Hipoksi/SU5416 Modeli kullanılarak Farelerde Pulmoner Hipertansiyonun İndüksiyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, hipoksiye maruz kalma ve VEGF reseptör antagonistinin enjeksiyonuna bağlı olarak farelerde pulmoner hipertansiyonun (PH) indüksiyonunu tanımlar. Hayvanlarda protokolün başlamasından 3 hafta sonra PH ve sağ ventrikül (RV) hipertrofisi gelişir. Modelin fonksiyonel ve morfometrik karakterizasyonu da sunulmuştur.

Pulmoner Hipertansiyon (PH), sağ kalp kateterizasyonu ile değerlendirildiği gibi, istirahatte 25 mm Hg'yi aşan ortalama pulmoner arteriyel basınç ile tanımlanan patofizyolojik bir durumdur. Hastalıkların geniş bir yelpazede PH yol açabilir, onların etiyolojisi farklı, histopatoloji, klinik sunum, prognoz, ve tedaviye yanıt. Son yıllarda kayda değer ilerlemelere rağmen, PH bir hastalığı olmaya devam etmektedir. Altta yatan mekanizmaları anlamak yeni tedavilerin geliştirilmesinin önünü açabilir. Hayvan modelleri bu amaca ulaşmak için önemli araştırma araçlarıdır. Şu anda, PH recapitulating için çeşitli modeller vardır. Bu protokol, iki isabetli fare PH modelini açıklar. PH gelişimi için uyaranlar hipoksi ve SU5416 enjeksiyonu, bir vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) reseptör antagonist. Hipoksi/SU5416'nın başlamasından üç hafta sonra, hayvanlarda insan PH'sinde (ağırlıklı olarak Grup 1) gözlenen histopatolojik değişiklikleri taklit eden pulmoner vasküler remodeling gelişir. Pulmoner dolaşımda vasküler remodeling sağ ventrikül remodeling sonuçları (RV). RV basınçlarının ölçülmesi (açık göğüs yöntemi kullanılarak), RV'nin morfometrik analizleri (her iki kardiyak ventriküllerin kesişmesi ve tartılarak) ve remodelinghistolojik değerlendirmeleri (rv kardiyomiyosit hipertrofisi ve fibrozis ideğerlendirerek vasküler remodeling ve kardiyak değerlendirilerek hem pulmoner hem de kardiyak) ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokolün avantajları hem yabani tipte hem de genetiği değiştirilmiş farelerde uygulamanın imkanı, nispeten kolay ve düşük maliyetli uygulama ve ilgi hastalığının hızlı gelişimidir (3 hafta). Bu yöntemin sınırlamaları farelerde ciddi bir fenotip gelişmemesi ve NORMOKSIA'ya döndükten sonra PH'nin geri döndürülebilir olmasıdır. Önleme, hem de tedavi çalışmaları, kolayca bu modelde uygulanabilir, gelişmiş beceri gerek kalmadan (cerrahi kemirgen modelleri aksine).

Pulmoner Hipertansiyon (PH) bir patofizyolojik durumdur, ortalama pulmoner arteriyel ile tanımlanan (PA) basınç istirahatte 25 mm Hg aşan, sağ kalp kateterizasyonu ile değerlendirildiği gibi^1,2. PH yol açabilir hastalıkların çeşitli vardır. PH ile ilişkili koşulları düzenlemek amacıyla çeşitli sınıflandırma sistemleri geliştirilmiştir. Mevcut klinik sınıflandırma 5 farklı grupta birden fazla PH ilişkili hastalıkları kategorize^1. Çeşitli hasta gruplarının klinik bulguları, patolojisi, prognozu ve tedaviye yanıtı farklı hastalıklara sahip olması nedeniyle bu ayrım önem taşımaktadır². Tablo 1, her hastalığın temel histopatolojik özellikleri ile tamamlanan mevcut sınıflandırmayı özetler.

Tablo 1: PH'nin klinik sınıflandırılmasına genel bakış ve gruplar daki ana histopatolojik özellikler. PH modellemeiçin Hipoksi/SU5416 protokolünün uygunluğu. Bu tablo^19'dandeğiştirildi. PH: Pulmoner Hipertansiyon, PAH: Pulmoner Arteriyel Hipertansiyon

PH ile ilişkili hastalıkların tedavisinde önemli gelişmelere rağmen, PH hala bir tedavi olmadan kalır, 3 yıllık mortalite oranı arasında değişen ile 20% ve 80%^3. Bu PH altta yatan mekanizmaları anlamak için zorunlu ihtiyaç gösterir ve bundan sonra, önlemek için yeni tedavilerin geliştirilmesi, ilerlemesini yavaşlatmak, ve hastalığı tedavi. Hayvan modelleri bu kapsamda hayati önem taşımaktadır. Şu anda, ph çalışmak için çeşitli modeller mevcuttur. İlgilenen okuyucu bu konuda mükemmel değerlendirmeleri sevk^{edilir 2,3,4}. PH'ye yol açan hastalıkların çeşitliliğini göz önünde bulundurarak, insan PH'sinin çeşitli koşullarının tek bir hayvan modelinde mükemmel bir şekilde özetlenemez olduğu açıktır. Mevcut hayvan modelleri kategorize edilebilir i) tek vuruşlu, ii) iki isabet, iii) nakavt, ve iv) overexpression modelleri³. Tek vuruşlu modellerde, PH tek bir patolojik uyarıcı tarafından indüklenir, iki isabetli modeller daha şiddetli PH indükleme ve böylece daha yakından karmaşık insan hastalığı taklit amacı ile iki patolojik uyaranları birleştirmek ise. Etyolojik farklılıkların yanı sıra, çeşitli uyaranlar ph modelleme farklılıkları ile sonuçlanır ve bu da türlerine ve hayvanların genetik arka planına bağlıdır^4.

En sık kullanılan klasik PH kemirgen modellerinden biri kronik hipoksi modeli^2. Hipoksi insanlarda PH yanı sıra çeşitli hayvan türlerinde neden olduğu bilinmektedir. Hipoksi PH için fizyolojik bir uyarıcı olma avantajına sahiptir(Tablo 1). Ancak, kemirgenlerde PH indüklemek için kullanılan hipoksi derecesi insanlarda çok daha şiddetli iken, tek hakaret (hipoksi) vasküler remodeling sadece hafif bir formu yol açar. Bu insan hastalığının şiddetini taklit etmez. İkinci bir hit eklenmesi, PH indükleyen için ekstra bir uyarıcı, umut verici sonuçlar gösterdi: hipoksik uyarıcı ile birlikte kemirgenler için bileşik SU5416 enjeksiyonu daha şiddetli PH fenotip 2,^2,5,6neden olur . SU5416 vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) reseptör-2 inhibitörüdür. VEGF reseptörlerini bloke eder ve endotel hücreli apoptosise yol açar. Hipoksik koşullar altında, bu apoptoza dirençli endotel hücrelerinin bir alt kümesinin çoğalmasını uyarır. Ayrıca, SU5416 düz kas hücresi çoğalması yol açar. Bu etkilerin kombinasyonu pulmoner dolaşımın patolojik vasküler remodeling sonuçları ve yüksek PA basınç ve sağ ventrikül remodeling yol açar^2,5,7. Model ilk sıçanlarda tarif edildi⁶ ve daha sonra farelere uygulanan^4,5,7. Fare modeli sıçanlara göre daha az şiddetli vasküler remodeling sergiler. Ayrıca, normoksia geri döndüğünde, PH sıçanlarda ilerlemeye devam ederken, farelerde kısmen geri dönüşümlüdür.

Aşağıdaki protokol, Hypoxia/SU5416 yöntemini (planlama, zaman çizelgesi, yürütme) kullanarak farelerde PH modellemesi için tüm adımları açıklar. Ayrıca, modelin karakterizasyonu bu protokolde açıklanmıştır: fonksiyonel (açık göğüs tekniği kullanılarak sağ ventrikül (RV) basıncının invaziv olarak ölçülmesi), morfometrik (sağ ve sol ventriküllerin hem diseksiyonu hem de tartılması ile), histolojik olarak (pulmoner vasküler remodeling, sağ ventrikül kardiyomiyosit hipertrofisi ve fibrozis değerlendirilerek).

Bu protokolde açıklanan tüm adımlar ve yöntemler herhangi bir deneyim düzeyinde araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilir. Açık göğüs tekniğini kullanarak RV fonksiyonel ölçümleri (burada açıklanan) alanında altın standart yöntem olmasa da, hızlı bir şekilde öğrenilebilir ve doğru bir daha az deneyimli deneyci tarafından çoğaltılabilir avantajı vardır.

Herhangi bir hayvan deneyi öncesinde yerel kurumsal hayvan bakım komitesi izni alın. Mevcut deneyler, Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı alındıktan sonra yapılmıştır.

1. PH indüksiyonu

1. Hazırlık
   1. Çalışmaya başlamadan önce, deneysel tasarımı dikkatlice planlayın. Farelerin ilk SU5416 enjeksiyonu ile aynı anda hipoksiye maruz kaldığından emin olun. Hypoxia/SU5416 yöntemikullanılarak PH'yi indükleyen deneysel tasarımın bir örneği Şekil 1A'dagösterilmiştir. Kontrol fareleri sadece araç aldı. Bu model için, SU5416 farelere haftada bir kez 3 hafta üst üste enjekte edilecektir.
   2. Bu çalışma için sekiz ila on iki haftalık C57BL/6 fare kullanın. Hayvanları 18-20 °C'de 12-h açık-koyu bir döngü içinde barındırır. Gıda ve su reklam libitumerişilebilir olduğundan emin olun.
   3. Hayvanları tart. Normoksi ve Hipoksi/SU5416: Her gruba rasgele atamak.
   4. Şekil 1₂B'de gösterildiği gibi hipoksik hazneyi hazırlayın. Oksijen (O₂₎denetleyicisini %10 O_2'yeayarlayın. Sistemin sabit bir duruma ulaşmasına izin verin.
   5. SU5416'yı enjeksiyoniçin hazırlayın (20 mg/kg vücut ağırlığı kullanın). SU5416 sulu çözeltilerde çözünmez; bu nedenle, hesaplanan miktarı 100 μL DMSO^8'deçözün. Örneğin, 25 g'lık bir fare için enjekte edilecek SU5416 miktarı 100 μL çözücüde (DMSO) çözünmüş 0,5 mg'dır. Bu fare için SU5416 son konsantrasyonu, bu nedenle, 5 mg / mL.
      DİkKAT: SU5416 tehlikeli bir maddedir. Ürün le birlikte Güvenlik Veri Sayfasını dikkatle okuyun ve bu maddeyi kullanırken önerilen önlemleri aldığından emin olun. Koruyucu eldiven giyin ve (herhangi bir enjeksiyon için olduğu gibi) göz koruması kullanın. SU5416'nın kimyasal yapısı Şekil 1C'de gösterilmiştir.
      NOT: Enjeksiyon sırasında kaybedilecek hacmi telafi etmek için çözeltinin uygun bir fazlalığını hesaplayın (örn. şırınga, şişe vb.) Kullanılan şırıngaya bağlı olarak ölü hacmi yaklaşık 200 μL'dir. 10 fareden oluşan bir grup için, 2 fare dozunun fazlaolduğunu hesaplayın.
   6. Şırıngaları enjeksiyoniçin hazırlayın. 25 G x 5/8" iğneli 1 mL şırınga kullanın.
2. SU5416 deri altı enjeksiyon
   1. Hayvanı dizginle. Kısıtlamaya yardımcı olmak için fareyi kafesin kapağına yerleştirin. Deriyi tutun ve omurgaya paralel bir çadır kurun. Fare nin olası ısırık yaralanmasını önlemek için başın arkasına sıkıca tutunun.
      NOT: İki araştırmacının varlığı, diğeri enjeksiyonu gerçekleştirirken, biri hayvanı tutabildiği için prosedürü daha hızlı ve daha doğru hale getirir.
   2. İğneyi deri kıvrımına yan tarafa deri altına yerleştirin. İğneyi cilde paralel olarak taktığından emin olun. Karın duvarına girmekten kaçının.
   3. Şırınganın içeriğini enjekte edin (100 μL çözünmüş SU5416 veya araç).
      NOT: Tam doğumdan sonra sızıntıyı önlemek için şırıngayı yaklaşık 10 s tutun ve iğneyi derinin altında hafifçe döndürün.
   4. İğneyi geri çekin ve hayvanı kafesine geri getirin. SU5416 enjeksiyonundan sonra kafesleri havalandırmalı hipoksi odasına yerleştirin.
3. Hipoksiye maruz kalma
   1. Zaman içinde havalandırmayı izleyin. Oksijen kaynağının %10'una kadar korunun. Normoksia hayvanlarını yarı kapatılabilir bir odada %21 O_2'demuhafaza edin.
   2. Odaların oksijen seviyesini ölçmek için bir oksijen sensörü ile donatılmış olduğundan emin olun. Odaların kapsamlı açılmasından kaçının. Temizlik ve gıda ve su eklemek için en fazla 20 dk her 3 günde bir odaları açın.
   3. Hayvanları her gün inceleyin. Piloerection veya önemli kilo kaybı gibi stres sinyalleri düşünün.
      NOT: Hipoksi/SU5416 altındaki hayvanların⁵kilo vermesi beklenmektedir. Bu hastalık gelişiminin bir göstergesidir.
   4. Art arda 3 hafta boyunca haftalık SU5416 enjeksiyonu tekrarlayın (deneysel tasarımın genel görünümü için Şekil 1A'ya bakın).
      NOT: Enjeksiyon yeri değişen cilt tahrişleri azaltmaya yardımcı olabilir.

2. İnvaziv RV basınç ölçümleri ile fonksiyonel karakterizasyon

1. Hazırlık
   NOT: Bir anestezi rejimi seçin. Enjektabl veya solunabilir anestezikler kullanılabilir. Enjekte edilebilir anesteziklerin hafif bir aşırı doz (özellikle ketamin / ksilazin veya pentobarbital) önemli ölçüde kalp fonksiyonunu etkileyebilir beri, uçucu anesteziklerin kullanımı tavsiye edilir. Bir çalışmada tüm fareler için aynı anestezik kullanmak büyük önem taşımaktadır.
   1. Hayvan başına doğru bir anestezi dozu sağlamak için bir buharlaştırıcı kullanın. Isofluran için doz aşağıdaki gibidir: indüksiyon 3-4%, bakım 1% 100 oksijen ile karıştırılır.
      NOT: Kişisel koruyucu ekipman takın ve buharı solumaktan kaçının.
   2. Vücut ısısını korumak için ısıtma yastığı ve/veya ısıtma lambaları hazırlayın. Vücut ısısını izlemek için bir rektal sıcaklık sondası hazırlayın.
   3. Uygun havalandırmayı sağlayın. Ventilatöre önceden hazırlayın. Y-tüp konektörünü hazırlayın ve manuel modu kullanarak ventilatörün işlevini kontrol edin. Barotravmayı önlemek için inspiratuar basıncın <1 cm H₂O olduğundan emin olun. Solunum hızını 110 nefes/dk olarak ayarlayın.
   4. 20 G intravasküler kateteri keserek endotrakeal tüp hazırlayın.
   5. Gerekli aletleri hazırlayın: küçük çalgılar, makas, elastik kanca retraktörleri, damar kapterizerve pamuklu bezler. Bir pamuk lu bez üzerinde sağ ventrikül küçük bir delinme yapmak için kullanılacak küçük bir 25 G x 5 /8 " iğne ayarlayın.
   6. Basınç Kateterini, Basınç Hacmi Kontrol Ünitesini hazırlayın ve veri toplama yazılımını başlatın. PV Kateterini 37 °C'de PBS ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe 15 dakika süreyle yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre kalibre edin.
   7. Organların perfüzyonu ve fiksasyonu için PBS ve %50 PBS / %50 EKIM bir çözelti hazırlayın. 2 x 10 mL şırınga (25 G iğne ile) hazırlayın: biri kalp ve akciğeri Yerinde PBS ile perfüzyoniçin, ikincisi ise okt/ PBS (50/50) çözeltisinin incelenmesinde kullanılacak olan akciğere enjekte etmek için kullanılacaktır.
2. Entübasyon
   1. Fareyi tartın ve anesteziden önce sağlık durumunu kaydedin.
   2. % 3-4 isofluran ile anestezi indüklemek. Ayak ucurrefleksini test ederek anestezi derinliğini kontrol edin: uzuvlardan birinin ayak ayak parmaklarını sıkıca çimdikleyin. Eğer hayvan uzvunu geri çekerse, bu yetersiz anestezinin bir işaretidir.
   3. Anestezi indüksiyonundan sonra boyun ve göğüs bölgelerini tıraş edin.
   4. Fareyi ısıtma yastığına yerleştirin. Vücut ısısını izlemek için rektal sıcaklık sondası yerleştirin.
      NOT: Vücut ısısının bakımı fonksiyonel ölçümler için önemlidir. Vücut ısısı yaklaşık 36.5-37 °C olmalıdır.
   5. Kavisli forceps kullanarak farenin üst kesici dişleri ne bir dikiş iplik eklemek, germek ve cerrahi bant ile ısıtma yastığı düzeltmek. Cerrahi bantlar kullanarak farenin uzuvlarını sabitleyin.
   6. Hayvan entübe için küçük makas kullanarak medial servikal deride yaklaşık 1 cm küçük bir kesi yapmak.
      NOT: Oral entübasyon daha fazla deneyim gerektiren alternatif bir yöntemdir.
   7. Pamuk uçlu aplikatör ile orta düzeyde parotis ve submandibular tükürük bezleri ayrı. Bu nefes borusu örten kasları ortaya çıkaracaktır.
   8. Nefes borusuna maruz kalan bu kasları dikkatlice kesin.
   9. Küçük makas ile trakeal kıkırdaklar arasında küçük bir kesi yapmak ve hazırlanan endotrakeal tüp eklemek. İntravasküler kateterin metal rehberini çıkar.
   10. Kateteri ventilatöre bağlayın. Akciğerleri elle hafifçe şişirerek trakeal tüp pozisyonunu doğrulayın. Pozisyonu bantla sabitleyin.
   11. İşlem boyunca %1 isofluran anestezisi uygulayın.
   12. Ayak ucurrefleksini test ederek anestezinin derinliğini düzenli olarak izleyin. Anesteziyi buna göre ayarlayın.
       NOT: Deneyler sırasında önerilen kalp hızı, altında 1% isofluran anestezi, yaklaşık 400 atım / dk. Vücut ısısı ve anestezi bakımı kalp hızını kontrol etmek için gereklidir. Isofluran fazlakalp hızını azaltabilir. Ancak, iyileşme izofluran oranı azaltarak elde edilebilir.
3. RV basınç ölçümleri (açık göğüs yaklaşımı)
   1. Küçük makas ile ksifoid süreci ve üst karın kısmı üzerinde yaklaşık 1 cm bir deri kesi yapmak. Üst karın kadranda göğüs ve karın duvarı kapsayan cilt ayırın: orta çizgide başlar, ksifoid distal ve dikkatle her iki tarafta yanal hareket. Kanamayı kontrol etmek için termokoter kullanın.
      NOT: Amaç karın duvarından göğüs boşluğuna erişebilmektir.
   2. Karın boşluğu açın ve dikkatle diyafram kesti, atan kalp veya akciğerlerzarar değil dikkat.
      NOT: Amaç kalbin apeks ve sağ ventrikül ortaya çıkarmaktır. İyi pozlama ve kalbin görünümü kateterin doğru yerleştirilmesi için çok önemlidir. İşlem boyunca kanamayı önlemek büyük önem taşımaktadır. İntravasal hacimdeki küçük değişiklikler bile sağ kalbin yükünü değiştirebilir ve kaydedilen parametreleri etkileyebilir.
   3. Pamuk uçlu aplikatör kullanarak perikard'ı hafifçe çıkarın.
   4. Basınç kateterini kalbe yerleştirmeden hemen önce kateteri farenin yanına getirin.
   5. İğne ile hazırlanan pamuk uçlu aplikatör kullanarak sağ ventrikül apikal distal kısmında bir bıçak yarası yapar. İğneyi dikkatlice çıkarın ve basınç kateterini bu deliğe takın.
      NOT: Bu güç uygulamadan çalışması gerekir. Bu mümkün değilse, kalbin uzun süreli yaralanmasını önlemek için ilkinin yakınında yeni bir delik yapmayı deneyin. İğne yaklaşık 3 mm'den daha derine yerleştirilmemelidir.
   6. Basınç kateterini sağ ventrikül yönüne paralel olarak yerleştirin ve ucu pulmoner artere bakacak şekilde yerleştirin.
   7. Kateterin doğru konumlandırIlmesini sağlamak için basınç dalgasının izini izleyin. Temsili izlemeler Şekil 2'degösterilmiştir.
   8. Basınç sinyalinin sabitlenmesine izin verin. Solunumu duraklatın ve en az 3 ölçüm alın. Bireysel ölçümler arasında hayvan Havalandırılabilir sağlar.
   9. Tüm ölçümler kaydedildikten sonra kateteri çıkarın ve su banyosundaki PBS dolu tüpe geri yerleştirin.
      NOT: Deney tamamlandıktan sonra kateteri üreticinin talimatlarına göre temizleyin.
4. Ötenazi ve akciğer perfüzyonu
   1. Deney tamamlandıktan sonra exsanguination tarafından fare ötenazi.
   2. Göğsü geniş bir şekilde aç. Makas kullanarak, tüm göğüs kesme ve kalp veya akciğerlerzarar değil dikkat edin.
   3. Iris makas kullanarak kan odası terk etmek için izin vermek için sol ventrikül küçük bir kesi yapar.
   4. 10 mL PBS içeren şırınganın 25 G iğnesini sağ ventrikülün altına yerleştirin ve akciğerler kandan temizlenene kadar PBS çözeltisini enjekte edin.
   5. Bu adım tamamlandıktan sonra, hayati doku hasat (kalp ve akciğerler) tarafından ötanazi onaylamak: kava ve aort ekleri kesmek ve kalp ve akciğerler en blokkaldırmak .

3. Morfometrik karakterizasyon

1. Kalp ve akciğerleri çıkardıktan hemen sonra (Adım 2.4.5), kalbi izole edin ve her iki atria çıkarın. Kavisli tenotomi makasile sağ ventrikül (RV) sol ventrikülden (RV) dikkatlice inceleyerek septum (S) sol ventrikülile birlikte bırakılır. RV ve LV+S'yi tartın ve Fulton indeksini= RV/LV+ S(Şekil 3)^5,9'uhesaplayın.
2. Sağ ventrikül bir parçası alın ve bir OCT önceden doldurulmuş katıştırma kalıp yerleştirin. RNA ve/veya protein analizi için sağ ventrikülün diğer kısmını kullanın. Kuru buzda kırışve -80 °C'de saklayın.
3. Kalp ve diğer kalan doku akciğerleri izole etmek için iris makas kullanın.
   NOT: Akciğerlerin hazırlanmasında yukarıda açıklandığı gibi perfüzyon (Adımlar 2.4.3-2.4.5) büyük önem taşımaktadır.
4. Snap akciğerlerin bir kısmını dondurun ve RNA, protein çıkarma veya diğer tahliller için saklayın.
5. Histolojik analiz için akciğerlerin diğer kısmını kullanın. Bu amaçla, kullanılan lob 10 bir bronş% 50 PBS ve% 50 OCT içeren şırınga takın^10,11. Deneyci şırınganın içeriği dokuya nüfuz edildiğinde akciğerin şişkin olduğunu kolayca görebilir.
6. Bu akciğer parçalarını OCT ile önceden doldurulmuş kalıplara yerleştirin ve kuru buzda çabuk dondurun. Numuneleri dondurulduktan sonra -80 °C'de saklayın.
7. Bir kriyostat makinesi kullanarak 8 μm rv ve akciğer bölümleri hazırlayın. Hava 30 dakika oda sıcaklığında bölümleri kurutun.
8. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %10 paraformaldehit (PFA) kullanarak düzeltin.
   NOT: PFA bilinen bir insan karsinojendir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için Malzeme Güvenliği Veri Formu'na (MSDS) bakın.
9. Hematoksilin/Eozin boyama ile vasküler remodeling değerlendirmesi
   Not: Akciğerde kalp ve vasküler remodeling yapısal değişiklikleri değerlendirmek için Hematoksilin / Eosin boyama gerçekleştirin (Şekil 3).
   1. 8 dakika hematoksilin çözeltisi ile leke.
   2. 5 dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın ve ardından distile suda hızlı bir durulama.
   3. 1 dk için %95 EtOH'u durulayın ve 1 dk boyunca Eosin çözeltisinde karşı lekesi layın.
   4. Dehidrat (%80 Etanol 10-30 s, 1 dk için 100 Etanol ve 3 dk için % 100 Toluol).
   5. Monte edin ve bir kapak ile kaplayın. Slaytları oda sıcaklığında bir gecede kurulayın.
      NOT: Boyama için kullanılan çözeltiler tehlikeli olabilir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için MSDS'ye başvurun.
10. Picrosirius Kırmızı Boyama ile sağ ventrikül fibrozis değerlendirmesi
    NOT: Picrosirius Kırmızı Boyama, Picrosirius Kırmızı, asit, kollajen^{bağlanır 12}. Bu nedenle, bu boyama kollajen içeriğinin histolojik incelemesi için kullanılabilir.
    1. Slaytları önceden ısıtılmış bir Bouin's Solution'da 58 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. 10-15 dakika boyunca bölümlerden sarı renk kaldırmak için akan musluk suyunda slaytlar yıkayın.
    3. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca % 0.1 Hızlı Yeşil leke.
    4. 1 dakika boyunca % 1 Asetik Asit durular.
    5. 5 dakika musluk suyunda durulayın.
    6. Oda sıcaklığında 30 dakika sirius kırmızı% 0.1 leke Toluol dehidratasyon izledi.
       DİkKAT: Boyama için kullanılan çözeltiler tehlikeli olabilir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için MSDS'ye başvurun.
11. WGA Boyama ile RV kardiyomiyosit hipertrofisi değerlendirmesi
    NOT: Sağ ventrikülhipertrofisi (RV) hücresel düzeyde buğday germ agglutinin (WGA) boyama gerçekleştirerek değerlendirilebilir(Şekil 4).
    1. 15 dakika soğuk Aseton çözeltisi slaytlar ve PBS (5 dakika her) yıkama 3 adım takip slaytlar düzeltin.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika dada çözeltisinde %10 keçi serumu ile blok.
    3. WGA ile slaytları kuluçkaya yatırın: WGA 1:200 ekleyin ve karanlıkta 37 °C'de 1 1/2 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın.
    5. Bir nükleik asit boya ile slaytlar kuluçka.
    6. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın.
    7. Montaj için, sıvı fazlalığını çıkarın ve montaj ortamı ve bir coverslip uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca slaytları kurutun ve 4 °C'de saklayın.
       NOT: Boyama için kullanılan çözeltiler tehlikeli olabilir. Kimyasal bir duman başlığı, uygun prosedürler ve kişisel koruyucu ekipman lar kullanarak maruz kalma riskini azaltın. Daha fazla bilgi için MSDS'ye başvurun.
12. Daha fazla ve özellikle vasküler remodeling değerlendirmek için akciğer immünokimya gerçekleştirin. Örneğin, düz kas hücre boyama damarların kasizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilirken, von Willebrand Factor boyama endotel değişiklikleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntemler^başkabir yerde 5 açıklanmıştır.

Bu protokolde, farelerde PH'yi indükleyen Hypoxia/SU5416 modelinin oluşturulmasını ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Ayrıca, gözlem süresi nin sonunda pulmoner vasküler ve kardiyak değerlendirme nin yapılması için gerekli tüm adımları ayrıntılı olarak belirtmektedir.

Bu model için deneysel tasarıma genel bir bakış Şekil 1A^13,14'tegösterilmiştir. Fareler normobarik hipoksiye maruz kalınır (10% O₂) ve subkutan su5416 ile haftada bir kez enjekte üç ardışık hafta boyunca. Bu protokolde PH'i indüklemek için kullanılan uyaranlar Şekil 1Bve 1C'degösterilmiştir.

VEGF reseptör antagonistSU5416 endotel hücreli apoptoza neden olarak hareket eder ve bu nedenle, apoptoza dirençli-endotel hücrelerinin çoğalmasına izin verir. Bu pulmoner vaskülatürde vasküler remodeling ve artmış vasküler direnç yol açar⁵. Pulmoner dolaşımdaki yüksek basınç RV yükünü arttırır ve rv disfonksiyonu ve yetmezliğine giderek daha fazla yol açar⁹. İlk adımda, Hipoksi/SU5416 protokolünün başarısı gözlem döneminin sonunda RV fonksiyonunun fonksiyonel olarak değerlendirilmesi ile değerlendirilebilir. Bu protokolde, açık göğüs RV basınç ölçüm yöntemi kullanılarak RV sistolik basıncın invaziv değerlendirmesini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Temsili basınç eğrileri ve sağ ventrikül basıncının nicel analizi Şekil 2'degösterilmiştir.

Vasküler remodeling nasıl ölçebiliriz, bu da yüksek vasküler direnç ve dolayısıyla PH'ye yol açar? Histomorfometri pulmoner vaskülatür karakterize altın standarttır. Bu protokolde Hematoksilin & Eozin Boyama (H&E) protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Görüntüleri boyandıktan ve yakaladıktan sonra pulmoner arterler küçük (<50 μm) ve daha büyük (> 50 μm) olarak ayırt edilebilir. Bronşiyal arterler çalışmamızda dışlandı. Medial kalınlığı değerlendirmek için, dış (ED), yanı sıra iç çapı (ID) arterlerin, ölçülür. Hipoksi/SU5416 tedavisinden sonra remodele edilmiş pulmoner arterlerin temsili görüntüleri Şekil 3A'dagösterilmiştir. Kesit çapına göre medial kalınlıktaki arterlerin yüzdesi Şekil 3B'degösterilmiştir . Distal pulmoner arterlerin morfometrik analizi, hipoksi/SU5416 tedavi görmüş farelerde normoksia hayvanlarına göre medial kalınlıkta anlamlı bir artış olduğunu göstermektedir(Şekil 3).

Artan afterload RV hipertrofisi yol açar ve hastalık RV fibrozis ilerledikçe^9,15. RV hipertrofisi Fulton İndeksi (RV/LV+Septum) ölçümü ve kardiyomiyosit (CM) hipertrofisi ölçülerek morfometrik olarak değerlendirilebilir. Sağ ventrikül (RV) sol ventrikül (LV) artı septum [RV/(LV+S)] ağırlık oranı sağ ventrikül hipertrofisi indeksi olarak hesaplanır. Hipoksi/SU5416'daki Fulton İndeksve normoksia farelerinin temsili sonuçları Şekil 4B'degösterilmiştir. CM hipertrofisinin değerlendirilmesinde burada açıklanan yöntem, sağ ventrikül kesitlerinin Buğday Germ Agglutinin (WGA) ile boyanıdır. WGA hücre zarının glikoproteinlere bağlanır ve miyositkesin kesit alanını belirlemek için kullanılabilir^16,17. WGA ile boyanmış sağ ventriküler bölümlerin temsili görüntüleri Şekil 4A'dagösterilmiştir. Hem hastalıklı hem de kontrol edilen farelerde CM alanının nicellikleri Şekil 4A. Hipoksi/SU5416 maruziyeti kardiyomiyosit boyutu nda belirgin bir artış ve sağ ventrikül hipertrofisi ile gösterilmiştir(Şekil 4). Biz ve diğerleri daha önce göstermiştir ki, tek isabet ile karşılaştırıldığında (sadece hipoksi), Hypoxia/SU5416 RV fenotip^{ağırlaştırAn 5,18}.

Şekil 1: Hipoksi/SU5416 yöntemine genel bakış. (A) Hypoxia/SU5416 fare modeli için deneysel tasarım. SU5416 haftada bir kez üst üste 3 hafta deri altına enjekte edilir. (B) Hipoksi sisteminin şematik gösterimi. Denetleyici, gaz infüzyon tüpünden azot aşılayarak oda içindeki oksijeni algılar ve düzenler. (C) SU5416'nın kimyasal yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Su5416 enjeksiyonu ile birlikte kronik hipoksiye maruz kalan farelerde sağ ventrikül basıncı. (A) Sağ ventrikülin invaziv basınç ölçümlerinin (RV) temsilcisi dürbünler. (B) Hipoksi/SU5416 farelerinde rv sistolik basınç ve normoksia maruz kalan hayvanları kontrol. n = Grup başına 6-8 fare. p < 0.001. Tüm nicel veriler sem ± anlamına gelir olarak rapor edilir.

Şekil 3: Hipoksi/SU5416 pulmoner vasküler remodelasyona neden olur. (A) Belirtilen gruplardan akciğerlerin Temsilcisi Hematoksilin/Eozin lekeli bölümleri Hipoksi/SU5416 farelerin pulmoner arterlerinde media duvar kalınlığının arttığını göstermektedir. Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) Kesit çapına göre medial kalınlıkta arterlerin yüzdesi. n = Grup başına 5 fare. p < 0.001. Tüm nicel veriler sem ± anlamına gelir olarak rapor edilir.

Şekil 4: Kronik hipoksiye maruz kalan farelerde sağ ventrikül hipertrofisi SU5416 enjeksiyonu ile birlikte. (A) (Sol) Temsilcisi WGA (Buğday Mikrop Agglutinin) belirtilen tedavi sonrası sağ ventrikül dokusunun boyanması. Ölçek çubuğu: 50 μm. (Sağ) Verilerin nicel analizi. n = Grup başına 5 fare. (B) Her grupta LV artı interventriküler septum (S) ağırlık oranı (Fulton indeksi= RV/LV+ S) üzerinden RV ağırlığı ile yansıyan RV hipertrofisi. n = Grup başına 8 fare. p < 0.001. Tüm nicel veriler sem ± anlamına gelir olarak rapor edilir.

Bu protokol, farelerde PH modelinin iki patolojik uyaranla nasıl modellendirilebildiğini açıklar: kronik hipoksi ve SU5416 enjeksiyonu (Hypoxia/SU5416)¹⁸. Bu fare modelini insan PH durumuyla ilişkilendirmek amacıyla, kaçınılmaz olarak Tablo 1'degösterilen mevcut PH sınıflandırmasına bakmak gerekir. Ph hemen hemen tüm formlarda pulmoner vazokonstriksiyon ve endotel ve düz kas hücrelerinin anormal proliferasyonu ile karakterizedir. Bu pulmoner arterlerde yüksek basınç ve sonuç olarak sağ ventrikül artan afterload yol açar.

PH bir hayvan modeli karakterize etmek için her girişim pulmoner vaskülatür ve sağ ventrikül histopatolojik remodeling kanıt içermelidir. Tek isabetli hipoksi fare modeli vaskülatür remodeling hafif bir formu yol açar^2,3. Bu patolojik bulgular arasında daha önce kaslı olmayan damarların kaslaşması, endotel hücresi, düz kas hücresi ve fibroblast proliferasyonu sayılabilir. Bu bulgular ikinci vuruş (SU5416 enjeksiyonu) eklenmesi ile ağırlaştırılmış. Etkileri tek isabetli (hipoksi) modelinde geri döndürülebilir ve Hipoksi/SU5416 modelinde sadece kısmen geri dönüşümlüdür.

PH hastaları için ana ölüm nedeni sağ ventrikül yetmezliği (RVF)^4,20. Hayvan modellerinde pulmoner vasküler remodeling her zaman RVF eşlik etmez. Bir hayvan modelini RVF morfolojik olarak karakterize etmek için fonksiyonel ve moleküler veriler analiz edilmelidir. İkincisi bu protokolün kapsamı dışındadır. RV morfolojik remodeling hem makro- hem de mikroskobik yönlerini içerir. Makroskopik düzeyde, RV hipertrofisi için ana indeks Fulton indeksi, sol ventrikül (LV) ve Septum (S) ağırlığı (RV/ LV +S) ile bölünmüş RV ağırlığı olarak tanımlanır. Mikroskopik düzeyde sırasıyla Sirius kırmızısı, Hematoksilin/Eosin ve WGA boyama ile fibrozis, inflamasyon ve hipertrofi değerlendirilebilir.

Fare Hypoxia/SU5146 modeli (burada açıklanan) yüksek sistolik basınçlar ve morfolojik kriterler ile ölçülen bir RV disfonksiyonu gösterir. Pulmoner vasküler remodeling ile ilgili olarak, medial hipertrofi protokolün başlamasından üç hafta sonra gözlenir. Sıçanlarda Hipoksi/SU5416 modeli ile karşılaştırıldığında, fare modeli RV Yetmezliğine (sadece orta derecede disfonksiyon) neden olmaz, ağır hastalıklı insanlarda gözlenen şiddetli obliteratif anjiyopatiye yol açmaz ve normoksia döndükten sonra pulmoner patoloji iyileştirir. Genel olarak, fare Hypoxia/SU5416 modeli PH karşılaşılan vasküler yaralanma taklit için uygundur, ağırlıklı olarak Grup I (kısmen Grup III, Tablo 1bakınız )^1,19. Bu modelin avantajı yabani tip uygulama (genetiği değiştirilmemiş) fareler, nispeten kolay ve düşük maliyetli uygulama, hastalıklı hayvanların nispeten düşük mortalite, ve ilgi hastalığının hızlı gelişimi (3 hafta). Ph önleme ve tedavi çalışmaları cerrahi kemirgen modellerinin aksine ileri becerilere ihtiyaç dilmeden bu modelde kolaylıkla uygulanabilir.

Protokolü uygularken akılda tutulması gereken bazı kritik adımlar vardır. Çalışmayı planlarken, Hypoxia/SU5416 grubunda hayvanların mortalitesinin %0-10 arasında değiştiği unutulmamalıdır (yayınlanmamış gözlemler). Bu nedenle, istatistiksel güce ulaşmak ve yetersiz çalışmalardan kaçınmak için grup başına en az 10 fare önerilmektedir. SU5416'nın çözünürlüğü düşüktür. Bu nedenle, DMSO veya başka bir çözücü (örneğin Karboksimetil selüloz, CMC) kullanılmalıdır. Yüksek dozlarda DMSO toksik olabilir. Farelerde deri altı (s.c.) kullanımı için LD_50'nin 13,9 - 25,6 g/kg^21,22olduğu bildirilmiştir. LD₅₀ belirli bir test süresi^{21, 22,22}sonra test edilen nüfusun üyelerinin% 50 öldürmek için gerekli doz olarak tanımlanır. 25 g ağırlığındaki bir fare için 4,4 g/Kg DMSO kullanılır (DMSO yoğunluğu 1.1 g/mL ve 0.1 mL uygulanan s.c./fare bazlı hesaplamalar). Bu nedenle, deri altı verilen doz LD çok daha düşüktür₅₀ değeri. Elimizde, Burada açıklandığı gibi DMSO'da çözünmüş SU5416 uygulaması bazı durumlarda cilt tahrişine neden olabilir, ancak başka toksik etki gözlenmez. Ancak, çeşitli raporlar SU5416¹⁴alternatif bir araç olarak CMC kullanılmasını öneririz. RV fonksiyonel ölçümleri yaparken, fare refleksleri test edilerek değerlendirildiği gibi vücut ısısı, kanama ve anestezi derinliğine yakın dikkat edilmelidir. RV basıncını değerlendirmek için açık göğüs tekniği, burada açıklandığı gibi, deneyimsiz bir kullanıcı tarafından bile kolayca uygulanabilme avantajına sahiptir. Kapalı göğüs yöntemi (başka bir yerde açıklanan^23,24,25) daha az invaziv olma avantajına sahiptir ve bu nedenle, terminal dışı deneylerde de uygulanabilir. Bu uzmanlık yüksek düzeyde olsa gerektirir.

Sıçanlarda Hypoxia/SU5416 modelinin ilk açıklamasından sonra, fare modeli başarıyla çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır^5,9,13. Ancak, sonuçlar genetik arka plan ve farelerin cinsiyet, SU5416 üreticisi ve SU5416 enjeksiyon²⁶sıklığı bağlı kanıtlar vardır. Üç hafta boyunca SU5416 enjekte farelerde PH yol açar iken, tek bir doz PH neden olmaz⁴. Ayrıca, ph diğer formları, sol kalp hastalığı ile ilişkili olanlar veya kronik tromboembolik hastalık nedeniyle, etiyoloji ile ilgili modeller gerektirir. Yeni tedaviler en az 2 farklı hayvan modelinde test edilmelidir, çeviri çalışmaları için yol açmak mümkün önce.

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA- 17SDG33370112 ve 18IPA34170258) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH K01 HL135474 Y.S. O.B'nin hibeleri ile desteklenmiştir.