Method Article
Bu makalede, farelerin beyin omurilik sıvısındaki (BOS) glikoz konsantrasyonunu arttırmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek BOS glikozunun farelerde nörodejenerasyon, biliş ve periferik glikoz metabolizması üzerindeki etkilerini incelemek için yararlı olabilir.
Diyabet bilişsel gerileme riskini artırır ve beyin fonksiyonlarını bozar. Yüksek glikoz ve bilişsel eksiklikler arasındaki bu ilişkinin nedensel olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, bu eksikliklere beyin omurilik sıvısı (BOS) ve / veya kandaki glikoz seviyelerindeki bir artışın aracılık edip etmediği de belirsizdir. Yüksek BOS glukoz seviyelerinin merkezi sinir sistemi (CNS) fonksiyonu, özellikle öğrenme ve hafıza üzerindeki doğrudan etkilerini araştıran çok az çalışma vardır, çünkü mevcut diyabet modelleri bu tür araştırma sorularını ele almak için yeterince geliştirilmemiştir. Bu makalede, farelerde ozmotik minipompalar kullanılarak lateral ventriküle glikoz sürekli olarak infüze edilerek 4 hafta boyunca BOS glukoz seviyelerini kronik olarak arttırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, BOS'taki glikoz düzeyleri ölçülerek doğrulandı. Bu protokol, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) alan farelerde ~ 56 mg / dL'lik bir BOS glikoz konsantrasyonuna kıyasla, 0.25 μL / s akış hızında% 50'lik bir glikoz çözeltisinin infüzyonundan sonra BOS glikoz seviyelerini ~ 328 mg / dL'ye yükseltti. Ayrıca, bu protokol kan şekeri seviyelerini etkilemedi. Bu nedenle, bu yöntem, yüksek BOS glikozunun beyin fonksiyonu veya belirli bir sinir yolu üzerindeki doğrudan etkilerini, kan şekeri seviyelerindeki değişikliklerden bağımsız olarak belirlemek için kullanılabilir. Genel olarak, burada açıklanan yaklaşım, Alzheimer hastalığının ve / veya diyabetle ilişkili diğer nörodejeneratif bozuklukların aracılık özelliklerinde yüksek BOS glikozunun rolünü test etmek için hayvan modellerinin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.
Hem tip 1 hem de tip 2 diyabet beyin fonksiyonlarını bozar 1,2,3. Örneğin, diyabet, Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere bilişsel gerileme ve nörodejeneratif bozukluklar riskini artırır 3,4. Dahası, diyabetli kişilerin beyinlerinde kusurlu glikoz algılaması vardır 5,6. Bu defekt, hipoglisemiye bağlı bilinçsizliğin patogenezine ve hipoglisemiye karşı yetersiz birkarşı-düzenleyici yanıt 7,8'e katkıda bulunur ve bu da hemen tedavi edilmezse ölümcül olabilir.
Diyabetin kandaki ve beyin omurilik sıvısındaki (BOS)9 glikoz seviyelerini arttırdığı göz önüne alındığında, bu faktörlerden birinin veya her ikisinin de bozulmuş beyin fonksiyonuna katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek önemlidir. Diyabetin tek başına yüksek BOS glikozu ile veya insülin eksikliği veya insülin direnci gibi diğer faktörlerle kombinasyon halinde beyin hasarına neden olup olmadığı da açık bir sorudur. Tip 1 ve tip 2 diyabetin hayvan modelleri, etkilenen enerji dengesine ve periferik glikoz metabolizmasına ek olarak bilişsel gerileme ve nörodejenerasyon göstermektedir10,11,12,13. Bununla birlikte, bu modellerden, diyabetin beyin fonksiyonu üzerindeki komplikasyonlarına aracılık etmede yüksek BOS glikozunun kan şekeri seviyelerine karşı seçici etkilerini ayırmak mümkün değildir.
Bu protokol, kronik olarak yüksek BOS glukoz seviyelerinin beyin fonksiyonu, enerji dengesi ve glikoz homeostazı üzerindeki etkilerini test etmek için bir fare hiperglikorekrasi modeli geliştirme yöntemlerini açıklamaktadır. Bu teknikle geliştirilen fare modeli, düzensiz glukoz homeostazının nöral ve davranışsal fonksiyon üzerindeki etiyolojik rolünü araştıran çalışmalar için bir araç sunmaktadır.
Bu nedenle, önerilen yaklaşım, çeşitli patofizyolojik durumlarda yüksek BOS glukoz düzeylerinin doğrudan etkilerini anlamada yararlı olacaktır.
Tüm fare prosedürleri, Rochester Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve deney hayvanlarının insancıl bakımı ve kullanımı için ABD Halk Sağlığı Hizmeti kurallarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışma için kullanılan altı haftalık C57BL / 6J erkek fareler ticari olarak elde edildi. Tüm hayvanlar, 12 saatlik gündüz / gece döngüsüne sahip bir odada grup olarak barındırıldı (kafes başına 5 fare) ve yiyecek ve su ad libitumuna erişim izni verildi. Farelere, glikozu lateral ventriküle enjekte etmek için bir kanül implante edildikten sonra, implantlara diğer farelerden herhangi bir zarar gelmesini önlemek için tek bir yerleştirildiler.
1. Ozmotik mini pompaların montajı
2. Ozmotik pompaları implante etmek için cerrahi
3. Mini pompaların değiştirilmesi
NOT: Bu çalışmada kullanılan mini pompalar sadece 4 hafta sürdüğü için, uzun süreli çalışmalarda gerekebileceği gibi, glikoz infüzyon süresini uzatmak için mini pompaların değiştirilmesi de test edilmiştir. Bu, aşağıdaki adımları içeriyordu.
4. BOS toplama prosedürü
5. Glikoz tahlili
6. Kan şekeri tahlili
Erkek farelere, aCSF veya% 50'lik bir glikoz çözeltisini lateral ventriküllerine kronik olarak infüze etmek için ozmotik bir mini pompaya monte edilmiş bir kanül (Şekil 1) implante edildi (Şekil 2). BOS, bu prosedürün etkinliğini doğrulamak için ameliyattan 10 gün sonra toplandı (Şekil 3). Sonuçlar, aCSF ile aşılanmış farelerde% 50 glikoz ile aşılanmış farelerde BOS glikoz seviyelerinde (ortalama: 56.5 mg / dL) bir artış olduğunu göstermiştir. Bu, deney farelerinde BOS glikoz seviyelerinde, kontrol çöp arkadaşlarına kıyasla yaklaşık altı kat artıştır (Şekil 4A). Kan şekeri düzeyleri gruplar arasında farklı değildi (Şekil 4B).
Resim 1: Ozmotik mini pompaların montajı . (A) Boru vasıtasıyla bir mini pompaya bağlı bir kanül ile infüzyon tertibatı. Bu pompaların astarlanması için en az 48 saat gerekir. (B) Minipompaların dışında hava kabarcıklarının bulunması, astarlamayı doğrular. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Stereotaksik aparat ve aksesuarlar. (A,B) Takılı bir mikromanipülatöre sahip stereotaksik ekipman ve diğer aksesuarlar. (C) Kanülü yerleştirmek için çapak deliği koordinatları. (D) Ozmotik mini pompa implantasyonu, (E,F) Kanülün delinmiş deliğe yerleştirilmesi. Ameliyat boyunca aseptik koşulları koruyun. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Beyin omurilik sıvısı (BOS) toplama prosedürü. (A) Dorsal boyun kasları, cisterna magna'yı açığa çıkarmak için künt forsepslerle hafifçe yer değiştirdi. (B) kopması ve (C,D) cisterna magna'dan BOS toplamak için 0.5 mm çapında ucu olan 1 mm'lik bir kılcal damar kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Glikoz ölçümü. (A) Lateral ventrikülde %50 glikoz çözeltisi ile aşılanmış farelerde açlık yapmayan kan şekeri seviyelerini etkilemeden artmış BOS glukozu (B). Bu protokolün etkinliği, glukoz infüzyonunu başlattıktan 10 gün sonra BOS ve kan şekeri konsantrasyonu ölçülerek doğrulandı. % 50 glikoz çözeltisi ile infüze edilen fareler, 56.5 ± 2.6 mg / dL glikoz seviyelerine sahip yapay BOS infüzyonu alan farelere kıyasla, 327.7 ± 30.1 mg / dL (ortalamanın standart ± hatası) BOS glikoz seviyelerine sahipti. p < 0.0001, eşlenmemiş t-testi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder (n = 5). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu makalede, lateral ventriküle implante edilen bir kanüle bağlı ozmotik minipompalar kullanılarak farelerde BOS glukozunu arttırmak için ayrıntılı bir protokol bildirilmiştir. Bu prosedürle fare beyninde glukozun kronik infüzyonu, uzun süreli hiperglikorerazinin biliş, sistemik glukoz metabolizması ve enerji dengesi üzerindeki etkilerini tanımlamada ve diyabet komplikasyonlarının patogenezini daha iyi anlamada yararlı olacaktır.
Kronik diyabet, beyin ve çevre organları arasındaki iletişimi kesen beyin hasarına neden olur15. Diyabet ayrıca Alzheimer hastalığı da dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalık riskini artırır 3,4. Streptozotosin (STZ) kaynaklı tip 1 diyabet, diyabet araştırmalarında standart kemirgen modeli olmuştur16; STZ, pankreastaki β hücrelerine zarar vererek tip 1 diyabet benzeri patolojiye yol açar. Ayrıca, modifiye edilmiş bir versiyonda, nikotinamidlerle birlikte STZ kullanımı tip 2 diyabeti indükleyebilir. Hayvanlarda tip 2 diyabet benzeri fenotipler geliştirmenin bir başka yolu da onları yüksek yağlı bir diyetle beslemektir16. Bununla birlikte, hipergliseminin beyin fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek bağlamında, bu teknikler çok sayıda faktörün (örneğin, periferik insülin / glukagon seviyeleri ve genel olarak metabolik fonksiyon) kontrolünde sınırlıdır. Bu nedenle, STZ kaynaklı diyabetin beyin fonksiyonu üzerindeki herhangi bir etkisi, tek bir etiyolojik faktörü belirlemek yerine, yalnızca ilişkili bir komplikasyon olarak yorumlanabilir. Serebroventriküler boşluktaki maddelerin akut enjeksiyonu veya kronik infüzyonu, beyin fonksiyonu üzerindeki doğrudan etkilerini test etmek için sıklıkla kullanılan bir tekniktir. STZ'nin intraserebroventriküler (ICV) enjeksiyonu, Alzheimer hastalığının kemirgen modelini geliştirmek için kullanılmıştır, ancak STZ ile ilişkili nöral hasarın, glikoz algılama / homeostazdaki veya STZ'nin neden olduğu oksidatif stres ve DNA hasarı gibi diğer bağımsız mekanizmalardaki düzensizlikten kaynaklanıp kaynaklanmadığı belirsizliğini korumaktadır17.
Mevcut protokolde açıklanan prosedürler, BOS glukoz konsantrasyonundaki bir artışın bilişsel bozulmaya neden olup olamayacağı gibi araştırma sorularını cevaplayabilecek kemirgen modellerinin geliştirilmesinde yararlı olacaktır. Burada açıklanan protokol, yüksek BOS glikoz seviyelerinin, besin algılama, metabolizma ve / veya bilişle ilgili diğer beyin bölgelerinin yanı sıra hipotalamus ve hipokampus üzerindeki doğrudan etkilerini belirlemede kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda BOS glukoz seviyelerindeki bir artışın insülin duyarlılığını, insülin sekresyonunu, gıda alımını ve / veya başlangıçta ve metabolik hakaretlere yanıt olarak enerji dengesini etkileyip etkilemediğini açıklığa kavuşturacaktır. Ayrıca, burada bildirilen protokol, uzunlamasına çalışmalar gerektiren hipotezlerin test edilmesinde geçerli olacaktır. Örneğin, aynı hayvanlardan farklı zamanlarda elde edilen bulguları karşılaştırmak için glikoz infüzyonlarının öncesinde, sırasında ve sonunda veri toplanabilir. Böyle bir strateji, normal BOS glikoz seviyesi geri yüklendikten sonra yüksek BOS glikoz seviyesinden kaynaklanan komplikasyonların geri dönüşümlü olup olmadığını ele alacaktır. Buna karşılık, yöntem hipotez üreten çalışmalar için de kullanılabilir. Örneğin, BOS aynı hayvanlardan farklı zamanlarda toplanabilir ve biyobelirteçleri veya yüksek düzeyde BOS glikozu tarafından üretilen metabolik hakaretleri tanımlamak için metabolomik veya proteomik analize tabi tutulabilir. Benzer şekilde, beynin farklı bölgeleri, yüksek BOS glikozu tarafından değiştirilmiş olabilecek hücreye özgü bilgileri elde etmek için uzamsal transkriptomiklerle analiz edilebilir.
Glikozsuz aCSF'yi sahte bir gruba aşılamanın mantığı, BOS glikoz konsantrasyonunu başlangıç seviyesinde tutmaktı, böylece kanül implantasyonunun neden olduğu BOS glikoz seviyesindeki herhangi bir değişiklik doğal olarak kontrol edilebilirdi. Bu çalışmadaki sonuçlar, sahte grubun, farelerde normal BOS glikoz aralığında olan ~ 60 mg / dL (~ 3 mM) BOS glikoz konsantrasyonuna sahip olduğunu göstermiştir18. Tip 2 diyabetli bireylerde gözlenen BOS glukoz seviyeleri ~ 110 mg / dL veya ~ 6 mM9'dur. Bu çalışmada, 125μg / s oranında% 50 glikoz ICV infüzyonu, BOS glukoz seviyelerini suprafizyolojik 19 olan ~ 300 mg / dL'ye (16 mM) yükseltmiştir. BOS glukozunun bu suprafizyolojik seviyesi, tip 2 diyabetli bireylerde gözlenen seviyelerle klinik olarak ilişkili olmasa da, bu çalışmada sunulan sonuçlar, BOS'taki glikoz infüzyonunun farelerde BOS glukoz konsantrasyonunun kronik olarak yükselmesine neden olabileceğini göstermektedir.
Burada sunulan yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Bu tür gelişmiş prosedürlerin gerçekleştirilmesinde ilgili eğitim, beceri ve deneyim gerektiren sofistike fare beyni ameliyatını içerir. Kateter ve mini pompalar uzun süre implante edildiğinden, sağlık endişelerini veya kateter tertibatındaki hasarı izlemek için çalışma boyunca farelerin titiz bakımı gereklidir. % 50'lik bir glikoz konsantrasyonu seçildi, çünkü bu konsantrasyonun ötesindeki bir çözeltinin viskozitesi, glikozun ventriküllere infüzyonunu etkilemiş olabilir. Bu protokolde kullanılan mini pompalar 0.25 μL / s'lik bir akış hızına sahipti, bu nedenle% 50 glikoz infüzyonuna sahip fare grubu, 125 μg / s oranında glikoz veya günde 3 mg glikoz aldı. Bu nedenle, birim zaman başına bu glikoz dozu, mini pompaların akış hızı ile sınırlıydı.
Özetle, bu makale farelerde BOS glukozunun kronik artışı için doğrulanmış bir yöntem bildirmektedir. Bu modelden elde edilen bilgiler, BOS glukoz düzeylerindeki bir artışın, nörodejeneratif bozukluklar gibi diyabetle ilişkili komplikasyonlara aracılık etmede veya diyabet ve obezitede periferik metabolik hakaretlere neden olmada rol oynayıp oynamadığını veya nasıl rol oynadığını belirlemede yararlı olacaktır.
Sorun giderme
Boru farelerdeki kanülden çıkarsa, mini pompa monte edilirken kanül-boru bağlantısına az miktarda yapıştırıcı uygulanabilir. Dikişler çıkar ve kanül görünür hale gelirse, dikişler veya zımbalar kullanılarak kesi alanı tamamen kapatılabilir. Farenin arka pençelerinden gelen tırnaklar kesilmelidir, böylece ameliyat alanını fare tarafından çizilme olasılığı daha düşüktür. Ayrıca, farelerin hassas bir cilde sahip olması nedeniyle dikişleri cildin yırtılacağı kadar sıkı bağlamamaya dikkat edin.
BOS toplanmasından sonra hızlı iyileşme için, ameliyattan sonra deri altından 300 μL steril salin enjeksiyonu önerilir. Ayrıca, CSF koleksiyonunun maksimum hacmini 10 μL'de tutmak da önemlidir.
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Ulusal Sağlık Enstitüleri, KHC'ye DK124619 hibesi verdi.
Başlangıç fonları ve pilot araştırma ödülü, Rochester Üniversitesi, Tıp Bölümü, NY, KHC'ye.
Del Monte Sinirbilim Enstitüsü Pilot Araştırma Ödülü, Rochester Üniversitesi, KHC'ye.
Üniversite Araştırma Ödülü, Araştırma Başkan Yardımcısı Ofisi, Rochester Üniversitesi, NY, KHC'ye.
MUR yöntemi tasarladı ve uyguladı, sonuçları analiz etti, grafikler ve şekiller hazırladı ve makaleyi yazdı ve düzenledi. KHC çalışmayı tasarladı ve denetledi, sonuçları analiz etti ve makaleyi yazdı ve düzenledi. KHC bu çalışmanın garantörüdür. Tüm yazarlar makalenin son halini onaylamıştır.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
Cannula holder | KOPF | 1966 | |
Centering scope | KOPF | 1915 | |
Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
Hair Clipper | WAHL | N/A | |
heating pad | Heatpax | 19520483 | |
Hemostat | N/A | N/A | |
Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
KCl | VWR | 0395-500g | |
Magnetic stand | WPI | M1 | |
Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
Metal Spatula | N/A | N/A | |
MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
Parafilm | Bemis | DM-999 | |
Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
Scalpel | N/A | N/A | |
Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
Tray | N/A | N/A |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır