Method Article
Cet article décrit un protocole détaillé pour augmenter la concentration de glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR) des souris. Cette approche peut être utile pour étudier les effets d’une glycémie élevée dans le LCR sur la neurodégénérescence, la cognition et le métabolisme périphérique du glucose chez la souris.
Le diabète augmente le risque de déclin cognitif et altère la fonction cérébrale. Que cette relation entre une glycémie élevée et des déficits cognitifs soit causale ou non reste insaisissable. De plus, on ne sait pas non plus si ces déficits sont médiés par une augmentation des taux de glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR) et / ou le sang. Il existe très peu d’études portant sur les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR sur la fonction du système nerveux central (SNC), en particulier sur l’apprentissage et la mémoire, car les modèles actuels du diabète ne sont pas suffisamment développés pour répondre à de telles questions de recherche. Cet article décrit une méthode pour augmenter chroniquement les niveaux de glucose dans le LCR pendant 4 semaines en perfusant continuellement du glucose dans le ventricule latéral à l’aide de minipompes osmotiques chez la souris. Le protocole a été validé en mesurant les niveaux de glucose dans le LCR. Ce protocole a augmenté les niveaux de glucose du LCR à ~328 mg / dL après perfusion d’une solution de glucose à 50% à un débit de 0,25 μL / h, par rapport à une concentration de glucose dans le LCR de ~ 56 mg / dL chez les souris ayant reçu du liquide céphalorachidien artificiel (aLCR). De plus, ce protocole n’a pas affecté la glycémie. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour déterminer les effets directs d’une glycémie élevée dans le LCR sur la fonction cérébrale ou une voie neuronale spécifique indépendamment des changements dans les niveaux de glucose dans le sang. Dans l’ensemble, l’approche décrite ici facilitera le développement de modèles animaux pour tester le rôle d’une glycémie élevée dans le LCR dans la médiation des caractéristiques de la maladie d’Alzheimer et / ou d’autres troubles neurodégénératifs associés au diabète.
Le diabète de type 1 et de type 2 altère les fonctions cérébrales 1,2,3. Par exemple, le diabète augmente le risque de déclin cognitif et de troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d’Alzheimer 3,4. De plus, les personnes atteintes de diabète ont une détection de glucose défectueuse dans le cerveau 5,6. Ce défaut contribue à la pathogenèse de l’hypoglycémie associée à l’inconscience et à une réponse contre-réglementaire insuffisante à l’hypoglycémie7,8, qui peut être fatale si elle n’est pas traitée immédiatement.
Étant donné que le diabète augmente le taux de glucose dans le sang ainsi que dans le liquide céphalorachidien (LCR)9, il est important de déterminer si l’un de ces facteurs ou les deux contribuent à une altération de la fonction cérébrale. La question de savoir si le diabète provoque des lésions cérébrales par une glycémie élevée dans le LCR seul ou en combinaison avec d’autres facteurs tels que la carence en insuline ou la résistance à l’insuline reste également ouverte. Les modèles animaux de diabète de type 1 et de type 2 montrent un déclin cognitif et une neurodégénérescence en plus d’un bilan énergétique affecté et d’un métabolisme périphérique du glucose10,11,12,13. Cependant, à partir de ces modèles, il n’est pas possible de dissocier les effets sélectifs d’une glycémie élevée dans le LCR par rapport à la médiation des complications du diabète sur la fonction cérébrale.
Ce protocole décrit des méthodes pour développer un modèle murin d’hyperglycorrhachie afin de tester les effets des niveaux de glucose chroniquement élevés dans le LCR sur la fonction cérébrale, l’équilibre énergétique et l’homéostasie du glucose. Le modèle murin développé grâce à cette technique présente un outil pour les études sur le rôle étiologique de l’homéostasie du glucose dérégulée sur la fonction neuronale et comportementale.
Par conséquent, l’approche proposée sera utile pour comprendre les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR dans diverses conditions physiopathologiques.
Toutes les procédures relatives aux souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Rochester et ont été effectuées conformément aux directives du Service de santé publique des États-Unis pour le soin et l’utilisation sans cruauté des animaux de laboratoire. Des souris mâles C57BL/6J âgées de six semaines utilisées pour cette étude ont été obtenues commercialement. Tous les animaux ont été logés en groupe (5 souris par cage) dans une pièce avec un cycle jour/nuit de 12 h et ont eu accès à de la nourriture et de l’eau ad libitum. Après que les souris ont été implantées avec une canule pour perfuser du glucose dans le ventricule latéral, elles ont été logées seules pour éviter tout dommage aux implants d’autres souris.
1. Assemblage de minipompes osmotiques
2. Chirurgie pour implanter des pompes osmotiques
3. Remplacement des minipompes
REMARQUE: Étant donné que les minipompes utilisées dans cette étude ne durent que 4 semaines, le remplacement des minipompes a également été testé pour prolonger la durée de la perfusion de glucose, comme cela peut être nécessaire dans le cas d’études à long terme. Cela impliquait les étapes suivantes.
4. Procédure de collecte du LCA
5. Dosage de la glycémie
6. Test de glycémie
Des souris mâles ont été implantées avec une canule assemblée à une minipompe osmotique (Figure 1) pour perfuser chroniquement un aLCR ou une solution de glucose à 50% dans leurs ventricules latéraux (Figure 2). Le LCR a été prélevé 10 jours après la chirurgie (figure 3) afin de valider l’efficacité de cette procédure. Les résultats ont montré une augmentation des taux de glucose dans le LCR (moyenne: 327,7 mg / dL) chez les souris perfusées avec 50% de glucose par rapport à celle (moyenne: 56,5 mg / dL) chez les souris perfusées avec aLCR. Il s’agit d’une augmentation d’environ six fois des taux de glucose dans le LCR chez les souris expérimentales par rapport à leurs compagnons de portée témoins (Figure 4A). Les taux de glucose sanguin n’étaient pas différents entre les groupes (figure 4B).
Figure 1 : Assemblage de minipompes osmotiques. (A) Ensemble de perfusion avec une canule reliée à une minipompe par un tube. Ces pompes nécessitent au moins 48 h pour amorcer. (B) La présence de bulles d’air à l’extérieur des minipompes confirme l’amorçage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Appareils stéréotaxiques et accessoires. (A,B) Équipement stéréotaxique muni d’un micromanipulateur et d’autres accessoires. (C) Coordonnées du trou de bavure pour insérer la canule. (D) Implantation de mini-pompe osmotique, (E,F) Insertion de la canule dans le trou foré. Maintenez des conditions d’asepsie tout au long de la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Procédure de prélèvement du liquide céphalorachidien (LCR). (A) Les muscles du cou dorsal ont été doucement déplacés avec des pinces contondantes pour exposer la citerne magna. Un capillaire de 1 mm avec une pointe de 0,5 mm de diamètre a été utilisé pour (B) rompre et (C,D) recueillir le LCR de la citerne magna. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Mesure du glucose. (A) Augmentation de la glycémie dans le LCR (B) sans affecter la glycémie non à jeun chez les souris perfusées d’une solution de glucose à 50 % dans le ventricule latéral. L’efficacité de ce protocole a été validée en mesurant le LCR et la concentration de glucose dans le sang 10 jours après le début de la perfusion de glucose. Les souris perfusées avec une solution de glucose à 50% avaient des taux de glucose dans le LCR de 327,7 ± 30,1 mg / dL (moyenne ± erreur type de moyenne) par rapport aux souris qui ont reçu une perfusion artificielle de LCR qui avait des niveaux de glucose de 56,5 ± 2,6 mg / dL. p < 0,0001, test t non apparié. Les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (n = 5). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Cet article rapporte un protocole détaillé pour augmenter la glycémie du LCR chez la souris en utilisant des minipompes osmotiques connectées à une canule implantée dans le ventricule latéral. La perfusion chronique de glucose dans le cerveau de la souris par cette procédure sera utile pour délimiter les effets de l’hyperglycorrhachie à long terme sur la cognition, le métabolisme systémique du glucose et l’équilibre énergétique et pour mieux comprendre la pathogenèse des complications du diabète.
Le diabète chronique provoque des lésions cérébrales qui interrompent la communication entre le cerveau et les organes périphériques15. Le diabète augmente également le risque de maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer 3,4. Le diabète de type 1 induit par la streptozotocine (STZ) a été le modèle standard de rongeurs dans la recherche sur le diabète16; STZ endommage les cellules β dans le pancréas, conduisant à une pathologie de type 1 semblable au diabète. De plus, dans une version modifiée, l’utilisation de STZ accompagnée de nicotinamides peut induire un diabète de type 2. Une autre façon de développer des phénotypes semblables au diabète de type 2 chez les animaux consiste à leur donner un régime richeen graisses 16. Cependant, dans le contexte de l’étude de l’effet de l’hyperglycémie sur la fonction cérébrale, ces techniques sont limitées dans le contrôle d’un grand nombre de facteurs (par exemple, les niveaux périphériques d’insuline / glucagon, et la fonction métabolique en général). Ainsi, tout effet du diabète induit par les STZ sur la fonction cérébrale ne peut être interprété que comme une complication associée, au lieu d’identifier un seul facteur étiologique. L’injection aiguë ou la perfusion chronique de substances dans l’espace cérébroventriculaire est une technique souvent utilisée pour tester leurs effets directs sur la fonction cérébrale. L’injection intrarébroventriculaire (ICV) de STZ a été utilisée pour développer un modèle rongeur de la maladie d’Alzheimer, cependant, il n’est pas certain que les dommages neuronaux associés aux STZ soient dus à une dérégulation de la détection du glucose / homéostasie ou à d’autres mécanismes indépendants, tels que le stress oxydatif induit par STZ et les dommages à l’ADN17.
Les procédures décrites dans le protocole actuel seront utiles pour développer des modèles de rongeurs qui peuvent répondre à des questions de recherche, comme si une augmentation de la concentration de glucose dans le LCR peut causer des troubles cognitifs. Le protocole décrit ici pourrait être utilisé pour déterminer les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR sur l’hypothalamus et l’hippocampe, entre autres régions du cerveau impliquées dans la détection des nutriments, le métabolisme et / ou la cognition. Cette méthode permettrait également de déterminer si une augmentation des taux de glucose dans le LCR affecte la sensibilité à l’insuline, la sécrétion d’insuline, l’apport alimentaire et / ou l’équilibre énergétique au départ et en réponse à des agressions métaboliques. De plus, le protocole rapporté ici serait applicable pour tester des hypothèses qui nécessitent des études longitudinales. Par exemple, des données pourraient être recueillies avant, pendant et à la fin des perfusions de glucose pour comparer les résultats des mêmes animaux à différents moments. Une telle stratégie permettrait de déterminer si les complications découlant d’un taux élevé de glucose dans le LCR sont réversibles après le rétablissement du taux normal de glucose dans le LCR. En revanche, la méthode pourrait également être utilisée pour des études génératrices d’hypothèses. Par exemple, le LCR pourrait être prélevé sur les mêmes animaux à différents moments et soumis à une analyse métabolomique ou protéomique pour identifier des biomarqueurs ou toute altération métabolique produite par un taux élevé de glucose dans le LCR. De même, différentes régions du cerveau pourraient être analysées par transcriptomique spatiale pour produire des informations spécifiques aux cellules qui peuvent avoir été modifiées par une glycémie élevée dans le LCR.
La raison d’être de l’injection d’aLCR sans glucose à un groupe fictif était de maintenir la concentration de glucose dans le LCR au niveau de base, de sorte que tout changement du taux de glucose dans le LCR induit par l’implantation d’une canule puisse être contrôlé naturellement. Les résultats de cette étude ont montré que le groupe fictif avait une concentration de glucose dans le LCR de ~ 60 mg / dL (~ 3 mM), ce qui se situe dans la plage de glucose normale du LCR chez la souris18. Les taux de glucose dans le LCR observés chez les personnes atteintes de diabète de type 2 sont de ~110 mg / dL ou ~ 6 mM9. Dans la présente étude, la perfusion de VCI de glucose à 50 % à un taux de 125 μg/h a élevé les taux de glucose dans le LCR à ~300 mg/dL (16 mM), ce qui est supraphysiologique19. Bien que ce niveau supraphysiologique de glucose dans le LCR puisse ne pas être cliniquement pertinent pour les niveaux observés chez les personnes atteintes de diabète de type 2, les résultats présentés dans cette étude montrent que la perfusion de glucose dans le LCR peut induire une élévation chronique de la concentration de glucose dans le LCR chez la souris.
La méthode présentée ici présente certaines limites. Il s’agit d’une chirurgie sophistiquée du cerveau de souris qui nécessite une formation, des compétences et une expérience pertinentes dans l’exécution de procédures aussi avancées. Étant donné que le cathéter et les minipompes sont implantés à long terme, des soins méticuleux des souris tout au long de l’étude sont nécessaires pour surveiller les problèmes de santé ou les dommages à l’assemblage du cathéter. Une concentration de glucose de 50 % a été choisie parce que la viscosité d’une solution au-delà de cette concentration pourrait avoir affecté la perfusion de glucose dans les ventricules. Les minipompes utilisées dans ce protocole avaient un débit de 0,25 μL / h, de sorte que le groupe de souris avec une perfusion de glucose à 50% a reçu du glucose à un débit de 125 μg / h, soit 3 mg de glucose par jour. Cette dose de glucose par unité de temps était donc limitée par le débit des minipompes.
En résumé, cet article rapporte une méthode validée pour l’augmentation chronique de la glycémie dans le LCR chez la souris. L’information obtenue à partir de ce modèle sera utile pour déterminer si et comment une augmentation de la glycémie dans le LCR est impliquée dans la médiation des complications associées au diabète, telles que les troubles neurodégénératifs, ou causant des agressions métaboliques périphériques dans le diabète et l’obésité.
Dépannage
Si le tube se détache de la canule chez les souris, une petite quantité de colle sur la connexion canule-tube peut être appliquée lors de l’assemblage de la minipompe. Si les points de suture se détachent et que la canule devient visible, la zone d’incision peut être complètement fermée à l’aide de sutures ou d’agrafes. Les ongles des pattes postérieures de la souris doivent être coupés, de sorte qu’il y ait moins de possibilité de gratter la zone chirurgicale par la souris. De plus, veillez à ne pas attacher les sutures si serrées que la peau se déchirera, car les souris ont une peau délicate.
Pour une récupération rapide après la collecte du LCR, l’injection de 300 μL de solution saline stérile par voie sous-cutanée après la chirurgie est recommandée. En outre, il est également important de maintenir le volume maximal de collecte du LCR à 10 μL.
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Subvention DK124619 des National Institutes of Health à KHC.
Fonds de démarrage et prix de recherche pilote, Département de médecine, Université de Rochester, NY, à KHC.
Le Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, Université de Rochester, à KHC.
Prix de recherche universitaire, Bureau du vice-président pour la recherche, Université de Rochester, NY, à KHC.
MUR a conçu et exécuté la méthode, analysé les résultats, préparé des graphiques et des figures, et écrit et édité le manuscrit. KHC a conçu et supervisé l’étude, analysé les résultats, écrit et édité le manuscrit. KHC est le garant de ce travail. Tous les auteurs ont approuvé la version finale du manuscrit.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
Cannula holder | KOPF | 1966 | |
Centering scope | KOPF | 1915 | |
Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
D-glucose | Sigma | G8270 | |
Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
Hair Clipper | WAHL | N/A | |
heating pad | Heatpax | 19520483 | |
Hemostat | N/A | N/A | |
Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
KCl | VWR | 0395-500g | |
Magnetic stand | WPI | M1 | |
Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
Metal Spatula | N/A | N/A | |
MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
Parafilm | Bemis | DM-999 | |
Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
Scalpel | N/A | N/A | |
Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
Tray | N/A | N/A |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
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