אינדוקציה ואפיון של יתר לחץ דם ריאתי בעכברים באמצעות מודל Hypoxia/SU5416

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה של יתר לחץ דם ריאתי (PH) בעכברים בהתבסס על החשיפה להיפותוקסיה והזרקת אנטגוניסט קולטן VEGF. בעלי החיים לפתח PH וחדר ימין (RV) היפרטרופיה 3 שבועות לאחר החניכה של הפרוטוקול. כמו כן מוצג האפיון הפונקציונלי והמורפומטרי של המודל.

יתר לחץ דם ריאתי (PH) הוא מצב פתופיזיולוגי, המוגדר על ידי לחץ עורקי ריאתי ממוצע העולה על 25 מ"מ Hg במנוחה, כפי שהוערך על ידי צנתור הלב הימני. קשת רחבה של מחלות יכולה להוביל ל-PH, שונה באטיולוגיה שלהם, היסטופתולוגיה, מצגת קלינית, פרוגנוזה, ותגובה לטיפול. למרות התקדמות משמעותית בשנים האחרונות, PH נשאר מחלה לא מאובטחת. הבנת המנגנונים הבסיסיים יכולה לסלול את הדרך לפיתוח טיפולים חדשים. מודלים של בעלי חיים הם כלי מחקר חשובים להשגת מטרה זו. נכון לכך, קיימים מספר דגמים זמינים לסיכום PH. פרוטוקול זה מתאר דגם PH עכבר שתי פגעות. הגירויים לפיתוח PH הם היפוקסיה והזרקה של SU5416, גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) קולטן אנטגוניסט. שלושה שבועות לאחר החניכה של Hypoxia/SU5416, בעלי חיים לפתח שיפוץ כלי דם ריאתיים מחקה את השינויים ההיסטופתולוגיים שנצפו PH האנושי (בעיקר קבוצה 1). שיפוץ כלי דם במחזור הדם הריאתי תוצאה של שיפוץ החדר הימני (RV). ההליכים למדידת לחצים RV (באמצעות שיטת החזה הפתוח), ניתוחים מורפומטריים של RV (על ידי ניתוח ושקילה הן חדרי הלב) ואת ההערכות היסטולוגיות של האיחוי (הן ריאות על ידי הערכת שיפוץ כלי דם ולב על ידי הערכת היפרטרופיה קרדיומיוציט RV ופיברוזיס) מתוארים בפירוט. היתרונות של פרוטוקול זה הם האפשרות של היישום הן בסוג פראי והן בעכברים מהונדסים גנטית, יישום קל יחסית בעלות נמוכה, ואת הפיתוח המהיר של המחלה של עניין (3 שבועות). מגבלות של שיטה זו הן כי עכברים אינם מפתחים פנוטיפ חמור PH הוא הפיך עם החזרה נורמוקסיה. מניעה, כמו גם מחקרי טיפול, ניתן ליישם בקלות במודל זה, ללא צורך במיומנויות מתקדמות (בניגוד למודלים מכרסמים כירורגיים).

יתר לחץ דם ריאתי (PH) הוא מצב פתופיזיולוגי, המוגדר על ידי לחץ עורקי ריאתי ממוצע (הרשות הפלסטינית) העולה על 25 מ"מ Hg במנוחה, כפי שהוערך על ידי צנתור^{הלב הימני 1,,2}. יש מגוון רחב של מחלות שיכולות להוביל לPH. בניסיון לארגן את התנאים הקשורים ל-PH, פותחו מספר מערכות סיווג. הסיווג הקליני הנוכחי מסווג את מספר מחלות הקשורות ל-PH ב-5 קבוצות שונות¹. הבחנה זו היא בעלת חשיבות מאחר שלקבוצות שונות של חולים יש מחלות השונות במצגת הקלינית שלהם, פתולוגיה, פרוגנוזה,^{ותגובה לטיפול 2}. טבלה 1 מסכמת את הסיווג הנוכחי, לצד המאפיינים ההיסטופתולוגיים הבסיסיים של כל מחלה.

טבלה 1: מבט כולל על הסיווג הקליני של PH, יחד עם התכונות ההיסטופתולוגיות העיקריות בתוך הקבוצות. התאמה של פרוטוקול Hypoxia/SU5416 עבור מידול PH. טבלה זו שונה^{מ- 19}. PH: יתר לחץ דם ריאתי, PAH: יתר לחץ דם עורקי ריאתי

למרות התקדמות משמעותית בטיפול במחלות PH הקשורות, PH עדיין נשאר ללא תרופה, עם שיעור תמותה של 3 שנים הנע בין 20% ו 80%³. זה מצביע על הצורך ההכרחי להבנת המנגנונים הבסיסיים של PH ולאחר מכן, פיתוח של טיפולים חדשניים כדי למנוע, להאט את ההתקדמות, ולרפא את המחלה. מודלים של בעלי חיים הם בעלי חשיבות מכרעת להיקף זה. כיום קיימים מודלים שונים ללימוד PH. הקורא המעוניין מכונה ביקורות מצוינות בנושא זה^2,3,4. בהתחשב במגוון המחלות המובילות ל-PH, ברור כי התנאים המגוונים של PH אנושי לא ניתן לדגמן באופן מושלם במודל אחד של בעלי חיים. ניתן לסווג את דגמי בעלי החיים הזמינים ב- i) להיט יחיד, ii) שני להיטים, iii) נוקאאוט, ו- iv) דגמי דיכוי יתר³. במודלים חד-להיט, PH מושרה על ידי גירוי פתולוגי יחיד, בעוד מודלים שני להיטים לשלב שני גירויים פתולוגיים במטרה לגרום PH חמור יותר ובכך לחקות מקרוב יותר את המחלה האנושית המורכבת. מלבד ההבדלים האטיולוגיים, הגירויים הממספרים גורמים להבדלי מידול PH התלויים גם במין וברקע הגנטי של בעלי^{החיים 4}.

אחד הדגמים הנפוצים ביותר של מכרסמים PH קלאסי הוא מודל היפוקסיה^{כרונית 2.} היפוקסיה ידועה לגרום PH בבני אדם, כמו גם במספר מינים של בעלי חיים. היפוקסיה יש את היתרון של להיות גירוי פיזיולוגי עבור PH (טבלה 1). עם זאת, בעוד מידת ההיפוקסיה המשמשת לזיכוך PH מכרסמים היא הרבה יותר חמורה מאשר בבני אדם, העלבון היחיד (היפוקסיה) מוביל רק לצורה קלה של איחוי כלי דם. זה לא מחקה את חומרת המחלה האנושית. התוספת של להיט שני, גירוי נוסף לזיכוך PH, הראה תוצאות מבטיחות: הזרקת SU5416 המתחם למכרסמים בשילוב עם הגירוי hypoxic גורם פנוטיפ PH חמור יותר^2,,5,6. SU5416 הוא מעכב של קולטן גדילה אנדותל כלי דם (VEGF) 2. זה חוסם את קולטני VEGF ומוביל אפופטוזיס תא אנדותל. בתנאים היפוקסיים, זה מגרה את ההתפשטות של תת קבוצה של תאים אנדותל עמידים אפופטוזיס. יתר על כן, SU5416 מוביל להתפשטות חלקה של תאי שריר. השילוב של תופעות אלה גורם לשיפוץ כלי דם פתולוגיים של מחזור הדם הריאתי ומוביל ללחץ מוגבר של הרשות הפלסטינית ולשיפוץ החדר^{הימני 2,,5,,7}. המודל תואר לראשונה בחולדות^{6 ומאוחר} יותר הוחל על עכברים^4,5,7. מודל העכבר מציג שיפוץ כלי דם פחות חמור בהשוואה לחולדות. יתר על כן, כאשר חזר normoxia, PH ממשיך להתקדם בחולדות, בעוד בעכברים זה הפיך חלקית.

הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים עבור מידול PH בעכברים באמצעות השיטה Hypoxia/SU5416 (תכנון, ציר זמן, ביצוע). בנוסף, האפיון של המודל מתואר בפרוטוקול זה: פונקציונלית (על ידי מדידה פולשנית של לחץ החדר הימני (RV) באמצעות טכניקת החזה הפתוח), מורפומטרית (על ידי ניתוח ושקילה הן את החדר הימני והן את החדר השמאלי), כמו גם היסטולוגית (על ידי הערכת שיפוץ כלי דם ריאתיים, היפרטרופיה קרדיו-רירית ימין ופיברוזיס).

כל השלבים והשיטות המתוארים בפרוטוקול זה יכולים להיות מיושמים בקלות על ידי חוקרים בכל רמת ניסיון. בעוד המדידות הפונקציונליות של הקרוואן באמצעות טכניקת החזה הפתוח (המתוארת כאן) אינה שיטת תקן הזהב בתחום, יש לו את היתרון שניתן ללמוד אותו במהירות ולשכפל במדויק אפילו על ידי מתנסה פחות מנוסה.

לפני כל ניסויים בבעלי חיים לקבל את אישור הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים. הניסויים הנוכחיים בוצעו לאחר אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה איקאן בהר סיני.

1. אינדוקציה PH

1. הכנה
   1. לפני תחילת המחקר, לתכנן בקפידה את העיצוב הניסיוני. ודא כי עכברים חשופים היפוקסיה באותו נקודת זמן כמו הזרקת SU5416 הראשונה. דוגמה לעיצוב הניסיוני לזימת PH באמצעות שיטת Hypoxia/SU5416 מוצגת באיור 1A. עכברי בקרה קיבלו רק את הרכב. עבור מודל זה, SU5416 יוזרק לעכברים פעם בשבוע במשך 3 שבועות רצופים.
   2. השתמש בעכברים בני שמונה עד 12 שבועות C57BL/6 עבור מחקר זה. לשכון את בעלי החיים ב 18-20 מעלות צלזיוס במחזור 12-h אור כהה. ודאו שהמזון והמים נגישים ל-ad libitum.
   3. לשקול את החיות. הקצה אותם באופן אקראי לכל קבוצה: נורמוקסיה והיפות-קסיה/SU5416.
   4. הכן את התא ההיפוקסי כפי שמצג באות 1ב. מיכלי חנקן מאובטחים (N₂₎ליד התא. הגדר את בקר החמצן (O₂₎בנקודה של 10% O₂. תן למערכת להגיע למצב יציב.
   5. להכין SU5416 להזרקה (להשתמש במינון של 20 מ"ג/ ק"ג משקל גוף). SU5416 אינו מתמוסס בפתרונות מים; לכן, להמיס את הסכום המחושב ב 100 μL DMSO⁸. לדוגמה, עבור עכבר 25 גרם, כמות SU5416 להיות מוזרק הוא 0.5 מ"ג מומס 100 μL ממס (DMSO). הריכוז הסופי של SU5416 עבור עכבר זה הוא, לכן, 5 מ"ג/מ"ל.
      אזהרה: SU5416 הוא חומר מסוכן. קרא בעיון את גליון נתוני הבטיחות המלווה במוצר והקפידו לנקוט באמצעי הזהירות המומלצים בעת טיפול בחומר זה. לבש כפפות מגן והשתמש (כמו כל זריקה) להשתמש בהגנה על העיניים. המבנה הכימי של SU5416 מוצג באות 1C.
      הערה: חשב עודף מתאים של הפתרון כדי לפצות על אמצעי האחסון שאבד במהלך ההזרקה (למשל במזרק, בקבוקון וכו '). בהתאם המזרק בשימוש, נפח מת הוא כ 200 μL. עבור קבוצה של 10 עכברים, לחשב עודף של 2 מינוני עכבר.
   6. הכן את המזרקים להזרקה. השתמש במזרקי 1 מ"ל עם מחטים "25 G x 5/8.
2. הזרקת תת עורית SU5416
   1. לרסן את החיה. מניח את העכבר על מכסה הכלוב כדי לסייע באיפוק. אחז בעור וטפס אוהל מקביל לעמוד השדרה. הקפד לתפוס את החלק האחורי של הראש בחוזקה, כדי למנוע את הפציעה הנשיכה הפוטנציאלית על ידי העכבר.
      הערה: הנוכחות של שני חוקרים הופכת את ההליך למהיר ומדויק יותר, כפי שאחד יכול להחזיק את החיה בעוד השני מבצע את הזריקה.
   2. הכנס את המחט באופן תת עורי מעל האגף בקפל הרופף של העור. הקפד להכניס את המחט במקביל לעור. הימנע מכך שדרך דופן הבטן.
   3. להזריק את התוכן של המזרק (100 μL של SU5416 מומס או רכב).
      הערה: כדי למנוע דליפה לאחר הלידה המלאה, החזק את המזרק במשך כ-10 שניות וסובב מעט את המחט מתחת לעור.
   4. משוך את המחט והחזר את החיה לכלוב שלה. לאחר הזרקת SU5416, למקם את הכלובים בתא היפוקסיה מאוורר.
3. חשיפה להיפות
   1. נטר את האוורור לאורך זמן. הקפד לשמור על 10% של אספקת החמצן. שמרו על בעלי חיים נורמוקסיה בתא הניתן לאיטום למחצה ב-21% O₂.
   2. ודא כי התאים מצוידים בחיישן חמצן כדי למדוד את רמת החמצן. הימנע מפתיחה נרחבת של התאים. לניקוי והוספת מזון ומים לפתוח את התאים לא יותר מ 20 דקות כל 3 ימים.
   3. בדוק בעלי חיים מדי יום. שקול אותות מתח כגון piloerection או ירידה משמעותית במשקל.
      הערה: בעלי חיים תחת Hypoxia/SU5416 צפויים לרדת במשקל⁵. זוהי אינדיקציה להתפתחות המחלה.
   4. חזור על הזרקת SU5416 מדי שבוע במשך 3 שבועות רצופים (ראה איור 1A לסקירה של העיצוב הניסיוני).
      הערה: שינוי אתר ההזרקה יכול לעזור להפחית את הגירויים בעור.

2. אפיון פונקציונלי על ידי מדידות לחץ RV פולשניות

1. הכנה
   הערה: בחר משטר הרדמה. ניתן להשתמש בהרדמה להזרקה או לשאיפה. מאז מנת יתר קלה של הרדמה להזרקה (במיוחד קטמין / קסילאזין או פנטוברביטל) יכול להשפיע באופן משמעותי על תפקוד הלב, השימוש בהרדמה נדיפה מומלץ. יש חשיבות רבה להשתמש באותו הרדמה עבור כל העכברים בתוך מחקר.
   1. השתמשו במאדה כדי להבטיח מינון הרדמה מדויק לכל בעל חיים. המינון עבור isoflurane הוא הבא: אינדוקציה 3-4%, תחזוקה 1% מעורבב עם 100% חמצן.
      הערה: ללבוש ציוד מגן אישי ולהימנע מלנשום את האדים.
   2. הכן משטח חימום ו/או מנורות חימום לשמירה על טמפרטורת הגוף. הכן בדיקה בטמפרטורת פי הטבעת לניטור טמפרטורת הגוף.
   3. להבטיח אוורור תקין. הכן את מכונת ההנשמה מראש. הכן את מחבר צינור ה- Y ובדוק את פונקציית מכונת ההנשמה במצב ידני. ודא שהלחץ התוך-אמפרסטרי הוא <1 ס"מ H₂O כדי להימנע מבאוטראומה. קבע את קצב הנשימה על 110 נשימות/ דקות.
   4. הכן צינור אנדוטרכיאל על ידי חיתוך צנתר תוך-וסקולרי של 20 גרם.
   5. הכינו את המכשירים הדרושים: מרטפים קטנים, מספריים, מפשקי וו אלסטיים, צריבה כלי וספוגיות כותנה. על ספוגית כותנה להתאים מחט קטנה 25 G x 5/8", שישמש כדי להפוך את הנקב קטן בחדר הימני.
   6. הכן את צנתר הלחץ, יחידת בקרת עוצמת הלחץ וייזום תוכנת רכישת הנתונים. מקם את הצנתר PV בצינור 15 מ"ל מלא PBS ב 37 ° C במשך 15 דקות לכייל על פי פרוטוקול היצרן.
   7. לתנומה ובעקוב של האיברים, להכין PBS ופתרון של 50% PBS / 50% OCT. להכין 2 x 10 מ"ל מזרקים (עם מחט 25 G): אחד ישמש לתחלוק הלב ואת הריאה עם PBS ב situ והשני להזרקת OCT / PBS (50/50) פתרון לדגימה ריאות שישמש לבדיקה היסטולוגית.
2. אינטובציה
   1. לשקול את העכבר ולהקליט את מצב הבריאות לפני הרדמה.
   2. לגרום להרדמה עם 3-4% isoflurane. בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס צביטה בהונות: לצבוט את הדרך של אחד הגפיים בחוזקה. אם החיה נסוגה מהאיבר, זה סימן להרדמה לא מספקת.
   3. לאחר הרדמה אינדוקציה, לגלח את הצוואר ואת אזורי החזה.
   4. מניחים את העכבר על משטח החימום. מקם בדיקה בטמפרטורת פי הטבעת לניטור טמפרטורת הגוף.
      הערה: תחזוקה של טמפרטורת הגוף היא בעלת חשיבות עבור המדידות הפונקציונליות. טמפרטורת הגוף צריכה להיות בערך 36.5-37 °C.
   5. באמצעות ממחצים מעוקלים לחבר חוט תפר לחתכות החתכות העליונות של העכבר, למתוח ולתקן את משטח החימום עם סרט כירורגי. לאבטח את הגפיים של העכבר באמצעות קלטות כירורגיות.
   6. לציטוט בעל החיים לעשות חתך קטן של כ 1 ס"מ בעור צוואר הרחם מדיאלי באמצעות מספריים קטנים.
      הערה: צנרור אוראלי היא שיטה חלופית הדורשת ניסיון רב יותר.
   7. עם אפליקטור עם קצה כותנה בנפרד בבוטות את בלוטות הרוק parotid ותת-המנשר ברמה האמצעית. זה יחשוף את השרירים מעל קנה הנשימה.
   8. בזהירות לחתוך את השרירים האלה חושף את קנה הנשימה.
   9. עם מספריים קטנות לעשות חתך קטן בין סחוסי קנה הנשימה ולהכניס את צינור הסיום מוכן. תוציא את מדריך המתכת של הצנתר התוך-וסקולרי.
   10. חבר את הצנתר למכונת ההנשמה. ודא את מיקום צינור ה-tracheal על-ידי ניפוח ידני של הריאות בעדינות. אבטחו את המיקום עם סרט הדבקה.
   11. לשמור על הרדמה איזו-פלומתית של 1% לאורך כל ההליך.
   12. לפקח באופן קבוע על עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס צביטה בהון. כוונן את ההרדמה בהתאם.
       הערה: קצב הלב המומלץ במהלך הניסויים, תחת 1% הרדמה isoflurane, הוא כ 400 פעימות / דקה. תחזוקה של טמפרטורת הגוף והרדמה חיונית לשליטה בקצב הלב. עודף של isoflurane יכול להפחית את קצב הלב. עם זאת, התאוששות ניתן להשיג על ידי הפחתת שיעור isoflurane.
3. מדידות לחץ RV (גישה לחזה פתוח)
   1. עם מספריים קטנות לבצע חתך בעור של כ 1 ס"מ על פני תהליך xiphoid ואת החלק הבטן העליונה. הפרד את העור המכסה את החזה ואת דופן הבטן של רביע הבטן העליונה: התחל בקו האמצעי, דיסטל ל-xiphoid ולעבור בזהירות לרוחב משני הצדדים. השתמש בתרמוקוטריה כדי לשלוט בדימום.
      הערה: המטרה היא לקבל גישה לחלל בית החזה דרך דופן הבטן.
   2. פתח את חלל הבטן וחתוך את הסרעפת בזהירות, ותדאג לא לפגוע בלב הפועם או בריאות.
      הערה: המטרה היא לחשוף את החלק ים ואת החדר הימני של הלב. חשיפה טובה ותודעה של הלב הם בעלי חשיבות מכרעת למיקום הנכון של הצנתר. יש חשיבות רבה כדי למנוע דימום לאורך כל ההליך. אפילו שינויים קטנים בנפח התוך-וסחתי יכולים לשנות את העומס של הלב הימני ולהשפיע על הפרמטרים הרשומים.
   3. הסר בעדינות את החיידק באמצעות אפליקטור בעל קצה כותנה.
   4. רגע לפני שמכניסים את צנתר הלחץ ללב, הביאו את הצנתר ליד העכבר.
   5. שימוש באפליקטור הכותנה המוכן עם המחט עושה פצע דקירה בחלק הדיסטלי האפאלי של החדר הימני. בזהירות להסיר את המחט ולהכניס את צנתר הלחץ לתוך החור הזה.
      הערה: כך אמור לעבוד מבלי להפעיל כוח. במקרה זה לא אפשרי, נסה לעשות חור חדש ליד הראשון על מנת למנוע פגיעה ממושכת של הלב. המחט לא צריכה להיות מוכנסת עמוק יותר מאשר כ 3 מ"מ.
   6. הכנס את צנתר הלחץ במקביל לכיוון החדר הימני, כאשר הקצה פונה לעורק הריאה.
   7. צפה במעקב גל הלחץ כדי להבטיח את המיקום הנכון של הצנתר. מעקבים מייצגים מדגימים באיור 2.
   8. תן לאות הלחץ להתייצב. השהה את הנשימה והשג לפחות 3 מידות. בין המדידות הבודדות מאפשרים לחיה להיות מאווררת.
   9. ברגע שכל המדידות נרשמות להסיר את הצנתר ולמקם אותו בחזרה בצינור PBS מלא באמבט המים.
      הערה: לאחר השלמת הניסוי, נקה את הצנתר בהתאם להוראות היצרן.
4. המתת חסד וריאות
   1. עם סיום הניסוי המתת סד העכבר על ידי למוות.
   2. פתח את התיבה באופן נרחב. באמצעות מספריים, לחתוך את כל עצם החזה ושים לב לא לפגוע בלב או בריאות.
   3. שימוש במספריים קשתית עושה חתך קטן בחדר השמאלי כדי לאפשר לדם לעזוב את התא.
   4. מניחים את מחט 25 G של מזרק המכיל 10 מ"ל של PBS בחדר הימני ולהזריק את תמיסת PBS עד הריאות מנוקות מדם.
   5. לאחר השלמת שלב זה, לאשר המתת חסד על ידי קציר רקמות חיוני (לב וריאות): לחתוך את קאווה וחיבורים בבי העורק ולהסיר את הלב והריאות en block.

3. אפיון מורפומטרי

1. מיד לאחר הסרת הלב והריאות (שלב 2.4.5), בודדו את הלב והסירו את שני האטריה. עם מספריים טנוטומיה מעוקל לנתח בזהירות את החדר הימני (RV) מהבר השמאלי (LV), עוזב את המחיצה (S) עם החדר השמאלי. שקלו RV ו-LV+S וחשבו את מדד פולטון= RV/LV+ S (איור 3)^5,,9.
2. קח חלק מהחלקום הימני והצב אותו בתבנית הטבעה ממולאת מראש של OCT. השתמש בחלק השני של החדר הנכון לניתוח RNA ו/או חלבון. הצמד להקפיא בקרח יבש ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
3. השתמשו במספריים של הקשתית כדי לבודד את הריאות מהלב ומשאר הרקמה.
   הערה: להכנת הריאות, ההתחלות כמתואר לעיל (שלבים 2.4.3-2.4.5) היא בעלת חשיבות רבה.
4. הצמד להקפיא חלק מהריאות ולאחסן אותו עבור RNA, חלבון מיצוי או אחרים.
5. השתמש בחלק השני של הריאות לניתוח היסטולוגי. לשם כך, הכנס את המזרק המכיל 50% PBS ו- 50% OCT בברונכוס של האונה המשומשת^10,11. המתנסה יכול לראות בקלות כי הריאה מתנפחת כאשר התוכן של המזרק הוא perfused ברקמה.
6. מניחים את חתיכות הריאה הללו בהטמיע תבניות ממולאות מראש ב-OCT ומקפיאות אותן בקרח יבש. אחסן את הדגימות ב-80°C לאחר שהן קפואות.
7. הכן 8 μm קטעים של RV וריאות באמצעות מכונת cryostat. האוויר מייבש את החלקים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
8. לתקן את השקופיות בטמפרטורת החדר באמצעות 10% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות.
   הערה: PFA הוא מסרטן אנושי ידוע. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- גליון הנתונים של בטיחות חומרים (MSDS) לקבלת מידע נוסף.
9. הערכת איחוי כלי דם על ידי הכתמת המטוקסילין/אאוסין
   הערה: לבצע התכתמת המטוקסילין/אאוסין על מנת להעריך את השינויים המבניים של הלב ושיפוץ כלי הדםבריאה (איור 3).
   1. כתם עם תמיסת המטוקסילין למשך 8 דקות.
   2. לשטוף עם מי ברז זורמים במשך 5 דקות ואחריו לשטוף במהירות במים מזוקקים.
   3. יש לשטוף ב-95% את ETOH למשך דקה אחת וכתם נגדי בתמיסת Eosin למשך דקה אחת.
   4. התייבשות (80% אתנול 10-30 שניות, 100 אתנול למשך דקה אחת ו-100% טולול למשך 3 דקות).
   5. הר ולכסות עם כיסוי. ייבש את השקופיות למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
      הערה: הפתרונות המשמשים להכתמה עלולים להיות מסוכנים. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- MSDS לקבלת מידע נוסף.
10. הערכת פיברוזיס בחדר הימני על ידי פירוסיריוס אדום כתם
    הערה: בכתמים אדומים Picrosirius, Picrosirius אדום, שהוא חומצה, נקשר קולגן^12. לכן, כתם זה יכול לשמש לבדיקה היסטולוגית של תוכן הקולגן.
    1. דגירה השקופיות בתמיסה של ביין שחומם מראש ב 58 ° C עבור 1 שעה.
    2. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים כדי להסיר צבע צהוב ממקטעים למשך 10-15 דקות.
    3. כתם 0.1% ירוק מהיר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. לשטוף ב 1% חומצה אצטית במשך 1 דקות.
    5. לשטוף את מי הברז במשך 5 דקות.
    6. כתם ב 0.1% סיריוס אדום במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו התייבשות בטולול.
       התראה: הפתרונות המשמשים להכתמה עלולים להיות מסוכנים. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- MSDS לקבלת מידע נוסף.
11. הערכת היפרטרופיה קרדיומיוציט RV על ידי כתם WGA
    הערה: היפרטרופיה של החדר הימני (RV) ברמה התאית ניתן להעריך על ידי ביצוע נבט חיטה Agglutinin (WGA) כתמי(איור 4).
    1. תקן את השקופיות בפתרון אצטון קר במשך 15 דקות ואחריו 3 שלבי כביסה ב PBS (5 דקות כל אחד).
    2. לחסום עם 10% סרום עיזים בתמיסת Dako במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. דגירה השקופיות עם WGA: להוסיף WGA 1:200 דגירה עבור 1 1/2 שעה ב 37 ° C בחושך.
    4. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם PBS.
    5. דגירה השקופיות עם צבע חומצה גרעין.
    6. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם PBS.
    7. להרכבה, הסר את עודף הנוזלים והחיל מדיית הרכבה וסיכות. מייבשים את השקופיות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס.
       הערה: הפתרונות המשמשים להכתמה עלולים להיות מסוכנים. להפחית את הסיכון לחשיפה באמצעות מכסה מנוע אדים כימי, נהלים מתאימים וציוד מגן אישי. עיין ב- MSDS לקבלת מידע נוסף.
12. לבצע אימונוכימיה של הריאה כדי להעריך עוד יותר ובמיוחד את איחוי כלי הדם. לדוגמה, כתם חלק של תאי שריר יכול לשמש כדי להעריך את השרירים של כלי הדם, בעוד פון Willebrand פקטור הכתמה יכולה לשמש כדי לדמיין שינויים אנדותל. שיטות אלה מתוארות במקום אחר⁵.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את יצירת מודל Hypoxia/SU5416 לזימת PH בעכברים. יתר על כן, אנו מפרטים את כל השלבים הדרושים לביצוע הערכת כלי דם ולב ריאתיים בסוף תקופת התצפית.

מבט כולל על העיצוב הניסיוני של דגם זה מוצג באות 1A^13,14. עכברים נתונים היפוקסיה נורמובארית (10% O_{2) ומוזרק}תת עורית פעם בשבוע עם SU5416 במשך שלושה שבועות רצופים. הגירויים המשמשים לגירוי PH בפרוטוקול זה מוצגים באות 1B ו- 1C.

אנטגוניסט קולטן VEGF SU5416 פועל על ידי גרימת אפופטוזיס תא אנדותל, ולכן, המאפשר את ההתפשטות של תאים אפופטוזיס עמיד אנדותל. זה מוביל לשיפוץ כלי דם בכלי הדם בכלי הדם הריאתי והתנגדות כלי דם מוגברת⁵. הלחץ הגבוה במחזור הדם הריאתי מגביר את עומס העבודה של הקרוואן ומוביל בהדרגה לתפקוד לקוי של RV ולכישלון⁹. בשלב הראשון, ניתן להעריך את ההצלחה של פרוטוקול Hypoxia/SU5416 על-ידי הערכה פונקציונלית של פונקציית ה- RV בסוף תקופת התצפית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את ההערכה הפולשנית של הלחץ סיסטולי RV באמצעות שיטת מדידת לחץ RV החזה הפתוח. עקומות לחץ מייצגות וניתוח כמותי של הלחץ בחדר הימני מוצגים באות 2.

איך אנחנו יכולים לכמת את איחוי כלי הדם, מה שמוביל להתנגדות גבוהה לכלי דם וכתוצאה מכך PH? היסטומורפוזיה היא תקן הזהב לאפיון כלי הדם הריאתיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט את פרוטוקול ההמטוקסילין & אאוסין כתמים (H&E). לאחר הכתמה ולכידת התמונות, ניתן להבחין בעורקי הריאות בקטן (<50 μm) ובגדולים יותר (> 50 μm). עורקי הסיפונות לא נכללו במחקר שלנו. להערכת עובי המדיאלי, נמדדים הגורמים החיצוניים (ED), כמו גם הקוטר הפנימי (ID) של העורקים. תמונות מייצגות של עורקי ריאות שעברו שיפוץ לאחר טיפול Hypoxia/SU5416 מוצגות באיור 3א. אחוז עובי העורקים ביחס קוטר חוצה חתך מוצג באיור 3B. הניתוח המוקפאומטרי של עורקי ריאות דיסטליים מדגים עלייה משמעותית בעובי מדיאלי בעכברים שטופלו בהיפוקסיה/SU5416 בהשוואה לבעלי חיים נורמוקסיה(איור 3).

עומס העבודה המוגבר מוביל היפרטרופיה RV ו ככל שהמחלה מתקדמת פיברוזיס RV^9,15. היפרטרופיה RV ניתן להעריך מורפומטרית על ידי מדידת מדד פולטון (RV / LV + Septum) כמו גם על ידי מדידת היפרטרופיה cardiomyocyte (CM). יחס המשקל של החדר הימני (RV) לחדר השמאלי (LV) בתוספת מחיצה [RV/(LV+S)] מחושב כאינדקס של היפרטרופיה בחדר הימני. תוצאות מייצגות ממדד פולטון בהיפותיות/SU5416 ועכברי נורמוקסיה מוצגות באיור 4ב'. השיטה המתוארת כאן להערכת היפרטרופיה CM היא הכתמה של חלקים בחדר הימני עם נבט חיטה Agglutinin (WGA). WGA נקשר גליקופרוטינים של קרום התא והוא יכול לשמש לקביעת האזור חוצה חתך של myocytes^16,17. תמונות מייצגות של מקטעים חדריים ימניים מוכתמים ב- WGA מוצגות באיור 4A. כימות של שטח CM בעכברים נגועים ובקרה מוצגים באיור 4א. Hypoxia/SU5416 חשיפהגורמת לעלייה ניכרת בגודל cardiomyocyte והיפרטרופיה בחדרהימני (איור 4). אנחנו ואחרים הראו בעבר כי, בהשוואה ללהיט יחיד (רק היפוקסיה), Hypoxia/SU5416 מחמיר את פנוטיפ RV^5,18.

איור 1: מבט כולל על שיטת היפוקסיה/SU5416. (א) עיצוב ניסיוני עבור דגם העכבר היפוקסיה/SU5416. SU5416 מוזרק תת עורי פעם בשבוע במשך 3 שבועות רצופים. (ב) ייצוג סכמטי של מערכת ההיפוקסיה. הבקר חש ומווסת חמצן בתוך התא על ידי החדרת חנקן דרך צינור עירוי הגז. מבנהכימישל SU5416. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: לחץ חדר ימין בעכברים חשופים להיפות דם כרונית בשילוב עם הזרקת SU5416. (A) מעקבים מייצגים של מדידות לחץ פולשניות של החדר הימני (RV). (ב)לחץ סיסטולי RV ב Hypoxia / SU5416 עכברים ובעלי חיים שליטה חשופים נורמוקסיה. n = 6-8 עכברים לכל קבוצה. p < 0.001. כל הנתונים הכמותיים מדווחים כאמצעי ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: היפוקסיה/SU5416 גורם לשיפוץ כלי דם ריאתיים. (א) נציג המטוקסילין / אאוסין קטעים מוכתמים של ריאות מהקבוצות שצוינו להפגין עובי קיר מדיה מוגברת בעורקי ריאות של עכברים Hypoxia / SU5416. סרגל קנה מידה: 50 μm. (ב) אחוז עובי מדיאלי של העורקים ביחס בקוטר חוצה חתך. n = 5 עכברים לקבוצה. p < 0.001. כל הנתונים הכמותיים מדווחים כאמצעי ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: היפרטרופיה חדרית ימנית בעכברים חשופים להיפות רקמות כרונית בשילוב עם הזרקת SU5416.(A)נציג WGA (נבט חיטה Agglutinin) כתם של רקמת החדר הימני לאחר הטיפול שצוין. סרגל קנה מידה: 50 μm. (מימין) אני לא יודע. ניתוח כמותי של הנתונים. n = 5 עכברים לקבוצה. (ב)היפרטרופיית RV המשתקפת במשקל RV מעל LV בתוספת יחס משקל של מחיצה (S) (אינדקס פולטון= RV/LV+ S) בכל קבוצה. n = 8 עכברים לכל קבוצה. p < 0.001. כל הנתונים הכמותיים מדווחים כאמצעי ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד מודל PH בעכברים על ידי שילוב שני גירויים פתולוגיים: היפוקסיה כרונית והזרקת SU5416 (Hypoxia/SU5416)¹⁸. בניסיון לתאם מודל עכבר זה עם מצב PH אנושי, אחד חייב באופן בלתי נמנע להסתכל על סיווג PH הנוכחי, המוצג בטבלה 1. PH כמעט בכל הצורות מאופיין על ידי התכווצות כלי דם ריאתיים והתפשטות חריגה של אנדותל ותאי שריר חלקים. זה מוביל ללחץ מוגבר בעורקי הריאות וכתוצאה מכך עומס נוסף מוגבר של החדר הימני.

כל ניסיון לאפיין מודל של בעלי חיים של PH צריך לכלול ראיות של האיחוי היסטופתולוגי של כלי הדם הריאתיים ואת החדר הנכון. מודל עכבר היפוקסיה יחיד ליכה מוביל צורה קלה של שיפוץ כלי דם^2,3. ממצאים פתולוגיים אלה כוללים שרירים של כלי דם שלא היו שריריים בעבר, בליווי תא אנדותל, תא שריר חלק והתפשטות פיברובלסט. ממצאים אלה מחמירים על ידי תוספת של הלהיט השני (הזרקת SU5416). ההשפעות הפיכות במודל יחיד להיט (היפוקסיה) ורק הפיך חלקית במודל Hypoxia / SU5416.

סיבת המוות העיקרית עבור חולי PH היא כשל החדר הנכון (RVF)^4,,20. שיפוץ כלי דם ריאתיים במודלים של בעלי חיים לא תמיד מלווה ב-RVF. על מנת לאפיין מודל של בעלי חיים במונחים של RVF נתונים מורפולוגיים, פונקציונליים ומולקולריים יש לנתח. האחרון הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. שיפוץ מורפולוגי של RV כולל היבטים מאקרו ומיקרוסקופיים. ברמה המקרוסקופית, האינדקס העיקרי עבור היפרטרופיה RV הוא אינדקס פולטון, המוגדר כשקל ה- RV המחולק על-ידי המשקל השמאלי (LV) ו-Septum (S) (RV/LV+S). ברמה המיקרוסקופית, פיברוזיס, דלקת, היפרטרופיה ניתן להעריך על ידי סיריוס אדום, המטוקסילין / אאוסין ו WGA כתם, בהתאמה.

העכבר Hypoxia / SU5146 מודל (אשר מתואר כאן) מראה תפקוד לקוי של RV, כפי שנמדד על ידי לחצים סיסטוליים גבוהים וקריטריונים מורפולוגיים. לגבי שיפוץ כלי דם ריאתיים, היפרטרופיה מדלה נצפתה שלושה שבועות לאחר החניכה של הפרוטוקול. בהשוואה למודל Hypoxia/SU5416 בחולדות, מודל העכבר אינו גורם לכשל בקרוואן (רק תפקוד לקוי מתון), אינו מוביל לאנגיופתיה משמידה חמורה, כפי שנצפה בבני אדם החולים קשות, ופתולוגיה ריאתית ameliorates לאחר החזרה לנורמוקסיה. בסך הכל, דגם העכבר Hypoxia/SU5416 מתאים לחקות פגיעה בכלי דם כפי שנתקלו PH, בעיקר קבוצה I (חלקית קבוצה III, ראה טבלה 1)^1,19. היתרון של מודל זה הוא היישום בעכברים מסוג פראי (ללא שינוי גנטי), יישום קל יחסית בעלות נמוכה, התמותה הנמוכה יחסית של בעלי החיים המחלות, והתפתחות מהירה של מחלת העניין (3 שבועות). ניתן ליישם בקלות מחקרי מניעת PH וטיפול במודל זה, ללא צורך בכישורים מתקדמים, בניגוד למודלים של מכרסמים כירורגיים.

בעת יישום הפרוטוקול קיימים מספר שלבים קריטיים, אשר יש לזכור. בעת תכנון המחקר, יש לזכור כי בקבוצת Hypoxia /SU5416 התמותה של בעלי החיים משתנה בין 0-10% (תצפיות שלא פורסם). לכן, כדי להגיע לכוח סטטיסטי ולהימנע מחקרים underpowered, לפחות 10 עכברים לכל קבוצה מומלצים. המסיסות של SU5416 נמוכה. לכן, DMSO או ממיס אחר (למשל תאית קרבוקסימתיל, CMC) יש להשתמש. DMSO במינונים גבוהים יכול להיות רעיל. LD₅₀ לשימוש תת עורי (s.c. ) בעכברים דווח להיות 13.9 - 25.6 g/kg^21,22. LD₅₀ מוגדר כמינון הנדרש להרוג 50% מחברי האוכלוסייה שנבחנה לאחר משך בדיקה^{שצוין 21,22}. עבור עכבר ששוקל 25 גרם, נעשה שימוש ב-4.4 גר'/ק"ג של DMSO (חישובים המבוססים על צפיפות DMSO של 1.1 ג'/מ"ל ו- 0.1 מ"ל מוחלים S.c./mouse). לכן, המינון שניתן תת עורית הוא הרבה יותר נמוך מאשר ערך LD_50. בידיים שלנו, היישום של SU5416 מומס DMSO, כמתואר כאן, יכול לגרום לגירוי בעור במקרים מסוימים, אבל אין תופעות רעילות אחרות נצפו. עם זאת, מספר דיווחים ממליצים על השימוש ב-CMC כרכב חלופי ל-SU5416¹⁴. בעת ביצוע מדידות פונקציונליות RV, תשומת לב קרובה יש לשלם בטמפרטורת הגוף, דימום, ועומק של הרדמה, כפי שהוערך על ידי בדיקת רפלקסים העכבר. טכניקת החזה הפתוח להערכת לחץ הקרוואן, כמתואר כאן, יש את היתרון של מיושם בקלות אפילו על ידי משתמש חסר ניסיון. לשיטת החזה הסגור^{(המתוארת במקומות אחרים 23,24,,25)}יש יתרון של להיות פחות פולשנית, ולכן ניתן ליישם אותה גם בניסויים שאינם סופניים. זה דורש למרות רמה גבוהה של מומחיות.

לאחר התיאור הראשון של מודל Hypoxia /SU5416 בחולדות, מודל העכבר שימש בהצלחה במספר מחקרים⁵,^9,,13. עם זאת, יש ראיות כי התוצאות תלויות הרקע הגנטי ומין של העכברים, היצרן של SU5416 ואת התדירות של הזרקת SU5416²⁶. בעוד הזרקת SU5416 על פני שלושה שבועות רצופים מוביל PH בעכברים, מנה אחת לא לגרום PH⁴. יתר על כן, צורות אחרות של PH, כגון אלה הקשורים למחלות לב שמאל או בשל מחלה טרומבואמבולית כרונית, דורשים מודלים הקשורים לאטיולוגיה. טיפולים חדשים צריכים להיבדק לפחות 2 מודלים בעלי חיים שונים, לפני היכולת לסלול את הדרך ללימודי תרגום.

לסופרים אין על מה להצהיר.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי (AHA- 17SDG33370112 ו 18IPA34170258) ומהכונים הלאומיים לבריאות NIH K01 HL135474 כדי Y.S. O.B נתמך על ידי דויטשה הרצסטיפטונג.