鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用的

果蝇是著名的强大的遗传操作，但不能进行深入的生化分析其适用性。在这里，我们提出了一个TAP为基础的程序，从果蝇大脑识别任何利益蛋白质相互作用的合作伙伴。此过程有可能导致新的研究途径。

利用果蝇 （果蝇）进行遗传筛选已在生物科学的进步提出了许多里程碑式的发现。然而，使用生化屏幕旨在扩大从遗传分析中获得的知识是最近才开发。在这里，我们描述的方法来净化蛋白复合物，随着兴趣的成年苍蝇头任何蛋白质的联系人。这种方法充分利用了果蝇 GAL4/UAS系统来表达融合在苍蝇体内一个神经元串联亲和纯化（TAP）的标签的诱饵蛋白，然后实现两轮净化使用类似于最初建立在一个咨询的过程酵母^1，净化相互作用蛋白复合物。在此过程结束时，获得其分子的身份可以通过质谱法来确定多蛋白复合物的混合物。候选蛋白的验证将来自R受益esource和便于执行​​功能丧失的研究中的苍蝇。类似的方法可以应用到其它蝇组织。我们相信，基因操作和这个蛋白组学方法在果蝇模型系统的结合具有很大的潜力来解决在神经生物学领域及以后的基本问题。

定义调解特定的生物过程中的分子途径或网络是生物医学研究的终极目标之一。飞遗传学家们严重依赖正向遗传学，尤其是修饰符遗传筛选（包括增强和抑制屏幕），以确定共同合作，与平行，或上游或目的基因的下游因素。然而，正向遗传学的屏幕，很多时候无法识别重要的基因，如果发生变异，导致杀伤力在早期发育阶段，或与基因功能冗余和补偿其失去功能只会造成细微瑕疵是很难得分。克服这一困难的一种方法是筛选直接的蛋白 - 蛋白相互作用。超过十年，生物化学方法，包括酵母双杂交，噬菌体展示，化学交联，联合知识产权，串联亲和纯化（TAP） 等越来越列表。已被用于研究蛋白质- 蛋白质相互作用。每种方法都有自己的一套优势和问候敏感性和特异性的弱点。其中，TAP方法可以检测物理相互作用下的近生理条件下，保留了特异性和一致性^2，并包括延伸到高通量的能力，分析^3,4。

最初是由Rigautand同事开发¹在酵母中的TAP方法。在该方法中，目的蛋白质的表达用TAP标记。在TAP标签藏着两个独立的亲和力结合结构域：一个蛋白结合于IgG域和钙调素结合结构域。这两个结构域通过一个TEV（烟草蚀纹病毒）裂解位点隔开。这样的组合使得两个独立的两轮亲和纯化，以充分降低非特异性绑定和丰富具体的绑定^1。对于这种情况下，TAP方法是一个非常强大的METHOd，来确定在给定的蛋白质的体内相互作用，虽然过表达外源蛋白可使其更易于与蛋白质通常不复杂的，其内源性的对应关联。由于它的发展时，TAP方法已经在许多其他系统，包括细胞培养为基础的系统^5,6等体内模型系统应用^6-9。在这里，我们描述了果蝇的咨询方法的适应性。我们首先生成pUAST-NTAP和pUAST-CTAP矢量以有利于克隆的TAP标记的融合到感兴趣的基因或N-或C-末端。在UAS-TAP标记的转基因然后在神经GAL4驱动器¹⁰的控制下，对神经系统表达。接着，将大量的成年苍蝇头将被收集，其具有神经细胞的高含量，并且容易从身体的其它部位根据大小不同冷冻后分离。成人头均化并清零bŸ连续离心，取上清液受下述TAP程序。

1。产生UAS-TAP标签的转基因果蝇

1. 产生pUAST-TAP标签的DNA结构。
   1. 决定（N-或C-末端）诱饵蛋白的哪一侧的TAP标记应被融合到，基于蛋白质的结构/功能。详细信息请参见讨论。
   2. 亚克隆目的基因的cDNA编码区插入pUAST-NTAP或pUAST-CTAP载体的多克隆位点（MCS），以生成N-或C-末端标记的UAS-TAP转基因，分别。参见图1详细的地图和可用限制性酶切位点和读码框。
2. 产生UAS-TAP标记的转基因果蝇。
   1. 产生转基因果蝇以下用P元素介导的插入¹¹标准协议。市售许多注射服务。
   2. 交叉神经GAL4驱动程序（ 即 BG380-GAL4）每个单独的转基因株系，并确定蛋白表达水平每行由免疫印迹（用过氧化物酶抗过氧化物酶抗体）和/或免疫（抗-TAP抗体）的。在一般情况下，用蛋白质表达水平是接近内源蛋白的转基因株系被推荐用于丝锥程序。详细信息请参见讨论。
   3. PerformGAL4/UAS-based拯救实验来证实在TAP标记的转基因的功能，如果可丧失功能的目的基因的突变体。选择转基因，可以基本上挽救突变体的表型为下面的TAP实验。

2。准备样本的TAP程序

1. 生成一个苍蝇的股票，同时携带一个神经元GAL4驱动程序（ 如 BG380-Gal4的），为了缓解扩张苍蝇样本的选择TAP标签的转基因。收集GAL4驱动程序并在极少数情况下，UAS-转基因交叉时，上面的组合会导致生存和成长不利的F1后代。
2. 收集小规模样品和优化裂解条件，增溶TAP-标签蛋白。
   1. 使用非离子洗涤剂NP-40（0.1-1％），NaDOC（0.1-1％）和Triton X-100（0.05-0.5％）的组合的系列裂解缓冲液中。 见表1和讨论了解更多信息。
   2. 在二氧化碳垫的顶部，使用＃5镊子从表达苍蝇在TAP基因解剖20成人头和收集他们在1.5ml试管测试每个裂解缓冲液条件。
   3. 添加100 UL检测裂解液管，均质头摸摸上下用塑料杵，然后再添100 UL测试缓冲区。
   4. 旋转磁头裂解物在21500×g离心10分钟（4℃），并分离离心分离后的上清液和沉淀。加入25微升2×SDS上样缓冲液，以分别将沉淀和10微升4×SDS上样缓冲液30微升上清液。
   5. 煮沸2样品5分钟，并分析它们并排侧使用SDS-PAGE及随后的Western印迹与PAP抗体。由TAP-蛋白水平的上清液与沉淀的比值决定的溶解度。
3. 在大规模制备样品
   1. 扩大并收集成蝇。
      1. 展开neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene股票的瓶子和翻转，每3天，直到累计250瓶用于收集瓶。
      2. 收集1-3日龄成蝇入50ml锥形管，把管子立即在液氮中的苍蝇深度冻结。存储苍蝇在-80°C冰箱。注意，苍蝇的体积必须不超过50毫升管的2/3。
   2. 收集苍蝇头（执行上粉状干冰顶部此步骤）。
      1. 取出预冷的筛子，并从-80°C冰箱的研钵和杵，并把它们放在干冰，最好里面一个大的冰桶。栈中的两处美国标准试验筛与上个25号Ë顶部和底部40号​​。
      2. 采取冻结苍蝇出来，把它们在液氮中，并保持苍蝇在那里约10分钟。涡或摇晃试管大力从机构打破了头，腿和翅膀。
      3. 把混合物顶端筛子，然后摇动筛大力按住两个筛子一起。筛分后，尸体会留在上面筛，飞头将被保留在底部筛板，和腿，翅膀，和其他碎片将坠落于干冰。分开两筛并仔细苍蝇头转移到冷砂浆。
   3. 均质苍蝇头
      1. 干冰的顶部，研磨头与臼和杵粉粒，然后将粉末转移到预冷是在冰上有15毫升的玻璃Dounce型组织研磨。
      2. 测量粉碎机的重量前后头部样​​品倒入，然后计算出头部多少SAMP乐晕死。总共有6-15克飞头将足以为每个TAP实验做出相应的调整，以蛋白质的表达水平。加入15毫升冰冷的匀浆缓冲液（在步骤2.2优化的裂解液）的粉末，然后与中风的间隙过大杵，直到它容易使杵上去和下来。保持玻璃研磨机上的冰在任何时候。
   4. 准备上清液进行咨询
      1. 将匀浆转移至高速离心管中并旋转20分钟，〜50,000×g离心（4℃）。将上清转移到一个新的高速离心管中，重复离心一次。
      2. 将上清转移至超速离心管并进行40分钟〜250,000×g离心旋转，以进一步清除上清液。上清液准备超速离心后的串联亲和纯化程序。

3。 TAP纯化

以下各节均来自塞拉芬实验室技术咨询protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ）

1. 执行的IgG磁珠亲和纯化
   1. 准备的IgG琼脂糖珠而样品被离心。在一个15毫升的Falcon管中，用10ml冷的IgG洗涤缓冲液洗涤400微升IgG抗体磁珠3次。对于每次洗涤，摇动管轻轻地，持续2分钟，然后停止旋转的有孔玻璃珠在1,000 xg下再持续2分钟。在第三次洗涤结束时，除去缓冲，并只留下珠粒在管。
   2. 将澄清的上清液（约15毫升）小心地转移到15ml试管中含有IgG的珠子。孵化珠和脑裂解液混合，4℃一个nutator 2小时。
   3. 建立一个干净的空微柱约15ml总量在寒冷的房间。通过稳步浇注混合成列装载的IgG珠的混合物，尽量不要任何陷阱气泡柱内。让珠定居在列和缓冲慢慢靠重力流排水。
   4. 用10毫升冷的IgG洗涤缓冲液彻底清洗柱后，所有的脑细胞裂解液通过结算的IgG柱流过。重复洗涤2倍。注意：永远不要让空气中的珠干燥。
2. 执行TEV酶切
   1. 在第三次洗涤后，用10毫升TEV裂解缓冲液反复冲洗色谱柱。这一步准备的IgG珠的sequestrates诱饵复杂的TEV酶切。
   2. 右侧前TEV缓冲区中的最后一滴欲滴出来，把帽子在柱的底部阻塞流，添加包含130个单位TEV酶的列1.3毫升TEV缓冲区中，然后安全地帽顶部列。确保该列在两端密封良好。
   3. 旋转柱在18℃维持2小时，以允许TEV酶裂解的肽在TEV站点并释放蛋白复合WHI乐离开背后的蛋白质域肽绑定到的IgG琼脂糖珠。
3. 执行钙调素磁珠亲和纯化
   1. 制备的钙调蛋白珠，而IgG抗体磁珠孵育与TEV酶。在一个15毫升的Falcon试管3次，每次用10ml冷的钙调蛋白的结合缓冲液洗涤200μl的钙调蛋白珠。对于每一个洗，轻轻摇动试管一个nutator 2分钟，然后降速珠在1000×g离心2分钟。在第三次洗涤结束时，取出所有的缓冲液和仅保留在管中的小珠。
   2. 在TEV孵化（步骤3.2.3）的结束，返回的IgG列回冷室，并设置它直线上升。让珠粒沉降10分钟。
   3. 取下顶盖，然后将底盖，然后收集在15毫升猎鹰管1.3毫升TEV酶切产物。让缓冲区完全排出。添加一个额外的200微升TEV缓冲柱推出列的死体积，收集了F低中相同的管中。
   4. 添加4.5毫升钙调素结合缓冲液和4.5微升1米_氯化钙上面收集的1.5毫升TEV酶切产物。将氯化钙₂用于滴定的EDTA在TEV缓冲液中。该6毫升混合物转移到含有钙调素珠的管和旋转管在4℃在章动器1小时。
   5. 设立另一个干净的空微柱约10ml总量在寒冷的房间。加载钙调蛋白珠混合物的柱，并允许它通过重力排出。
   6. 当所有的溶液已通过结算钙调素柱流出，洗柱2次，每次用10ml冷的钙调素的结合缓冲液中。注意：避免干扰钙调素珠，并尽量保持珠子尽可能平整的表面在洗。
4. 从洗脱柱钙调素的饵料复杂。
   洗涤后右，洗脱钙调素列有五个部分的200微升冷Calmodu林洗脱缓冲液。对每个级分，轻轻地加入200微升的洗脱缓冲液的柱，并收集与一个标记1.5ml离心管中的洗脱液。重复此4倍。
5. 分析通过SDS-PAGE的蛋白质复合
   1. 取一小等分来自五个部分（约30微升），并加入SDS上样缓冲液。煮沸样品5分钟，并加载样品侧由端与一个梯度（4-15％）的SDS-PAGE凝胶上的蛋白质分子标记。
   2. 后样品中的凝胶已经完全解决，停止电泳，染色凝胶与任何G-250为基础的敏感胶体考马斯亮蓝染色程序，如“青银”染色^13。银染是可选的，但不是优选的，因为它不与随后的质谱分析完全兼容。在-80℃冷冻用于进一步的分析，如质谱法用于发现纯化的蛋白质复合物的分子身份存储洗脱液的其余部分。硒Ë讨论。

在这里，我们证明了我们的努力物色HIGHWIRE相互作用的蛋白质在果蝇大脑。 HIGHWIRE（HIW）及其脊椎动物和无脊椎动物同系物是巨大的泛素连接酶，调节神经系统¹⁴的发育和修复。他们分享了一些高度保守的功能域。然而，它们的分子的行动是不完全清楚。在工作​​完成的蠕虫，蝇，鼠导致了当前的工作模式，HIW作为一个E3连接酶，并作为支架蛋白，以促进形成一个多亚基的泛素化复合物，通过调节时间和细胞类型特异性神经元功能的不同的辅助因子相互作用并针对不同的泛素化底物的结合。要识别HIW相关的泛素化复杂，我们首先生成一个N-末端标记UAS-TAP-HIW转基因是功能齐全的抢救HIW突变表型^15。约10g成人佛罗里达州即只表达T​​AP或TAP-HIW转基因蛋白的Y读头采集并如上所述进行咨询程序并排。从两个纯化最终洗脱物进行SDS-PAGE，然后银染色进行分析。质谱分析鉴定的蛋白质的列表只在TAP-HIW样品中，包括果蝇 FSN（DFSN，一个F-box蛋白）和Rae1（ 图2）。随后的遗传和生化分析表明，HIW和DFSN一起作为SCF类E3泛素连接酶复合物，调节突触的结构和功能^16，和Rae1联营公司与HIW 体内 ，抑制突触过度生长^17。 Rae1的这个功能是至少部分地由它通过保护HIW从自噬降解，这揭示了一个用于选择性地控制突触发育¹⁷中HIW蛋白丰度的新机制，以促进HIW蛋白稳定的能力来实现。

图1。向量生成的TAP标签的转基因果蝇。（一 ）pUAST-NTAP的地图构造。 （ 二）pUAST-CTAP的地图构造。的多克隆位点（MCS）中两种构建都标有一个支架，其中单切口的限制位点都带有红色。 （C） 的初级序列表示与TAP标签的读码框的丝锥载体的多克隆位点。 pUAST-NTAP +1和pUAST-NTAP 2：为方便亚克隆，从原来的pUAST-NTAP产生两个NTAP结构。一起三NTAP构建涵盖所有三种可能的阅读框，以适应使用中的MCS。所有矢量使用NTAP或CTAP片段最初在产生的构造塞拉芬实验室^1， 点击此处查看大图。

图2纯化果蝇大脑HIGHWIRE相互作用蛋白的自来水净化的苍蝇表达TAP成人的头。在神经系统（BG380-GAL4;; UAS-TAP）或TAP-HIW（UAS-TAP-HIW BG380-GAL4）被收集，匀化，并进行TAP纯化，分别。最终的洗脱物通过一维SDS-PAGE凝胶银染分析。该箭头指示诱饵蛋白HIW和星号表示截短蛋白TAP由于TEV酶切。在TAP-HIW样品，蛋白质的名单是由质量鉴定法，包括：HSC-70，β-微管蛋白，Rae1和DFSN（由箭头表示）。 这个数字是从田等 ¹⁷ 图1a改装点击此处查看大图。

表1中。组成的缓冲区。

串联亲和纯化（TAP）的方法提供了双纯化协议，允许通过两个独立的亲和纯化步骤的分离和蛋白质复合物的富集。在TAP标签的设计并不局限于所显示的内容在本协议中，其它蛋白结合结构域和图案也同样适用，如果缓冲液条件进行相应调整。其他的TAP标签的一个很好的例子是GS-TAP标签，G蛋白的结合和链霉亲和结合基序，由Giulio Superti-Furga小组力求在培养的哺乳动物细胞系¹⁸纯化蛋白复合物而设计的。在GS-TAP后来被改编为研究蛋白质-蛋白质相互作用在果蝇 S2细胞和胚胎^19。最近的朱庇特的出版物贝利等人演示了如何在GS-TAP程序是用细胞培养裂解物²⁰进行。在这里，我们提出了在果蝇神经组织使用TAP-标签（广告ULT头）进行大规模蛋白质组审查。这个协议可以潜在地适用于其他组织，使大规模样品的采集，如胚胎。也可用于丝锥收集在顶筛（步骤2.3.2.3）的成年体，它可以是一个非常具有挑战性的任务。裂解缓冲液必须进行修改和调节，以抑制存在于消化道中的大多数和所述第一净化过程中为了降低蛋白质的曝光时间对蛋白酶显著缩短了大量的蛋白酶。虽然不同的TAP标签需要不同的handlings和缓冲液条件对亲和纯化，为TAP的一般原则是相同的。下面我们讨论，这将影响咨询结果的质量问题。

在TAP方法的成功依赖于生成正确的转基因。首先，在TAP标签本身不能改变的诱饵蛋白，这​​是至关重要的，以保持其能力的整体构与它的生理约束力的合作伙伴进行交互。因此，关键是要决定在哪里的TAP标签融合到感兴趣的基因。可以基于蛋白质的早先研究中，关于其结构或功能epitode-标记的转基因特别是信息作出决定。在这样的情况下，信息是不可用的，标记的诱饵蛋白，在N-或C-端并联的建议。然后官能拯救实验，可以执行以确定应该使用哪个转基因。第二，转基因蛋白的表达水平应接近该内源蛋白。这是特别重要的，因为GAL4/UAS系统正常驱动转基因的表达在不同时刻以高得多的水平相比，内源性蛋白，它可以或者增加假阳性或引起该改变蛋白质相互作用的轮廓意想不到的后果网络中的单元格。例如，过度骨架蛋白可能喧嚣Ë显性负效应，而具有酶活性，如激酶过度表达的蛋白质，很多时候会引起功能获得的效果，这两者都可能反过来影响其内在约束力的合作伙伴，以与它们进行交互的能力。因此，应避免GAL4/UAS系统时所关注的基因的表达的时间和水平的内源性的相互作用，只有在正常状态下呈现的保存至关重要。相反，在TAP标记的转基因的表达应该在其自身的启动子来控制。这可以通过与内源启动子序列取代了UAS序列，或通过融合在框架中的TAP序列与包含感兴趣的²¹基因的全部基因座的基因组DNA片段在exonal序列来实现。在某些情况下，在TAP实验可以在目的基因的功能突变的丧失来进行，以减少内源蛋白为增量竞争orporating成多蛋白复合物。对于此实例，蛋白质空的背景下，如果有的话，提供了理想的条件下，完全消除了内源性蛋白质。利用遗传突变的背景将随时增加的机会，以更高的质量产生结果。

诱饵蛋白的溶解性是取得成功的另一个关键因素。非离子型洗涤剂通常用于在裂解缓冲液中以溶解血浆膜，并保留了蛋白复合物，可溶和完整的，在一个状态，它是接近生理环境。但是这取决于所感兴趣的蛋白是否是膜结合或相关的蛋白质，非离子型洗涤剂的组成和浓度可能是至关重要的溶诱饵蛋白。 0.1-0.3％NP40往往足以溶解胞质蛋白。对于膜蛋白，NP40的组合（0.1-1％），NaDOC（0.1-1％）和Triton X-100（0.05-0.5％），有时需要增溶丽泽和丰富充足的蛋白质为TAP实验。但是，由于严格的裂解缓冲液中趋向于破坏较弱的蛋白质 - 蛋白质相互作用，平衡需要被达到，其中足够的可溶性诱饵蛋白是存在于样品中，而在同一时间的大部分蛋白质 - 蛋白质相互作用被保留。一般的原则是，总是试图用最少种类的清洁剂最低浓度。

为了便于排除故障，强烈建议保存一个小等分试样从两个纯化的每一步。上的等分试样随后的SDS-PAGE和蛋白染色/ Western分析允许被监测诱饵蛋白的水平和某些蛋白质的物种的序列的富集。例如，如果在TEV切割后流出（步骤3.3.3）的等分试样中检测到突然减少诱饵蛋白，它很可能是诱饵蛋白的IgG抗体磁珠洗涤（步骤3.1.4）期间丢失。一个POSSIBLE原因可能是IgG的洗涤缓冲液的不足洗涤剂组合物。对所用的洗涤剂的组成和浓度的急剧下降在IgG的洗涤缓冲液（0.1％NP-40只）相比，在裂解缓冲液中。诱饵蛋白可能对这些变化不敏感，并从上珠的IgG的部分解离。调整对裂解缓冲液IgG的清洗可以帮助解决这个问题。可替换地，虽然可能性较小，TEV的裂解（步骤3.2）可能没有足够的工作来释放含有诱饵复杂的IgG抗体的珠子。值得一第二次检查的步骤是IgG的珠子与TEV缓冲（步骤3.2.1）和酶的活性的平衡，处理不当可能会缓和这种酶。

请记住，即使是两步纯化，仍然会出现误报和蛋白质被拉低非特异性存在于最终的TAP纯化复杂。确定这些非特异性相互作用，在单程至少部分地，是包括使用TAP-只转基因与TAP标签的，转基因在TAP纯化实验并行控制水龙头。在TAP-只有程序确定的蛋白质应该从TAP-纯化的转基因标识的列表中删除。

一个成功的TAP纯化将被潜在地与体内感兴趣的蛋白质相关的蛋白质的混合物。下一个步骤是在分子识别这些蛋白质，和质谱法通常用于此目的。根据从SDS-PAGE的结果，并在实验的需要，在纯化的蛋白质复合物的分子身份可以如下两种方式确定：1）每个单独的蛋白条带可从凝胶中切出并进行了低复杂的LC-MS/MS，或2），其中包含的峰值蛋白质含量（通常为第二次洗脱）洗脱剂的馏分可直接经受中等复杂的LC-MS/MS。这样的渔翁撒网proteomic方法将潜在地识别所有的蛋白质复合物，这取决于设备的MS ²²的动态范围。

综上所述，我们提出了一个方法来确定蛋白质 - 蛋白质相互作用的遗传模型有机体的神经组织 - 果蝇。有许多的应用TAP方法对苍蝇的优点：1）果蝇具有短的生命周期，所以它是比较快速和容易地产生转基因果蝇和获得在大量组织中，两者都为TAP关键的方法，2）在果蝇基因组完全注释和包含人类致病基因的70％，以及3）最重要的是，它很容易在功能验证和候选果蝇相互作用蛋白进行表征。有在飞研究团体可用于给定的基因，如转基因系的RNAi收集有用的学习的特征综合资源组织特异性的大多数基因的功能丧失的秒，突变和等位基因缺失大多数基因座，以及cDNA克隆和转基因为获得功能的研究是有用的。我们相信，飞TAP方法将是一个有价值的除了苍蝇实验室使用的工具盒。在未来的角度看，这种方法可以与飞行为范式和人类疾病模型进行组合筛选中的蛋白 - 蛋白相互作用网络的变化响应的具体条件和刺激。

作者什么都没有透露。

我们感谢EUROSARF向我们发送咨询酵母表达质粒。我们也感谢来自瑞安Labadens社论帮助。这项工作是由美国国立卫生研究院一/ NINDS补助金（R01NS070962）为CW支持