التعريفي وتوصيف ارتفاع ضغط الدم الرئوي في الفئران باستخدام نموذج نقص الأكسجة/SU5416

يصف هذا البروتوكول تحريض ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) في الفئران على أساس التعرض لنقص الأكسجة وحقن خصم مستقبلات VEGF. الحيوانات تطوير PH والبطين الأيمن (RV) تضخم بعد 3 أسابيع من بدء البروتوكول. كما يتم عرض توصيف النموذج الوظيفي والماورومتري.

ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) هو حالة فيزيائية مرضية، يحددها متوسط ضغط الشريان الرئوي الذي يتجاوز 25 مم زئبق في بقية، كما يتم تقييمه بواسطة قسطرة القلب الأيمن. يمكن أن تؤدي مجموعة واسعة من الأمراض إلى PH ، تختلف في مسبباتها ، علم الأنسجة ، العرض السريري ، التكهن ، والاستجابة للعلاج. على الرغم من التقدم الكبير الذي تحقق في السنوات الأخيرة، لا تزال PH مرضًا غير مشذب. يمكن أن يمهد فهم الآليات الأساسية الطريق لتطوير علاجات جديدة. النماذج الحيوانية هي أدوات بحثية مهمة لتحقيق هذا الهدف. وفي الوقت الراهن، هناك عدة نماذج متاحة لتلخيص PH. يصف هذا البروتوكول طراز PH ماوس اثنين. المحفزات لتطوير PH هي نقص الأكسجة وحقن SU5416، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) مستقبلات الخصم. بعد ثلاثة أسابيع من بدء نقص الأكسجة/SU5416، والحيوانات تطوير إعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية تقليد التغيرات الهسجية لوحظ في PH الإنسان (في الغالب المجموعة 1). يؤدي إعادة عرض الأوعية الدموية في الدورة الدموية الرئوية إلى إعادة عرض البطين الأيمن (RV). يتم وصف إجراءات قياس ضغط RV (باستخدام طريقة الصدر المفتوح) والتحليلات المورفوميترية للRV (عن طريق تشريح وزن كل من البطينين القلبي) والتقييمات النسيجية لإعادة عرض (سواء الرئية عن طريق تقييم إعادة عرض الأوعية الدموية والقلب عن طريق تقييم تضخم القلب والتليف RV). مزايا هذا البروتوكول هي إمكانية تطبيق سواء في نوع البرية وفي الفئران المعدلة وراثيا، وتنفيذ سهل نسبيا ومنخفض التكلفة، والتطور السريع لمرض الفائدة (3 أسابيع). القيود من هذه الطريقة هي أن الفئران لا تتطور النمط الظاهري الشديد وPH هو عكس عند العودة إلى normoxia. الوقاية، فضلا عن دراسات العلاج، يمكن بسهولة أن تنفذ في هذا النموذج، دون الحاجة إلى المهارات المتقدمة (بدلا من نماذج القوارض الجراحية).

ارتفاع ضغط الدم الرئوي (PH) هو حالة فيزيائية مرضية، يتم تعريفها بواسطة ضغط متوسط الشريان الرئوي (PA) يتجاوز 25 مم زئبق في بقية، كما تم تقييمها بواسطة القسطرة القلب الأيمن^1،2. هناك مجموعة متنوعة من الأمراض التي يمكن أن تؤدي إلى PH. وفي محاولة لتنظيم الظروف المرتبطة بال PH، تم وضع عدة نظم تصنيف. التصنيف السريري الحالي يصنف الأمراض المتعددة المرتبطة PH في 5 مجموعات مختلفة¹. هذا التمييز له أهمية منذ مجموعات مختلفة من المرضى لديهم الأمراض التي تختلف في العرض السريري، وعلم الأمراض، والتكهن، والاستجابة للعلاج². يلخص الجدول 1 التصنيف الحالي، المكمّل بالخصائص الهستوولوجية الأساسية لكل مرض.

الجدول 1: نظرة عامة على التصنيف السريري لـ PH، إلى جانب السمات الهستوولوجية الرئيسية داخل المجموعات. ملاءمة بروتوكول نقص الأكسجة/SU5416 لنم تصميم PH. تم تعديل هذا الجدول من¹⁹. PH: ارتفاع ضغط الدم الرئوي، PAH: ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي

على الرغم من التقدم الكبير في علاج الأمراض المرتبطة بال PH ، لا يزال PH بدون علاج ، مع معدل وفيات لمدة 3 سنوات يتراوح بين 20 ٪ و 80 ٪^3. وهذا يدل على الحاجة الملحة لفهم الآليات الأساسية للPH، وبعد ذلك، تطوير علاجات جديدة لمنع، وإبطاء التقدم، وعلاج المرض. النماذج الحيوانية ذات أهمية حاسمة لهذا النطاق. حاليا، هناك نماذج مختلفة لدراسة PH. ويحال القارئ المهتم إلى الاستعراضات الممتازة حول هذا الموضوع^2,3,4. مع الأخذ في الاعتبار مجموعة متنوعة من الأمراض المؤدية إلى PH، فمن الواضح أن الظروف المتنوعة من PH الإنسان لا يمكن أن تكون ملخصة تماما في نموذج واحد. نماذج الحيوانات المتاحة يمكن تصنيفها في ط) ضرب واحد، ثانيا) ضربتين، iii) خروج المغلوب، و4) نماذج overexpression³. في نماذج ضرب واحد، يتم حث PH من قبل حافز واحد المرضية، في حين أن اثنين من ضرب نماذج الجمع بين اثنين من المحفزات المرضية مع هدف تحفيز PH أكثر شدة، وبالتالي تقليد أكثر عن كثب مرض الإنسان المعقدة. وإلى جانب الاختلافات المسببة، والنتيجة العديد من المحفزات في الاختلافات النمذجة PH التي تعتمد أيضا على الأنواع والخلفية الوراثية للحيوانات⁴.

واحدة من النماذج الأكثر شيوعا والقواة الكلاسيكية PH هو نموذج نقص الأكسجة المزمن². ومن المعروف نقص الأكسجة للحث PH في البشر وكذلك في العديد من أنواع الحيوانات. نقص الأكسجة لديه ميزة كونه حافزا فيزيولوجيا لPH(الجدول 1). ومع ذلك ، في حين أن درجة نقص الأكسجة المستخدمة في تحفيز PH في القوارض هي أكثر حدة مما هي عليه في البشر ، فإن الإهانة الوحيدة (نقص الأكسجة) تؤدي فقط إلى شكل خفيف من إعادة عرض الأوعية الدموية. هذا لا يقلد شدة المرض البشري. إضافة ضرب الثانية، وحافز إضافي لتحفيز PH، وأظهرت نتائج واعدة: حقن SU5416 المركب للقوارض جنبا إلى جنب مع التحفيز نقص الأكسجة يدفع أكثر شدة PH النمط الظاهري^2،5،6. SU5416 هو مثبط عامل النمو البطانية الوعائية (VEGF) مستقبلات-2. يمنع مستقبلات VEGF ويؤدي إلى موت الخلايا البطانية. تحت ظروف نقص الأكسجين ، وهذا يحفز انتشار مجموعة فرعية من الخلايا البطانية مقاومة لتخثر الدم. وعلاوة على ذلك, SU5416 يؤدي إلى انتشار الخلايا العضلية على نحو سلس. مزيج من هذه الآثار النتائج في إعادة عرض الأوعية الدموية الباثولوجي من الدورة الدموية الرئوية ويؤدي إلى ضغط السلطة الفلسطينية مرتفعة وإعادة عرض البطين الأيمن^2,5,7. وقد وصفت النموذج الأول في^{الفئران 6} وتطبيقها في وقت لاحق على الفئران^4,5,7. نموذج الماوس معارض أقل شدة إعادة عرض الأوعية الدموية بالمقارنة مع الفئران. وعلاوة على ذلك، عندما عاد إلى normoxia، PH لا تزال تتقدم في الفئران، بينما في الفئران هو عكس جزئيا.

يصف البروتوكول التالي جميع الخطوات الخاصة بالنمذجة PH في الفئران باستخدام طريقة Hypoxia/SU5416 (التخطيط، الجدول الزمني، التنفيذ). بالإضافة إلى ذلك، يوصف توصيف النموذج في هذا البروتوكول: وظيفياً (من خلال قياس الضغط البطيني الأيمن (RV) باستخدام تقنية الصدر المفتوح)، بشكل مورفويرسيلي (عن طريق تشريح ووزنها على حد سواء البطينين الأيمن والأيسر)، وكذلك من الناحية النسيجية (عن طريق تقييم إعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية، تضخم القلب البطين الأيمن والتليف).

يمكن للمحققين تنفيذ جميع الخطوات والأساليب الموصوفة في هذا البروتوكول بسهولة على أي مستوى من مستويات الخبرة. في حين أن القياسات الوظيفية للRV باستخدام تقنية الصدر المفتوح (الموصوفة هنا) ليست الطريقة القياسية الذهبية في هذا المجال ، فقد ميزة أنه يمكن تعلمها بسرعة وإعادة إنتاجها بدقة حتى من قبل تجربة أقل خبرة.

قبل أي تجارب على الحيوانات الحصول على ترخيص لجنة رعاية الحيوان المؤسسية المحلية. وقد أجريت التجارب الحالية بعد موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في كلية إيكان للطب في جبل سيناء.

1. PH التعريفي

1. اعداد
   1. قبل البدء في الدراسة، التخطيط بعناية التصميم التجريبي. تأكد من أن الفئران تتعرض لنقص الأكسجة في نفس الوقت الذي يخضع فيه الحقنة SU5416 الأولى. ويرد في الشكل 1أمثال على التصميم التجريبي لحفز PH باستخدام طريقة نقص الأكسجة/SU5416. فئران التحكم تلقت فقط السيارة. لهذا النموذج, سيتم حقن SU5416 إلى الفئران مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع متتالية.
   2. استخدم ثمانية إلى اثني عشر أسبوعًا من الفئران C57BL/6 لهذه الدراسة. منزل الحيوانات في 18-20 درجة مئوية في دورة 12-h ضوء الظلام. ضمان أن الغذاء والماء يمكن الوصول إليها الإعلانية libitum.
   3. وزن الحيوانات. تعيين لهم عشوائيا إلى كل مجموعة: نورموكسيا و Hypoxia/SU5416.
   4. إعداد غرفة نقص الأكسجة كما هو مبين في الشكل 1B. النيتروجين آمنة (N₂) خزانات بالقرب من الغرفة. تعيين الأكسجين (O₂₎وحدة تحكم في نقطة من 10٪ O_2. دع النظام يصل إلى حالة ثابتة.
   5. إعداد SU5416 للحقن (استخدام جرعة من 20 ملغ / كغ من وزن الجسم). SU5416 لا تذوب في حلول مائي; ولذلك، حل المبلغ المحسوب في 100 ميكرولتر DMSO⁸. على سبيل المثال، بالنسبة للماوس 25 غرام، فإن كمية SU5416 التي سيتم حقنها هي 0.5 ملغ مذابة في 100 ميكرولتر مذيب (DMSO). التركيز النهائي من SU5416 لهذا الماوس هو، لذلك، 5 ملغ / مل.
      تنبيه: SU5416 هي مادة خطرة. اقرأ بعناية ورقة بيانات السلامة مصحوبة بالمنتج وتأكد من اتخاذ الاحتياطات الموصى بها عند التعامل مع هذه المادة. ارتداء قفازات واقية و (بالنسبة لأي حقن) استخدام حماية العين. يظهر التركيب الكيميائي لـ SU5416 في الشكل 1C.
      ملاحظة: حساب فائض مناسب من الحل لتعويض حجم التي سوف تفقد أثناء الحقن (على سبيل المثال في الحقنة، والقارورة الخ). اعتمادا على حقنة المستخدمة، وحجم القتلى هو ما يقرب من 200 ميكرولتر. بالنسبة لمجموعة من 10 فئران، احسب جرعة ماوس 2.
   6. إعداد الحقن للحقن. استخدام 1 مل الحقن مع 25 G × 5/8 "الإبر.
2. SU5416 حقن تحت الجلد
   1. تقييد الحيوان. ضع الماوس على غطاء القفص للمساعدة في ضبط النفس. فهم الجلد وتشكيل خيمة موازية للعمود الفقري. تأكد من فهم الجزء الخلفي من الرأس بإحكام، لتجنب إصابة لدغة محتملة من قبل الماوس.
      ملاحظة: وجود اثنين من المحققين يجعل الإجراء أسرع وأكثر دقة حيث يمكن للمرء أن يحمل الحيوان بينما يقوم الآخر بالحقن.
   2. إدراج الإبرة تحت الجلد على الجناح في طية فضفاضة من الجلد. تأكد من إدخال الإبرة موازية للبشرة. تجنب اختراق جدار البطن.
   3. حقن محتوى الحقنة (100 ميكرولتر من SU5416 أو المركبة المذابة).
      ملاحظة: من أجل تجنب التسرب بعد الولادة الكاملة، عقد الحقنة لمدة 10 s تقريبا وتدوير قليلا الإبرة تحت الجلد.
   4. سحب الإبرة والعودة إلى قفص الحيوان. بعد حقن SU5416، ضع الأقفاص في غرفة نقص الأكسجة التهوية.
3. التعرض لنقص الأكسجة
   1. مراقبة التهوية مع مرور الوقت. تأكد من الحفاظ على 10٪ من إمدادات الأكسجين. الحفاظ على الحيوانات normoxia في غرفة نصف قابلة للغلق في 21٪ O₂.
   2. تأكد من أن الغرف مجهزة بمستشعر أكسجين لقياس مستوى الأكسجين. تجنب فتح الغرف على نطاق واسع. لتنظيف وإضافة الطعام والماء فتح الغرف لمدة لا تزيد عن 20 دقيقة كل 3 أيام.
   3. تفقد الحيوانات يوميا. النظر في إشارات الإجهاد مثل piloerection أو فقدان كبير للوزن.
      ملاحظة: الحيوانات تحت نقص الأكسجة/SU5416 ومن المتوقع أن انقاص وزنه^5. وهذا مؤشر على تطور المرض.
   4. كرر SU5416 حقن أسبوعيا لمدة 3 أسابيع متتالية (انظر الشكل 1ألف للحصول على نظرة عامة على التصميم التجريبي).
      ملاحظة: يمكن أن يساعد تغيير موقع الحقن في تقليل تهيج الجلد.

2. توصيف وظيفية من قبل قياسات الضغط RV الغازية

1. اعداد
   ملاحظة: حدد نظام تخدير. يمكن استخدام التخدير القابل للحقن أو الاستنشاق. منذ جرعة زائدة طفيفة من التخدير عن طريق الحقن (وخاصة من الكيتامين / زيلازين أو pentobarbital) يمكن أن تؤثر بشكل كبير على وظيفة القلب، ويوصى استخدام التخدير المتطاير. من الأهمية بمكان استخدام نفس المخدر لجميع الفئران داخل الدراسة.
   1. استخدام المبخر لضمان جرعة مخدر دقيقة لكل. الجرعة لisoflurane على النحو التالي: تحريض 3-4%, صيانة 1% مختلطة مع الأكسجين 100%.
      ملاحظة: ارتداء معدات الحماية الشخصية وتجنب التنفس بخار.
   2. إعداد وسادة التدفئة و / أو مصابيح الاحترار للحفاظ على درجة حرارة الجسم. إعداد مسبار درجة حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم.
   3. ضمان التهوية المناسبة. إعداد جهاز التنفس الصناعي مسبقا. قم بإعداد موصل Y-tube وتحقق من وظيفة جهاز التنفس الصناعي باستخدام الوضع اليدوي. تأكد من أن الضغط الواح هو < 1 سم H₂O لتجنب barotrauma. تعيين معدل التنفس في 110 أنفاس / دقيقة.
   4. حضّر أنبوبًا اُطرائيًا عن طريق قطع قسطرة داخل الأوعية الدموية 20 غ.
   5. إعداد الأدوات اللازمة: ملقط صغيرة، مقص، مرنة هوك الداخر، وكوتر السفينة، ومسحات القطن. على مسحة القطن ضبط صغيرة 25 G × 5 /8 "إبرة التي سيتم استخدامها لجعل ثقب صغير في البطين الأيمن.
   6. إعداد قسطرة الضغط، وحدة التحكم بحجم الضغط وبدء برنامج الحصول على البيانات. ضع قسطرة PV في أنبوب 15 مل مملوءة PBS في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومعايرة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   7. من أجل التسريب و التثبيت للأعضاء، إعداد برنامج تلفزيوني ومحلول من 50٪ برنامج تلفزيوني / 50٪ أكتوبر. إعداد 2 × 10 mL الحقن (مع إبرة 25 G): واحد سوف تستخدم لضخ القلب والرئة مع برنامج تلفزيوني في الموقع والثانية لحقن OCT / برنامج تلفزيوني (50/50) حل لرئة العينة التي سيتم استخدامها لفحص الهيستولوجي.
2. تنبيب
   1. وزن الماوس وتسجيل الحالة الصحية قبل التخدير.
   2. حث التخدير مع 3-4٪ isoflurane. تحقق من عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس إصبع القدم قرصة: قرصة إصبع القدم من أحد الأطراف بحزم. إذا سحب الحيوان الطرف ، فهذا علامة على عدم كفاية التخدير.
   3. بعد تحريض التخدير، حلق الرقبة ومناطق الصدر.
   4. ضع الماوس على وسادة التدفئة. وضع مسبار درجة حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم.
      ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة الجسم له أهمية بالنسبة للقياسات الوظيفية. يجب أن تكون درجة حرارة الجسم حوالي 36.5-37 درجة مئوية.
   5. باستخدام ملقط منحني إرفاق خيط خياطة إلى القاطعات العليا من الماوس، وتمتد وإصلاح لمنصة التدفئة مع الشريط الجراحي. تأمين أطراف الماوس باستخدام الأشرطة الجراحية.
   6. ل intubating الحيوان جعل شق صغير من حوالي 1 سم في الجلد عنق الرحم الوسط باستخدام مقص صغير.
      ملاحظة: النوبات الفموية هي طريقة بديلة تتطلب المزيد من الخبرة.
   7. مع قضيب القطن يميل فصل بصراحة الغدد اللعابية parotid و submandibular في المستوى المتوسط. هذا سوف يعرض العضلات الإفراط في القصبة الهوائية.
   8. قطع بعناية هذه العضلات تعريض القصبة الهوائية.
   9. مع مقص صغير جعل شق صغير بين الغضاريف القصبة الهوائية وإدراج أنبوب البطاية المعدة. أخرج الدليل المعدني للقسطرة داخل الأوعية الدموية.
   10. قم بتوصيل القسطرة بجهاز التنفس الصناعي. تحقق من موضع أنبوب القصبة الهوائية عن طريق نفخ الرئتين يدوياً بلطف. تأمين الموقف مع الشريط.
   11. الحفاظ على 1٪ ايزوفلوران التخدير طوال العملية.
   12. مراقبة بانتظام عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس قرصة إصبع القدم. ضبط التخدير وفقا لذلك.
       ملاحظة: معدل ضربات القلب الموصى به أثناء التجارب، تحت 1٪ من التخدير isoflurane، هو ما يقرب من 400 نبضة / دقيقة. الحفاظ على درجة حرارة الجسم والتخدير ضرورية للسيطرة على معدل ضربات القلب. يمكن أن يزيد من isoflurane خفض معدل ضربات القلب. ومع ذلك، يمكن تحقيق الانتعاش عن طريق خفض معدل isoflurane.
3. قياسات الضغط RV (نهج الصدر المفتوح)
   1. مع مقص صغير أداء شق الجلد من حوالي 1 سم على عملية xiphoid والجزء العلوي من البطن. فصل الجلد الذي يغطي الصدر وجدار البطن من أرباع البطن العلوي: تبدأ في خط الوسط، وهد إلى xiphoid والتحرك بعناية جانبيا على كلا الجانبين. استخدام ثيرموكويتيري للسيطرة على النزيف.
      ملاحظة: الهدف هو الحصول على تجويف الصدر من خلال جدار البطن.
   2. افتح تجويف البطن وقم بقطع الحجاب الحاجز بعناية، مع الحرص على عدم إصابة القلب النابض أو الرئتين.
      ملاحظة: الهدف هو فضح قمة والبطين الأيمن للقلب. التعرض الجيد وعرض القلب هي ذات أهمية حاسمة لوضع الصحيح من القسطرة. من المهم جدا تجنب النزيف طوال العملية. حتى التغييرات الصغيرة في حجم intravasal يمكن أن تغير الحمل من القلب الأيمن وتؤثر على المعلمات المسجلة.
   3. إزالة بلطف الم pericardium باستخدام قضيب القطن يميل.
   4. قبل وضع قسطرة الضغط في القلب، أحضر القسطرة بجوار الماوس.
   5. باستخدام قضيب القطن المُعدّ مع الإبرة يصنع جرح طعنة في الجزء الصدّي من البطين الأيمن. قم بإزالة الإبرة بعناية وأدخل قسطرة الضغط في هذه الحفرة.
      ملاحظة: يجب أن يعمل هذا بدون تطبيق القوة. في حال لم يكن ذلك ممكنا، حاول صنع ثقب جديد بالقرب من أول واحد من أجل تجنب إصابة طويلة من القلب. لا ينبغي إدخال الإبرة بعمق أكبر من حوالي 3 ملم.
   6. أدخل قسطرة الضغط بالتوازي مع اتجاه البطين الأيمن، مع الطرف الذي يواجه الشريان الرئوي.
   7. شاهد تتبع موجة الضغط لضمان تحديد موضع القسطرة الصحيح. وقد ثبت تتبع الممثلين في الشكل 2.
   8. السماح لإشارة الضغط لتحقيق الاستقرار. وقفة التنفس والحصول على ما لا يقل عن 3 القياسات. في ما بين القياسات فرديّة يسمح الحيوان أن يكون تهوية.
   9. مرة واحدة يتم تسجيل جميع القياسات إزالة القسطرة ووضعها مرة أخرى في أنبوب تعبئة برنامج تلفزيوني في حمام الماء.
      ملاحظة: بعد الانتهاء من التجربة، قم بتنظيف القسطرة وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. القتل الرحيم وضخ الرئة
   1. عند الانتهاء من التجربة القتل الرحيم الماوس عن طريق exsanguination.
   2. افتح الصدر على نطاق واسع. باستخدام مقص، وقطع القص بأكمله وإيلاء الاهتمام بعدم إصابة القلب أو الرئتين.
   3. يجعل استخدام مقص القزحية شقًا صغيرًا في البطين الأيسر للسماح للدم بمغادرة الغرفة.
   4. ضع إبرة 25 G من حقنة تحتوي على 10 مل من PBS في البطين الأيمن وحقن محلول PBS حتى يتم تطهير الرئتين من الدم.
   5. بمجرد الانتهاء من هذه الخطوة، تأكد من القتل الرحيم عن طريق حصاد الأنسجة الحيوية (القلب والرئتين): قطع المرفقات الكافا والاههرية وإزالة القلب والرئتين في كتلة.

3- التوصيف المورفومي

1. بعد إزالة القلب والرئتين مباشرة (الخطوة 2.4.5)، قم بعزل القلب وإزالة الأذينين. مع مقص تينوتومي منحني تشريح بعناية البطين الأيمن (RV) من البطين الأيسر (LV)، وترك الحاجز (S) مع البطين الأيسر. وزن RV وLV + S وحساب مؤشر فولتون = RV / LV + S(الشكل 3)^5،9.
2. خذ جزءًا من البطين الأيمن وضعه في قالب تضمين أكتوبر المعبأ مسبقًا. استخدم الجزء الآخر من البطين الأيمن لتحليل الحمض النووي الريبي و/أو البروتين. تجميد المفاجئة في الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
3. استخدم مقص القزحية لعزل الرئتين عن القلب وأي أنسجة متبقية أخرى.
   ملاحظة: لإعداد الرئتين، الضخ كما هو موضح أعلاه (الخطوات 2.4.3-2.4.5) له أهمية كبيرة.
4. المفاجئة تجميد جزء من الرئتين وتخزينها لRNA، استخراج البروتين أو غيرها من المقايسات.
5. استخدم الجزء الآخر من الرئتين للتحليل النسيجي. لهذا الغرض، أدخل حقنة تحتوي على 50٪ برنامج تلفزيوني و 50٪ أكتوبر في قصبات من الفص المستخدم^10،11. يمكن للمجرب أن يرى بسهولة أن الرئة يتم تضخيمها عندما يتم حقنة في الأنسجة.
6. وضع هذه القطع من الرئة في القوالب المضمنة المعبأة مسبقا مع أكتوبر و المفاجئة تجميدها في الجليد الجاف. تخزين العينات في -80 درجة مئوية بعد تجميدها.
7. إعداد 8 ميكرومتر أقسام من RV والرئة باستخدام جهاز التبريد. الهواء الجافة أقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
8. إصلاح الشرائح في درجة حرارة الغرفة باستخدام 10٪ شبهformaldehyde (PFA) لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: PFA هو مادة مسرطنة الإنسان المعروفة. تقليل مخاطر التعرض باستخدام غطاء أبخرة كيميائية، والإجراءات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. راجع ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) للحصول على مزيد من المعلومات.
9. تقييم إعادة عرض الأوعية الدموية من قبل هاماتوسلين / إيوسين تلطيخ
   ملاحظة: أداء هيماوكسيلين / إيوسين تلطيخ من أجل تقييم التغيرات الهيكلية من القلب والأوعية الدموية إعادة عرض في الرئة (الشكل 3).
   1. وصمة عار مع حل هيماوكسيلين لمدة 8 دقائق.
   2. شطف مع مياه الصنبور الجارية لمدة 5 دقائق تليها شطف سريع في الماء المقطر.
   3. شطف في EtOH 95٪ لمدة 1 دقيقة ووصمة مضادة في محلول إيوسين لمدة 1 دقيقة.
   4. الجفاف (80٪ الإيثانول 10-30 ق، 100 الإيثانول لمدة 1 دقيقة و 100٪ تولول لمدة 3 دقائق).
   5. جبل وتغطية مع غطاء. جفف الشرائح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: قد تكون الحلول المستخدمة في تلطيخ خطرة. تقليل مخاطر التعرض باستخدام غطاء أبخرة كيميائية، والإجراءات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. راجع MSDS للحصول على مزيد من المعلومات.
10. تقييم التليف البطين الأيمن من قبل Picrosirius الأحمر تلطيخ
    ملاحظة: في تلطيخ Picrosirius الأحمر، بيكروسريوس الأحمر، وهو حمض، يربط الكولاجين¹². لذلك، يمكن استخدام هذا التلطخ لفحص النسيجية محتوى الكولاجين.
    1. احتضان الشرائح في محلول بوين المُسخّن مسبقاً عند 58 درجة مئوية مقابل ساعة.
    2. اغسل الشرائح في مياه الصنبور الجارية لإزالة اللون الأصفر من الأقسام لمدة 10-15 دقيقة.
    3. وصمة عار في 0.1٪ الأخضر السريع لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. شطف في 1٪ حمض الخليك لمدة 1 دقيقة.
    5. شطف في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
    6. وصمة عار في 0.1٪ سيريوس الأحمر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها الجفاف في تولول.
       تنبيه: قد تكون الحلول المستخدمة في التلطيخ خطرة. تقليل مخاطر التعرض باستخدام غطاء أبخرة كيميائية، والإجراءات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. راجع MSDS للحصول على مزيد من المعلومات.
11. تقييم تضخم القلب من قبل WGA تلطيخ
    ملاحظة: يمكن تقييم تضخم البطين الأيمن (RV) على المستوى الخلوي عن طريق إجراء Agglutinin Germ القمح (WGA) تلطيخ (الشكل 4).
    1. إصلاح الشرائح في حل الأسيتون الباردة لمدة 15 دقيقة تليها 3 خطوات من الغسيل في برنامج تلفزيوني (5 دقائق لكل منهما).
    2. كتلة مع مصل الماعز 10٪ في محلول داكو لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. احتضان الشرائح مع WGA: إضافة WGA 1:200 واحتضان لمدة 1 1/2 ساعة في 37 درجة مئوية في الظلام.
    4. غسل الشرائح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    5. احتضان الشرائح مع صبغة حمض نووي.
    6. غسل الشرائح ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    7. لتركيب، وإزالة فائض من السائل وتطبيق تصاعد وسائل الإعلام و coverlip. جفف الشرائح لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام واخزن عند 4 درجات مئوية.
       ملاحظة: قد تكون الحلول المستخدمة في تلطيخ خطرة. تقليل مخاطر التعرض باستخدام غطاء أبخرة كيميائية، والإجراءات المناسبة ومعدات الحماية الشخصية. راجع MSDS للحصول على مزيد من المعلومات.
12. إجراء الكيمياء المناعية للرئة إلى مزيد من تقييم الأوعية الدموية على وجه التحديد. على سبيل المثال، يمكن استخدام تلطيخ خلايا العضلات السلس لتقييم العضلات من الأوعية، في حين فون ويلبراند عامل التلطخ يمكن استخدامها لتصور التغيرات البطانية. هذه الطرق موصوفة في مكان آخر⁵.

في هذا البروتوكول، ونحن وصف بالتفصيل إنشاء نموذج Hypoxia/SU5416 لتحفيز PH في الفئران. وعلاوة على ذلك، نحن تفاصيل جميع الخطوات اللازمة لإجراء تقييم الأوعية الدموية الرئوية والقلب في نهاية فترة المراقبة.

لمحة عامة عن التصميم التجريبي لهذا النموذج مبين في الشكل 1A^13,14. الفئران تتعرض لنابية نوروباريك (10٪ O₂) وحقن تحت الجلد مرة واحدة في الأسبوع مع SU5416 لمدة ثلاثة أسابيع متتالية. وظهرت المحفزات المستخدمة للحث PH في هذا البروتوكول في الشكل 1B و 1C.

وFGF مستقبلات خصم SU5416 أعمال عن طريق التسبب في موت الخلايا البطانية المبرمج، وبالتالي، السماح لانتشار الخلايا مقاومة موتيليه موتيليه مقاومة المبرمج. وهذا يؤدي إلى إعادة تشكيل الأوعية الدموية في الأوعية الدموية الرئوية وزيادة مقاومة الأوعية الدموية⁵. الضغط المرتفع في الدورة الدموية الرئوية يزيد من RV afterload ويؤدي تدريجيا إلى ضعف RV والفشل⁹. في الخطوة الأولى، يمكن تقييم نجاح بروتوكول Hypoxia/SU5416 من خلال تقييم وظيفيا وظيفة RV في نهاية فترة المراقبة. في هذا البروتوكول، ونحن وصف بالتفصيل التقييم الغازية للضغط الانقباضي RV باستخدام طريقة قياس ضغط الصدر المفتوح RV. يتم عرض منحنيات الضغط التمثيلية والتحليل الكمي لضغط البطين الأيمن في الشكل 2.

كيف يمكننا تحديد إعادة عرض الأوعية الدموية، مما يؤدي إلى ارتفاع مقاومة الأوعية الدموية وبالتالي PH؟ قياس الهيستومورف هو المعيار الذهبي لتميز الأوعية الدموية الرئوية. في هذا البروتوكول، نحن وصف بالتفصيل هيماوسيلين و Eosin تلطيخ (H & E) بروتوكول. بعد تلطيخ الصور والتقاطها، يمكن تمييز الشرايين الرئوية في الشرايين الصغيرة (<50 ميكرومتر) والأكبر منها (> 50 ميكرومتر). تم استبعاد الشرايين القصبية من دراستنا. لتقييم سمك الوسيط، يتم قياس الخارجي (ED)، وكذلك القطر الداخلي (ID) من الشرايين. تظهر الصور التمثيلية للشرايين الرئوية المعاد تشكيلها بعد علاج نقص الأكسجة/SU5416 في الشكل 3A. تظهر نسبة سمك الشرايين المتوسطة فيما يتعلق بقطر المقطع العرضي في الشكل 3B. ويبين التحليل المُهَلِّم للشرايين الرئوية القاصية زيادة كبيرة في سمك الوسط في فئران نقص الأكسجة/SU5416 المعالجة بالمقارنة مع نورموكسيا(الشكل 3).

زيادة afterload يؤدي إلى تضخم RV وكما تقدم المرض إلى RV التليف^9,15. يمكن تقييم تضخم RV morphometrically عن طريق قياس مؤشر فولتون (RV / LV + Septum) وكذلك عن طريق قياس تضخم القلبية (CM). يتم حساب نسبة وزن البطين الأيمن (RV) إلى البطين الأيسر (LV) بالإضافة إلى الحاجز [RV/(LV+S)] كمؤشر للتضخم البطيني الأيمن. تظهر النتائج التمثيلية من مؤشر فولتون في Hypoxia/SU5416 وفئران نورموكسيا في الشكل 4B. الطريقة الموصوفة هنا لتقييم تضخم CM هي تلطيخ الأجزاء البطينية اليمنى مع جرثومة القمح Agglutinin (WGA). WGA يربط إلى بروتينات سكريات من غشاء الخلية ويمكن استخدامها لتحديد منطقة المقطع العرضي من myocytes^16,17. تظهر صور تمثيلية من المقاطع البطينية اليمنى الملطخة بالخاتم WGA في الشكل 4A. تظهر القياسات الكمية لمنطقة CM في كل من الفئران المريضة والفئران المتحكمة في الشكل 4A. Hypoxia/SU5416 نتائج زيادة ملحوظة في حجم القلب وتضخم البطين الأيمن(الشكل 4). ونحن وآخرون قد أظهرت سابقا أنه، بالمقارنة مع ضرب واحد (نقص الأكسجة فقط)، نقص الأكسجة/SU5416 يفاقم النمط الظاهري RV^5،18.

الشكل 1: نظرة عامة على الأسلوب Hypoxia/SU5416. (أ) التصميم التجريبي لنموذج الماوس Hypoxia/SU5416. يتم حقن SU5416 تحت الجلد مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع متتالية. (ب) التمثيل التخطيطي لنظام نقص الأكسجة. يستشعر وحدة التحكم وتنظم الأكسجين داخل الغرفة عن طريق ضخ النيتروجين من خلال أنبوب ضخ الغاز. (C)التركيب الكيميائي من SU5416. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الضغط البطيني الأيمن في الفئران المعرضة لنقص الأكسجة المزمن جنبا إلى جنب مع SU5416 حقن. (أ) تتبع تمثيلي لقياسات الضغط الغازية للبطين الأيمن (RV). (B) RV الضغط الانقباضي في فئران نقص الأكسجة/SU5416 والحيوانات التحكم التي تتعرض ل normoxia. ن = 6-8 فئران لكل مجموعة. p < 0.001. يتم الإبلاغ عن جميع البيانات الكمية كوسيلة ± وزارة الشؤون المالية.

الشكل 3: نقص الأكسجة/SU5416 يحفز إعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية. (أ) تظهر الأجزاء الملطخة باللّم من الرئتين من المجموعات المشار إليها من الفئات المشار إليها زيادة في سمك جدار الوسائط في الشرايين الرئوية للفئران Hypoxia/SU5416. شريط مقياس: 50 μm. (ب) النسبة المئوية للشرايين من سمك الوسيط بالنسبة إلى القطر المقطعي المقطعي. ن = 5 فئران لكل مجموعة. p < 0.001. يتم الإبلاغ عن جميع البيانات الكمية كوسيلة ± وزارة الشؤون المالية.

الشكل 4: تضخم البطين الأيمن في الفئران المعرضة لنقص الأكسجة المزمن جنبا إلى جنب مع SU5416 الحقن. (A) (يسار) ممثل WGA (القمح الجرثومة Agglutininin) تلطيخ الأنسجة البطينية اليمنى بعد العلاج المشار إليه. شريط مقياس: 50 μm. (يمين) التحليل الكمي للبيانات. ن = 5 فئران لكل مجموعة. (B) تضخم RV ينعكس من قبل RV الوزن أكثر من LV بالإضافة إلى غشاء الحاجز (S) نسبة الوزن (فولتون) مؤشر = RV / LV + S) في كل مجموعة. ن = 8 فئران لكل مجموعة. p < 0.001. يتم الإبلاغ عن جميع البيانات الكمية كوسيلة ± وزارة الشؤون المالية.

يصف هذا البروتوكول كيفية نموذج PH في الفئران عن طريق الجمع بين اثنين من المحفزات المرضية: نقص الأكسجة المزمن وحقن SU5416 (نقص الأكسجة / SU5416)¹⁸. في محاولة لربط هذا النموذج الماوس مع حالة PH الإنسان، لا بد للمرء أن ننظر حتما في تصنيف PH الحالي، هو مبين في الجدول 1. وتتميز PH في جميع أشكاله تقريبا من قبل vasoconstriction الرئوية والانتشار الشاذ للخلايا العضلية البطانية وسلسة. وهذا يؤدي إلى ارتفاع الضغط في الشرايين الرئوية وبالتالي إلى زيادة ما بعد الحمل من البطين الأيمن.

وينبغي أن تتضمن كل محاولة لتوصيف نموذج حيواني من PH أدلة على إعادة عرض الهستوبات من الأوعية الرئوية والبطين الأيمن. نموذج الماوس نقص الأكسجة ضرب واحد يؤدي إلى شكل معتدل من vasculature إعادة عرض^2،3. وتشمل هذه النتائج المرضية العضلات من السفن غير العضلات سابقا، يرافقه الخلايا البطانية، الخلية العضلية الملساء وانتشار الخلايا الليفية. وتتفاقم هذه النتائج بإضافة الضربة الثانية (SU5416 حقن). الآثار هي عكسها في ضرب واحد (نقص الأكسجة) نموذج ويمكن عكسها جزئيا فقط في نموذج Hypoxia/SU5416.

السبب الرئيسي للوفاة لمرضى PH هو فشل البطين الأيمن (RVF)^4,20. لا يرافق إعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية في النماذج الحيوانية دائمًا RVF. من أجل توصيف نموذج من حيث RVF ينبغي تحليل البيانات المورفولوجية والوظيفية والجزيئية. وهذا الأخير خارج نطاق هذا البروتوكول. يشمل إعادة عرض التشكلات المورفولوجية على حد سواء الجزئية والمجهرية الجوانب. على المستوى التناظري، المؤشر الرئيسي للتضخم RV هو مؤشر فولتون، يعرف بأنه وزن RV مقسوم على البطين الأيسر (LV) والوزن (S) (RV/LV+S). على المستوى المجهري، يمكن تقييم التليف والالتهاب والتضخم بواسطة سيريوس الأحمر، هيماوكسيلين/إيوسين وتلطيخ WGA، على التوالي.

الماوس Hypoxia/SU5146 نموذج (الذي هو موضح هنا) يظهر خلل RV, كما تقاس الضغوط الانقباضية المرتفعة ومعايير المورفولوجية. فيما يتعلق بإعادة عرض الأوعية الدموية الرئوية ، لوحظ تضخم الوسط بعد ثلاثة أسابيع من بدء البروتوكول. بالمقارنة مع نموذج Hypoxia/SU5416 في الفئران، نموذج الماوس لا يسبب فشل RV (الخلل المعتدل فقط)، لا يؤدي إلى اعتلال الأوعية الدموية الطمسي الشديد، كما لوحظ في البشر المصابين بأمراض شديدة، ويتحسن علم الأمراض الرئوية بعد العودة إلى normoxia. وعموما، فإن نموذج الماوس Hypoxia/SU5416 مناسب لتقليد إصابة الأوعية الدموية كما هو مصادف في PH، ومعظمها المجموعة الأولى (جزئيا المجموعة الثالثة، انظر الجدول 1)^1،,19. وميزة هذا النموذج هو تطبيق في نوع البرية (غير المعدلة وراثيا) الفئران، وسهلة نسبيا وتنفيذ منخفضة التكلفة، وانخفاض معدل الوفيات نسبيا من الحيوانات المريضة، والتطور السريع للمرض من الفائدة (3 أسابيع). يمكن بسهولة إجراء دراسات الوقاية والعلاج في هذا النموذج ، دون الحاجة إلى مهارات متقدمة بدلاً من نماذج القوارض الجراحية.

عند تنفيذ البروتوكول هناك بعض الخطوات الهامة، والتي ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا. عند التخطيط للدراسة، ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن في مجموعة نقص الأكسجة/SU5416 وفيات الحيوانات تختلف بين 0-10٪ (ملاحظات غير منشورة). لذلك ، من أجل الوصول إلى القوة الإحصائية وتجنب الدراسات غير القوى ، يوصى بما لا يقل عن 10 فئران لكل مجموعة. ذوبان SU5416 منخفض. ولذلك، DMSO أو مذيب آخر (مثل الكربوكس ميثيل السليلوز، CMC) يجب أن تستخدم. DMSO في جرعات عالية يمكن أن تكون سامة. وقد أفيد عن LD₅₀ لاستخدام تحت الجلد (s.c.) في الفئران لتكون 13.9 - 25.6 ز / كغ^21،22. يتم تعريف LD₅₀ على أنها الجرعة المطلوبة لقتل 50٪ من أفراد مجموعة اختبار بعد مدة اختبار محددة^21,22. بالنسبة للماوس الذي يزن 25 غراماً، يتم استخدام 4.4 غرام/كغم من نظام إدارة الأراضي (DMSO) (حسابات تستند إلى كثافة DMSO قدرها 1.1 غرام/مل و0.1 مل مطبقة على s.c./mouse). ولذلك, الجرعة المعطاة تحت الجلد أقل بكثير من قيمة_{LD 50.} في أيدينا، يمكن تطبيق SU5416 المذابة في DMSO، كما هو موضح هنا، يسبب تهيج الجلد في بعض الحالات، ولكن لا توجد آثار سامة أخرى. ومع ذلك، توصي عدة تقارير باستخدام CMC كمركبة بديلة لـ SU5416¹⁴. عند إجراء القياسات الوظيفية RV, يجب إيلاء اهتمام وثيق في درجة حرارة الجسم, نزيف, وعمق التخدير, كما تم تقييمها من خلال اختبار ردود الفعل الماوس. تقنية الصدر المفتوح لتقييم ضغط RV، كما هو موضح هنا، لديه ميزة بسهولة يجري تنفيذها حتى من قبل مستخدم عديم الخبرة. يتلقّى الأسلوب [أوّل-اّدستدل هـيّنّدّدّيّةّ], يوصف في مكان آخر^23,,24,,25)الميزة من يكون أقلّ غزوة ويستطيع, لذلك, كنت طبّق أيضا في [نون-هل-هلّيّنت]. وهو يتطلب على الرغم من ذلك مستوى عال من الخبرة.

بعد الوصف الأول للنموذج Hypoxia/SU5416 في الفئران، وقد تم استخدام نموذج الماوس بنجاح في العديد من الدراسات^5،9،13. ومع ذلك، هناك أدلة على أن النتائج تعتمد على الخلفية الوراثية والجنس للفئران، الشركة المصنعة SU5416 وتواتر SU5416 حقن²⁶. في حين حقن SU5416 على مدى ثلاثة أسابيع متتالية يؤدي إلى PH في الفئران, جرعة واحدة لن تحفز PH⁴. وعلاوة على ذلك، تتطلب أشكال أخرى من PH، مثل تلك المرتبطة بأمراض القلب الأيسر أو بسبب مرض الجلطات الدموية المزمن، نماذج ذات صلة بالأمراض المسببات. يجب اختبار علاجات جديدة في نموذجين حيوانين مختلفين على الأقل، قبل أن تتمكن من تمهيد الطريق للدراسات الانتقالية.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يعلنونه.

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جمعية القلب الأمريكية (AHA-17SDG33370112 و 18IPA34170258) والمعاهد الوطنية للصحة المعاهد الوطنية للصحة K01 HL135474 إلى Y.S. O.B تم دعمها من قبل دويتشه هيرزستيفتونغ.