Method Article
この記事では、マウスの脳脊髄液(CSF)中のグルコース濃度を高めるための詳細なプロトコルについて説明します。このアプローチは、マウスの神経変性、認知、および末梢グルコース代謝に対する高CSFグルコースの影響を研究するのに役立ちます。
糖尿病は認知機能低下のリスクを高め、脳機能を損ないます。高血糖と認知障害の間のこの関係が因果関係であるかどうかは、とらえどころのないままです。さらに、これらの欠損が脳脊髄液(CSF)および/または血液中のグルコースレベルの上昇によって媒介されるかどうかも不明である。現在の糖尿病モデルはそのような研究課題に対処するのに十分に開発されていないため、中枢神経系(CNS)機能、特に学習と記憶に対する高CSFグルコースレベルの直接的な影響を調査した研究はほとんどありません。本稿では、マウスの浸透圧ミニポンプを用いて側脳室にグルコースを連続的に注入することにより、CSFグルコースレベルを4週間慢性的に上昇させる方法について述べる。プロトコルは、CSF中のグルコースレベルを測定することによって検証された。このプロトコルは、人工脳脊髄液(aCSF)を投与されたマウスのCSFグルコース濃度~56 mg/dLと比較して、0.25 μL/hの流速で50%グルコース溶液を注入した後、CSFグルコースレベルを~328 mg/dLに増加させました。さらに、このプロトコルは血糖値に影響を与えませんでした。したがって、この方法は、血糖値の変化とは無関係に、脳機能または特定の神経経路に対する高CSFグルコースの直接的な影響を決定するために使用することができる。全体として、ここで説明するアプローチは、アルツハイマー病および/または糖尿病に関連する他の神経変性疾患の特徴を媒介する高CSFグルコースの役割をテストするための動物モデルの開発を促進します。
1型糖尿病と2型糖尿病の両方が脳機能を損ないます1,2,3。例えば、糖尿病は認知機能低下やアルツハイマー病を含む神経変性疾患のリスクを高めます3,4。さらに、糖尿病患者は脳内のグルコース感知に欠陥があります5,6。この欠陥は、低血糖に関連する無意識の病因と低血糖に対する不十分な逆調節応答に寄与します7,8、これはすぐに治療しないと致命的となる可能性があります。
糖尿病は血液および脳脊髄液(CSF)9中のグルコースレベルを上昇させることを考慮すると、これらの要因の一方または両方が脳機能障害に寄与するかどうかを判断することが重要です。糖尿病が高CSFグルコースのみによって脳損傷を引き起こすのか、インスリン欠乏症やインスリン抵抗性などの他の要因と組み合わせて脳損傷を引き起こすのかも未解決の問題です。1型および2型糖尿病の動物モデルは、影響を受けたエネルギーバランスおよび末梢グルコース代謝に加えて、認知機能低下および神経変性を示す10、11、12、13。しかし、これらのモデルから、脳機能に対する糖尿病の合併症を媒介する際の高CSFグルコース対血糖値の選択的効果を切り離すことは現実的ではない。
このプロトコルは、脳機能、エネルギーバランス、およびグルコース恒常性に対する慢性的に高いCSFグルコースレベルの影響をテストするために、高グリコラキアのマウスモデルを開発する方法を説明しています。この技術によって開発されたマウスモデルは、神経および行動機能に対する調節不全のグルコース恒常性の病因学的役割を調査するための研究のためのツールを提供します。
したがって、提案されたアプローチは、さまざまな病態生理学的条件におけるCSFグルコースレベルの上昇の直接的な影響を理解するのに役立ちます。
すべてのマウス手順は、ロチェスター大学の施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の人道的ケアおよび使用に関する米国公衆衛生局のガイドラインに従って実施されました。本試験に用いた6週齢のC57BL/6J雄マウスを商業的に入手した。すべての動物を12時間の昼/夜サイクルの部屋にグループ飼育し(ケージあたり5匹のマウス)、餌と水を 自由に摂取できるようにしました。マウスにグルコースを側脳室に注入するためのカニューレを移植した後、他のマウスからのインプラントへの損傷を防ぐために、マウスを単一収容した。
1.浸透圧ミニポンプの組み立て
2. 浸透圧ポンプを埋め込む手術
3.ミニポンプの交換
注:この研究で使用されたミニポンプは4週間しか持続しないため、長期研究の場合に必要となる可能性があるため、グルコース注入の期間を延長するためにミニポンプの交換もテストされました。これには、次の手順が含まれていました。
4. CSF収集手順
5.グルコースアッセイ
6.血糖アッセイ
オスマウスに浸透圧ミニポンプに組み立てられたカニューレを移植し(図1)、aCSFまたは50%グルコース溶液を側脳室に慢性的に注入しました(図2)。CSFは、この手順の有効性を検証するために、手術の10日後に収集されました(図3)。その結果、50%グルコースを注入したマウスでは、aCSFを注入したマウス(平均:56.5 mg/dL)と比較して、CSFグルコースレベル(平均:327.7 mg/dL)が増加しました。これは、それらの対照同腹仔と比較して、実験マウスにおけるCSFグルコースレベルの約6倍の増加である(図4A)。血糖値は群間で異ならなかった(図4B)。
図1:浸透圧ミニポンプの組み立て 。 (A)チューブを介してミニポンプに接続されたカニューレを備えた注入アセンブリ。これらのポンプは、プライミングに少なくとも48時間かかります。(B)ミニポンプの外側に気泡が存在すると、プライミングが確認されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:固定装置と付属品 。 (A、B)マイクロマニピュレーターおよびその他の付属品が取り付けられた固定装置。(C)カニューレを挿入するためのバリ穴座標。(D)浸透圧ミニポンプの移植、(E、F)ドリル穴へのカニューレの挿入。手術中は無菌状態を維持します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:脳脊髄液(CSF)採取手順 。 (A)鈍い鉗子で背頸部の筋肉を緩やかに変位させ、大槽を露出させた。直径0.5mmの先端を有する1mmの毛細管を用いて、(B)破裂させ、(C、D)大槽からCSFを回収した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:グルコースの測定。 (A)側脳室に50%グルコース溶液を注入したマウスにおける非空腹時血糖値に影響を与えずにCSFグルコースを増加させた(B)。このプロトコルの有効性は、グルコース注入を開始してから10日後にCSFと血液グルコース濃度を測定することによって検証されました。50%グルコース溶液を注入したマウスは、グルコースレベルが56.5 ±± 2.6 mg / dLの人工CSF注入を受けたマウスと比較して、CSFグルコースレベルが327.7 30.1 mg / dL(平均±標準誤差)でした。p < 0.0001、対応のないt検定。エラーバーは平均の標準誤差(n = 5)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この記事では、側脳室に埋め込まれたカニューレに接続された浸透圧ミニポンプを使用して、マウスのCSFグルコースを増加させるための詳細なプロトコルを報告します。この手順によるマウス脳へのグルコースの慢性注入は、認知、全身のグルコース代謝、およびエネルギーバランスに対する長期高グリコラキアの影響を描写し、糖尿病合併症の病因をよりよく理解するのに役立ちます。
慢性糖尿病は、脳と末梢器官との間の通信を遮断する脳損傷を引き起こす15。糖尿病はまた、アルツハイマー病を含む神経変性疾患のリスクを高めます3,4。ストレプトゾトシン(STZ)誘発性1型糖尿病は、糖尿病研究における標準的なげっ歯類モデルです16。STZは膵臓のβ細胞に損傷を与え、1型糖尿病のような病状を引き起こします。さらに、修正版では、ニコチンアミドを伴うSTZの使用は、2型糖尿病を誘発し得る。動物で2型糖尿病のような表現型を発達させる別の方法は、動物に高脂肪食を与えることです16。しかし、脳機能に対する高血糖の影響を研究するという文脈では、これらの技術は、多数の要因(例えば、末梢インスリン/グルカゴンレベル、および一般的な代謝機能)の制御において制限されている。したがって、脳機能に対するSTZ誘発性糖尿病の影響は、単一の病因を特定するのではなく、関連する合併症としてのみ解釈することができます。脳室空間への物質の急性注射または慢性注入は、脳機能に対するそれらの直接的な影響をテストするためにしばしば使用される技術である。STZの脳室内(ICV)注射は、アルツハイマー病のげっ歯類モデルの開発に使用されていますが、STZ関連の神経損傷がグルコース感知/恒常性の調節不全によるものなのか、STZ誘発性の酸化ストレスやDNA損傷などの他の独立したメカニズムによるものなのかは不明です17。
現在のプロトコルに記載されている手順は、CSFグルコース濃度の増加が認知障害を引き起こす可能性があるかどうかなどの研究の質問に答えることができるげっ歯類モデルの開発に役立ちます。ここで説明するプロトコルは、栄養感知、代謝、および/または認知に関与する他の脳領域の中でも、視床下部および海馬に対する高CSFグルコースレベルの直接的な影響を決定するために使用できます。この方法はまた、CSFグルコースレベルの上昇が、ベースライン時および代謝傷害に応答して、インスリン感受性、インスリン分泌、食物摂取、および/またはエネルギーバランスに影響を与えるかどうかを明らかにします。さらに、ここで報告されたプロトコルは、縦断的研究を必要とする仮説のテストに適用できます。たとえば、ブドウ糖注入の前、最中、および最後にデータを収集して、同じ動物からの所見を異なる時間に比較することができます。このような戦略は、正常なCSFグルコースレベルが回復した後に、高いCSFグルコースレベルから生じる合併症が可逆的であるかどうかに対処するであろう。対照的に、この方法は仮説生成研究にも使用できます。例えば、CSFを同じ動物から異なる時間に採取し、メタボロミクスまたはプロテオミクス分析にかけ、バイオマーカーまたは高レベルのCSFグルコースによって産生される代謝阻害を同定することができる。同様に、脳のさまざまな領域を空間トランスクリプトミクスによって分析して、高CSFグルコースによって変化した可能性のある細胞特異的情報を得ることができます。
無糖aCSFを偽群に注入する理論的根拠は、CSFグルコース濃度をベースラインレベルに保ち、カニューレ移植によって誘発されるCSFグルコースレベルの変化を自然に制御できるようにすることでした。この研究の結果は、偽群のCSFグルコース濃度が~60 mg/dL(~3 mM)であり、マウス18の正常なCSFグルコース範囲にあることを示しました。2型糖尿病患者で観察されるCSFグルコースレベルは、~110 mg/dLまたは~6 mM9です。現在の研究では、125μg/hの速度で50%グルコースをICV注入すると、CSFグルコースレベルが~300 mg/dL(16 mM)に上昇し、これは超生理学的19です。CSFグルコースのこの超生理学的レベルは、2型糖尿病の個人で観察されるレベルに臨床的に関連しないかもしれないが、この研究で提示された結果は、CSFへのグルコースの注入がマウスにおけるCSFグルコース濃度の慢性的な上昇を誘発する可能性があることを示している。
ここで示す方法には、いくつかの制限があります。これには、そのような高度な手順を実行するための関連するトレーニング、スキル、および経験を必要とする高度なマウス脳手術が含まれます。カテーテルとミニポンプは長期間埋め込まれるため、健康上の懸念やカテーテルアセンブリの損傷を監視するには、研究全体を通してマウスの細心のケアが必要です。50%グルコース濃度を選択した理由は、この濃度を超える溶液の粘度が脳室へのグルコースの注入に影響を与えた可能性があるためです。このプロトコルで使用されたミニポンプの流速は0.25 μL / hであったため、50%グルコース注入のマウスのグループは、125 μg / h、または1日あたり3 mgのグルコースの割合でグルコースを受け取りました。したがって、単位時間あたりのグルコースのこの用量は、ミニポンプの流量によって制限されていました。
要約すると、この記事は、マウスにおけるCSFグルコースの慢性的な増加のための検証された方法を報告する。このモデルから得られた情報は、CSFグルコースレベルの上昇が、神経変性疾患などの糖尿病関連合併症の媒介、または糖尿病および肥満における末梢代謝侮辱を引き起こすことに関与するかどうか、またはどのように関与するかを決定するのに役立ちます。
トラブルシューティング
チューブがマウスのカニューレから外れた場合は、ミニポンプを組み立てるときにカニューレとチューブの接続部に少量の接着剤を塗布できます。縫合が外れてカニューレが見えるようになった場合は、縫合糸やステープルを使用して切開部を完全に閉じることができます。マウスの後足からの爪は、マウスによって手術領域を傷つける可能性が低くなるようにトリミングする必要があります。さらに、マウスは皮膚がデリケートであるため、皮膚が裂けるほどしっかりと縫合糸を結ばないように注意してください。
CSF採取後の迅速な回復のために、手術後に300μLの滅菌生理食塩水を皮下注射することをお勧めします。さらに、CSF収集の最大量を10μLに保つことも重要です。
著者は、利益相反がないことを宣言します。
国立衛生研究所はKHCにDK124619を付与します。
ニューヨーク州ロチェスター大学医学部のスタートアップ資金とパイロット研究賞をKHCに授与。
ロチェスター大学デルモンテ神経科学研究所パイロット研究賞をKHCに授与。
ニューヨーク州ロチェスター大学研究担当副学長室の大学研究賞をKHCに授与。
MURは、メソッドを設計および実行し、結果を分析して、グラフと図を作成し、原稿を作成および編集しました。KHCは研究の構想と監督、結果の分析、原稿の執筆と編集を行いました。KHCはこの作品の保証人です。すべての著者が原稿の最終版を承認した。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
Cannula holder | KOPF | 1966 | |
Centering scope | KOPF | 1915 | |
Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
Hair Clipper | WAHL | N/A | |
heating pad | Heatpax | 19520483 | |
Hemostat | N/A | N/A | |
Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
KCl | VWR | 0395-500g | |
Magnetic stand | WPI | M1 | |
Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
Metal Spatula | N/A | N/A | |
MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
Parafilm | Bemis | DM-999 | |
Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
Scalpel | N/A | N/A | |
Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
Tray | N/A | N/A |
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