakterien Platten sorgfältig, und beachten Sie die Unterschiede in Form und Koloniegröße. Wenn auf Agar gewachsen, produzieren Bakterien schleimige Kolonien von farblos bis leuchtend Orange, gelb oder Pink. Im Gegensatz dazu gelangte Kolonien sind kalkig, feste, ledrige, und bricht unter dem Druck, wo andere Bakterienkolonien verschmiert werden. Dadurch können Kolonien durch Berührung mit einer sterilen Schleife unterschieden werden.
2. Zählen Sie und erfassen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien, einschließlich alle Actinomyceten. Zählen Sie nur Platten mit 30-200 Kolonien pro Platte.

(5) Isolierung von Reinkulturen

1. Wählen Sie eine der Platten individuelle Bakterienkolonien. Weitere Kolonien können ausgewählt werden, ist besonders interessant im Boden. Verwenden Sie eine hohe Verdünnung Platte, da es dazu neigt, reine Kolonien haben, die auch getrennt sind. Wählen Sie nur die Kolonien, die aus den benachbarten Kolonien gut getrennt sind und Aussehen morphologisch voneinander.
2. Sterilisieren Sie die Schleife durch Eintauchen in Alkohol und brennen es. Schnelles Öffnen Sie der Petrischale von Interesse, und berühren Sie die Schleife zu einem bloßen Punkt im Agar es abkühlen. Entfernen Sie dann eine kleine Menge einer Kolonie von Interesse auf die Schleife.
3. Eine Hefe Pepton-Platte machen einen Streifen ein paar Zentimeter lange auf einer Seite. Sterilisieren Sie und wieder abkühlen lassen Sie, dann machen Sie eine Ader, die den ersten Streifen nur auf dem ersten Pass überquert. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zweimal auf die gleiche Weise. Diese Schlieren "Verdünnung" ergibt sich in den Zellen auf der Schleife von einander getrennt zu sein. Legen Sie die Platte in einen dunklen Bereich für zwei Wochen bei Raumtemperatur inkubieren.

Eine 10-g-Probe des Bodens mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 20 % auf einer trockenen Gewicht-Basis ist für tragfähige kultivierbarer Bakterien über Verdünnung und Galvanik Techniken analysiert. Die Verdünnungen erfolgten in Tabelle 1dargestellt. 1 mL der Lösung E ist Gießen-plattiert auf einem geeigneten Medium und führt zu 200 Bakterienkolonien.

Aber für 10 g für feuchten Boden,

Daher

Tabelle 1: Verdünnung und Beschichtung der Proben.

Es gibt zwei grundlegende Anwendungen der Verdünnung und Beschichtung von Bodenbakterien. Die erste Anwendung ist die Aufzählung der kultivierbarer Bakterien innerhalb eines bestimmten Bodens. Die Quantifizierung der Anzahl der Bodenbakterien gibt Aufschluss über Bodengesundheit. Zum Beispiel, wenn es gibt 10⁶ bis 10⁸ kultivierbarer Bakterien pro Gramm Boden, würde dies als eine gesunde Anzahl. A Nummer weniger als 10⁶ pro Gramm zeigt ärmeren Bodengesundheit, die möglicherweise wegen des Mangels an Nährstoffen wie in niedrigen organischen Substanz Böden; abiotischem Stress auferlegt durch extreme Boden pH-Werten (pH < 5 oder > 8); oder Toxizität von organischen oder anorganischen anthropogenen Verunreinigungen verhängt.

Die zweite wichtige Anwendung ist die Visualisierung und Isolierung von Reinkulturen von Bakterien. Die Reinkulturen können anschließend gekennzeichnet und für spezifische Eigenschaften, die in medizinischen oder ökologische Anwendungen nützlich sein können ausgewertet werden. Beispiele hierfür sind: Antibiotika-Produktion; biologischer Abbau giftiger organischer Stoffe; oder speziellen Rhizobien nützlich für Stickstoff-Fixierung durch Hülsenfrüchte, wie Erbsen oder Bohnen.