Индукция и характеристика легочной гипертензии у мышей с использованием модели Hypoxia/SU5416

Этот протокол описывает индукцию легочной гипертензии (PH) у мышей на основе воздействия гипоксии и инъекции антагониста рецепторов VEGF. У животных развивается гипертрофия PH и правого желудочка (Р.В.) через 3 недели после начала протокола. Представлена также функциональная и морфометрическая характеристика модели.

Легочная гипертензия (ПХ) является патофизиологическим состоянием, определяемым средним артериальным давлением легких, превышающим 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, по оценке катетеризации правого сердца. Широкий спектр заболеваний может привести к PH, отличающийся в своей этиологии, гистопатиологии, клинической презентации, прогноз, и ответ на лечение. Несмотря на значительный прогресс в последние годы, PH остается непросамых заболеваний. Понимание основных механизмов может проложить путь для разработки новых методов лечения. Модели животных являются важными инструментами исследования для достижения этой цели. В настоящее время существует несколько моделей, доступных для повторного воспроизведения PH. В этом протоколе описывается двухухитовая модель PH мыши. Стимулами для развития PH являются гипоксия и инъекция SU5416, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) антагонист рецепторов. Через три недели после начала Hypoxia/SU5416, животные развивают легочную сосудистую ремоделирование, имитирующее гистопатологические изменения, наблюдаемые в PH человека (преимущественно Группа 1). Сосудистая ремоделирование в легочной циркуляции приводит к реконструкции правого желудочка (Р.В.). Подробно описаны процедуры измерения давления Р.В. (с использованием метода открытой грудной клетки), морфометрический анализ Р.В. (путем вскрытия и взвешивания обоих желудочков сердца) и гистологические оценки ремоделирования (как легочной путем оценки сосудистой ремоделирования, так и сердечной путем оценки гипертрофии и фиброза кардиомиоцитов). Преимуществами этого протокола являются возможность применения как в диком типе, так и у генетически модифицированных мышей, относительно легкая и низкая стоимость реализации, а также быстрое развитие болезни интереса (3 недели). Ограничения этого метода в том, что мыши не развиваются тяжелые фенотип и PH обратима по возвращении к нормоксии. Профилактика, а также исследования терапии, могут быть легко реализованы в этой модели, без необходимости передовых навыков (в отличие от хирургических моделей грызунов).

Легочная гипертензия (PH) является патофизиологическим состоянием, определяемым средним давлением легочной артерии (ПА), превышающим 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, по оценке катетеризации^{правого сердца 1,2}. Существует целый ряд заболеваний, которые могут привести к PH. В попытке организовать условия, связанные с PH, было разработано несколько классификационных систем. Текущая клиническая классификация классифицирует множественные заболевания, связанные с PH, в 5 различных^{группах 1.} Это различие имеет важное значение, поскольку различные группы пациентов имеют заболевания, которые отличаются в их клинической презентации, патологии, прогноз, и ответ на^{лечение 2}. В таблице 1 кратко излагается нынешняя классификация, дополненная основными гистопатологическими характеристиками каждого заболевания.

Таблица 1: Обзор клинической классификации PH, наряду с основными гистопатологическими особенностями в группах. Пригодность протокола Hypoxia/SU5416 для моделирования PH. Эта таблица была изменена с¹⁹. PH: Легочная гипертензия, ПАГ: Легочная артериальная гипертензия

Несмотря на значительные достижения в лечении заболеваний, связанных с PH, PH по-прежнему остается без лечения, с 3-летним коэффициентом смертности в диапазоне от 20% до 80%³. Это указывает на настоятельную необходимость понимания основных механизмов PH и, после этого, развитие новых методов лечения для предотвращения, замедления прогрессирования и лечения болезни. Модели животных имеют решающее значение для этого масштаба. В настоящее время существуют различные модели для изучения PH. Заинтересованный читатель относится к отличным отзывам на эту тему^2,,3,,4. Принимая во внимание разнообразие заболеваний, ведущих к PH, очевидно, что различные условия человека PH не могут быть полностью резюмированы в одной модели животных. Доступные модели животных можно классифицировать в i) одноразовых, ii) двух-хит, iii) нокаутом, и iv) модели переэкспрессии³. В одноразовых моделях PH индуцируется одним патологическим стимулом, в то время как двухуголютные модели сочетают в себе два патологических стимула с целью индуцирования более тяжелого PH и, таким образом, более тесно имитируют сложные заболевания человека. Помимо этиологических различий, несколько стимулов приводят к различиям в моделировании PH, которые зависят также от вида и генетического фона животных^4.

Один из наиболее часто используемых классических моделей PH грызунов является хроническая гипоксия^{модель 2}. Гипоксия, как известно, вызывают PH у людей, а также в нескольких видах животных. Гипоксия имеет то преимущество, что физиологический стимул для PH (Таблица 1). Однако, в то время как степень гипоксии, используемой для индуцирования PH у грызунов является гораздо более серьезным, чем у людей, одно оскорбление (гипоксия) приводит только к легкой форме сосудистой ремоделирования. Это не имитирует тяжесть болезни человека. Добавление второго удара, дополнительный стимул для индуцирования PH, показал многообещающие результаты: инъекция соединения SU5416 грызунов в сочетании с гипоксическим стимулом вызывает более тяжелые ФЕНОтип^2,5,6. SU5416 является ингибитором сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) рецептора-2. Он блокирует рецепторы VEGF и приводит к эндотелиальной апоптоз клеток. В гипоксических условиях это стимулирует распространение подмножества апоптоз-устойчивых эндотелиальных клеток. Кроме того, SU5416 приводит к гладкой пролиферации мышечных клеток. Сочетание этих эффектов приводит к патологическое сосудистое ремоделирование легочной циркуляции и приводит к повышенному давлению ПА и правого желудочка^{ремоделирования 2,5,7}. Модель была сначала описана у крыс^6, а затем применена к^{мышам 4,,5,,7.} Модель мыши демонстрирует менее тяжелую сосудистую ремоделирование по сравнению с крысами. Кроме того, когда возвращается к нормоксия, PH продолжает прогрессировать у крыс, в то время как у мышей это частично обратимым.

В следующем протоколе описаны все шаги по моделированию PH у мышей с использованием метода Hypoxia/SU5416 (планирование, хронология, исполнение). Кроме того, характеристика модели описана в этом протоколе: функционально (путем инвазивного измерения давления правого желудочка (РВ) с использованием открытой техники грудной клетки), морфометрически (путем вскрытия и взвешивания как правого, так и левого желудочков), а также гистологически (путем оценки ремоделирования легочной сосудистой системы, гипертрофии правого желудочка и фиброза).

Все шаги и методы, описанные в этом протоколе, могут быть легко реализованы следователями на любом уровне опыта. Хотя функциональные измерения Р.В. с использованием открытой техники груди (описанный здесь) не является золотым стандартом метода в этой области, он имеет то преимущество, что он может быть быстро изучены и точно воспроизведены даже менее опытный экспериментатор.

Перед любыми экспериментами на животных получить разрешение местного институционального комитета по уходу за животными. Нынешние эксперименты были проведены после одобрения Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Икан на горе Синай.

1. Индукция PH

1. Подготовка
   1. Перед началом исследования тщательно спланируйте экспериментальный проект. Убедитесь, что мыши подвергаются гипоксии в то же время, как первая инъекция SU5416. Пример экспериментальной конструкции для индуцирования PH с использованием метода Hypoxia/SU5416 показан на рисунке 1A. Контрольные мыши получили только транспортное средство. Для этой модели, SU5416 будет вводиться мышам один раз в неделю в течение 3 недель подряд.
   2. Используйте восемь-двенадцать недель C57BL/6 мышей для этого исследования. Дом животных на 18-20 градусов по Цельсию в 12-ч светло-темный цикл. Убедитесь, что пища и вода доступны объявление libitum.
   3. Взвесь животных. Назначьте их случайным образом каждой группе: Нормоксия и Гипоксия/SU5416.
   4. Подготовь гипоксическую камеру, как показано на рисунке 1B. Безопасный азот (N₂₎танки возле камеры. Установите кислород (O₂) контроллер в точке 10% O₂. Пусть система достигнет стабильного состояния.
   5. Подготовка SU5416 для инъекций (использовать дозу 20 мг/кг массы тела). SU5416 не растворяется в aqueous решениях; таким образом, растворить расчетную сумму в 100 йл DMSO⁸. Например, для мыши объемом 25 г количество вводимого SU5416 составляет 0,5 мг, растворенного в растворителях 100 л (DMSO). Окончательная концентрация SU5416 для этой мыши, таким образом, 5 мг/мл.
      ВНИМАНИЕ: SU5416 является опасным материалом. Внимательно прочитайте лист данных по безопасности в сопровождении продукта и убедитесь, что принять рекомендуемые меры предосторожности при обработке этого вещества. Носите защитные перчатки и (как для любой инъекции) использовать защиту глаз. Химическая структура SU5416 показана на рисунке 1C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте соответствующее превышение раствора, чтобы компенсировать объем, который будет потерян во время инъекции (например, в шприце, флаконе и т.д.). В зависимости от используемого шприца, мертвый объем составляет около 200 мл. Для группы из 10 мышей, вычислить превышение 2 дозы мыши.
   6. Приготовьте шприцы для инъекций. Используйте шприцы 1 мл с иглами 25 G x 5/8.
2. Подкожная инъекция SU5416
   1. Сдерживайте животное. Поместите мышь на крышку клетки, чтобы помочь сдержанности. Возьмитесь за кожу и сформив палатку параллельно позвоночнику. Убедитесь в том, чтобы схватиться за затылок плотно, чтобы избежать потенциальной травмы укуса мышью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Присутствие двух исследователей делает процедуру быстрее и точнее, как можно держать животное в то время как другой выполняет инъекцию.
   2. Вставьте иглу подкожно над флангом на свободной складке кожи. Убедитесь в том, чтобы вставить иглу параллельно коже. Избегайте проникновения брюшной стенки.
   3. Ввись содержимое шприца (100 МКЛ растворенного SU5416 или транспортного средства).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать утечки после полной доставки, держите шприц около 10 с и слегка поверните иглу под кожей.
   4. Свями иглу и верните животное в клетку. После инъекции SU5416 поместите клетки в вентилируемую гипоксию.
3. Воздействие гипоксии
   1. Мониторинг вентиляции с течением времени. Убедитесь в том, чтобы поддерживать 10% кислорода. Поддержание нормоксии животных в полу-уплотняемой камере в на 21% O₂.
   2. Убедитесь, что камеры оснащены датчиком кислорода для измерения уровня кислорода. Избегайте обширного открытия камер. Для очистки и добавления пищи и воды открыты камеры не более 20 минут каждые 3 дня.
   3. Осматривать животных ежедневно. Рассмотрим стресс сигналы, такие как пилоэрекция или значительная потеря веса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: животные под Гипоксия / SU5416, как ожидается, похудеть⁵. Это свидетельствует о развитии болезни.
   4. Повторите инъекцию SU5416 еженедельно в течение 3 недель подряд (см. рисунок 1A А для обзора экспериментального дизайна).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение места инъекции может помочь уменьшить раздражение кожи.

2. Функциональная характеристика путем инвазивных измерений давления Р.В.

1. Подготовка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите режим анестезии. Можно использовать инъекционные или ингаляционные анестезии. Так как небольшая передозировка инъекционных анестезий (особенно от кетамина/ксилазина или пентобарбитала) может существенно повлиять на работу сердца, рекомендуется применение летучих анестетики. Очень важно использовать один и тот же анестетик для всех мышей в рамках исследования.
   1. Используйте испаритель, чтобы обеспечить точную дозу анестезии на животное. Доза для изофлюрана следующая: индукция 3-4%, техническое обслуживание 1% смешивается со 100% кислородом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты и избегайте дыхания пара.
   2. Подготовьте грелку и/или греющие лампы для поддержания температуры тела. Подготовь зонд прямой температуры для мониторинга температуры тела.
   3. Обеспечь правильную вентиляцию. Подготовь аппарат искусственной вентиляции легких заранее. Подготовь разъем Y-трубки и проверьте функцию вентилятора с помощью ручного режима. Убедитесь, что водрянное давление составляет lt;1 см H₂O, чтобы избежать баротравмы. Установите частоту дыхания на 110 вдохов в минуту.
   4. Подготовь эндотрахеаную трубку, разрезая внутрисосудистый катетер 20 Г.
   5. Подготовь необходимые инструменты: небольшие типсы, ножницы, эластичные втягиватели крючка, сосудный прижигатель и ватные тампоны. На ватный тампон настроить небольшой 25 G х 5/8 "игла, которая будет использоваться, чтобы сделать небольшой прокол в правом желудочков.
   6. Подготовьтесь к катетеру давления, блоку контроля громкости давления и инициируем программному обеспечению для сбора данных. Поместите PV катетер в 15 мл трубки заполнены PBS при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут и калибровать в соответствии с протоколом производителя.
   7. Для перфузии и фиксации органов, подготовить PBS и раствор 50% PBS / 50% OCT. Подготовка 2 х 10 мл шприцев (с иглой 25 G): один будет использоваться для perfusing сердца и легких с PBS на месте и второй для введения OCT / PBS (50/50) решение для легких образца, который будет использоваться для еготологического исследования.
2. Интубации
   1. Взвесить мышь и записать состояние здоровья перед анестезией.
   2. Индуцировать анестезию с 3-4% изофлюраном. Проверьте глубину анестезии, проверяя рефлекс щипать ноги: щепотку ноги одной из конечностей твердо. Если животное выводит конечность, это признак недостаточной анестезии.
   3. После индукции анестезии побрить шею и область грудной клетки.
   4. Поместите мышь на грелку. Поместите зонд прямой температуры для мониторинга температуры тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание температуры тела имеет важное значение для функциональных измерений. Температура тела должна быть примерно 36,5-37 градусов по Цельсию.
   5. С помощью изогнутых тибров прикрепляйте шовную нить к верхним резцами мыши, растягивайте и закрепите на грелке хирургической лентой. Защитите конечности мыши с помощью хирургических лент.
   6. Для интубирования животное делает небольшой разрез примерно на 1 см в медиальной коже шейки матки с помощью маленьких ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Устная илюбовь является альтернативным методом, который требует большего опыта.
   7. С хлопчатобумажным аппликатором прямо отделить околоушные и подменные слюнные железы на среднем уровне. Это будет подвергать мышцы чрезмерно трахеи.
   8. Тщательно сократить эти мышцы подвергая трахеи.
   9. С помощью маленьких ножниц сделайте небольшой разрез между трахеевыми хрящами и вставьте подготовленную эндотрахеаную трубку. Вынул металлический направляющий выступ внутрисосудистого катетера.
   10. Подключите катетер к аппарату искусственной вентиляции легких. Проверить положение трахеи трубки вручную осторожно надув легких. Закрети положение лентой.
   11. Поддерживайте 1% изофлюрановую анестезию на протяжении всей процедуры.
   12. Регулярно следите за глубиной анестезии, проверяя рефлекс щепотки нося. Отрегулируйте анестезию соответствующим образом.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая скорость сердечных сокращений во время экспериментов, под 1% изофлюран анестезии, составляет около 400 ударов / мин. Поддержание температуры тела и анестезии имеют важное значение для контроля сердечного ритма. Избыток изофлюрана может снизить сердечный ритм. Тем не менее, восстановление может быть достигнуто за счет снижения скорости изофлюрана.
3. Измерения давления Р.В. (открытый подход к груди)
   1. С небольшими ножницами выполнить разрез кожи примерно на 1 см над процессом xiphoid и верхней части брюшной полости. Отделяйте кожу, покрывающую грудь и брюшную стенку верхних брюшной квадранты: начните с средней линии, дистальной к кифоиду и осторожно двигайтесь боково с обеих сторон. Используйте термокаутерию для контроля кровотечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы иметь доступ к грудной полости через брюшную стенку.
   2. Откройте брюшную полость и тщательно перережьте диафрагму, заботясь о том, чтобы не повредить бьющееся сердце или легкие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы разоблачить вершину и правый желудочек сердца. Хорошее воздействие и вид на сердце имеют решающее значение для правильного размещения катетера. Это имеет большое значение, чтобы избежать кровотечения на протяжении всей процедуры. Даже небольшие изменения внутривазового объема могут изменить нагрузку правого сердца и повлиять на записанные параметры.
   3. Аккуратно удалите перикард с помощью хлопчатобумажного аппликатора.
   4. Перед тем, как поместить катетер давления в сердце, принесите катетер рядом с мышью.
   5. Использование подготовленного хлопчатобумажного аппликатора с иглой наносит колото-резаную рану в апической дистальной части правого желудочка. Аккуратно снимите иглу и вставьте катетер давления в это отверстие.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно работать без применения силы. В случае, если это невозможно, попробуйте сделать новое отверстие рядом с первым, чтобы избежать длительной травмы сердца. Игла не должна быть вставлена более глубоко, чем примерно 3 мм.
   6. Вставьте катетер давления параллельно направлению правого желудочка, с кончиком, обращенный к легочной артерии.
   7. Следите за отслеживанием волны давления, чтобы обеспечить правильное позиционирование катетера. Отслеживание представителей продемонстрировано на рисунке 2.
   8. Позвольте сигналу давления стабилизироваться. Пауза дыхания и получить по крайней мере 3 измерения. В период между отдельными измерениями позволяют животному проветриваться.
   9. После того, как все измерения будут записаны удалить катетер и поместить его обратно в PBS заполнены трубки в водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения эксперимента очистите катетер в соответствии с инструкциями производителя.
4. Эвтаназия и перфузия легких
   1. По завершении эксперимента усытворяют мышь путем exsanguination.
   2. Откройте грудь широко. Используя ножницы, разрежьте всю грудину и обратите внимание, чтобы не повредить сердце или легкие.
   3. Использование ножниц радужной оболочки делает небольшой разрез в левом желудочков, чтобы кровь покинуть камеру.
   4. Поместите 25 G иглы шприца, содержащего 10 мл PBS в правом желудочков и вводить раствор PBS, пока легкие не будут очищены от крови.
   5. После того, как этот шаг будет завершен, подтвердить эвтаназии жизненно важных тканей урожая (сердце и легкие): сократить кавы и аорты вложения и удалить сердце и легкие ан блок.

3. Морфометрическая характеристика

1. Сразу после удаления сердца и легких (шаг 2.4.5), изолировать сердце и удалить оба атрии. С изогнутыми ножницами тенотомии тщательно рассекают правый желудочек (РВ) от левого желудочка (LV), оставляя перегородку (S) с левым желудочковым. Взвешивание Р.В. и LV-S и вычислить индекс Фултона Р.В. / ЛВЗ S (Рисунок 3)^5,9.
2. Возьмите часть правого желудочка и поместите его в OCT предварительно заполненные встраивания формы. Используйте другую часть правого желудочка для анализа РНК и/или белка. Заморозить в сухом льду и хранить при -80 градусов по Цельсию.
3. Используйте ножницы радужной оболочки глаза, чтобы изолировать легкие от сердца и любой другой оставшейся ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки легких, перфузия, как описано выше (Шаги 2.4.3-2.4.5) имеет большое значение.
4. Привязать заморозить часть легких и хранить его для РНК, извлечения белка или других анализов.
5. Используйте другую часть легких для гистологического анализа. Для этого вставьте шприц, содержащий 50% PBS и 50% OCT в бронхе^{используемой доли 10,11}. Экспериментатор легко видит, что легкое раздувается, когда содержимое шприца проливается в ткани.
6. Поместите эти кусочки легких в встраивание формы предварительно заполнены с OCT и оснастки заморозить их в сухой лед. Храните образцы при -80 градусов по Цельсию после того, как они заморожены.
7. Подготовьте 8 мкм секций Р.В. и легких с помощью криостата машины. Воздух сушит секции при комнатной температуре в течение 30 мин.
8. Исправить слайды при комнатной температуре с помощью 10% параформальдегида (PFA) в течение 10 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PFA является известным канцерогеном человека. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь к листу данных о материальной безопасности (MSDS).
9. Оценка сосудистой ремоделирования гематоксилин/эосин окрашивание
   Примечание: Выполните гематоксилин / Эозин окрашивания для того, чтобы оценить структурные изменения сердца и сосудистой ремоделирования в легких(рисунок 3).
   1. Пятно с раствором гематоксилина в течение 8 мин.
   2. Промыть проточной водопроводной водой в течение 5 минут, а затем быстро промыть в дистиллированной воде.
   3. Промыть в 95% EtOH в течение 1 мин и контр-пятно в растворе эозин в течение 1 мин.
   4. Обезвоживание (80% этанола 10-30 с, 100 этанола в течение 1 мин и 100% Толуол в течение 3 мин).
   5. Гора и крышка с крышкой. Высушите горки на ночь при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решения, используемые для окрашивания могут быть опасными. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь в MSDS.
10. Оценка фиброза правого желудочка Пикросириусом Красным Окрашивание
    ПРИМЕЧАНИЕ: В Picrosirius Красное окрашивание, Picrosirius красный, который является кислотой, связывается с коллагеном¹². Таким образом, это окрашивание может быть использовано для гистологического исследования содержания коллагена.
    1. Инкубировать горки в разогретом растворе Буина при 58 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    2. Вымойте горки в проточной водопроводной воде, чтобы удалить желтый цвет из секций в течение 10-15 мин.
    3. Пятно в 0,1% Быстрый зеленый в течение 20 мин при комнатной температуре.
    4. Промыть в 1% уксусной кислоты в течение 1 мин.
    5. Промыть в водопроводной воде в течение 5 минут.
    6. Пятно в 0,1% Сириус красный в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим обезвоживанием в Толуол.
       ВНИМАНИЕ: Решения, используемые для окрашивания, могут быть опасными. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь в MSDS.
11. Р. кардиомиоцитов гипертрофии оценки WGA Стейнинг
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гипертрофия правого желудочка (Р.В.) на клеточном уровне может быть оценена путем выполнения окрашивания зародыша пшеницы (WGA)(рисунок 4).
    1. Исправить слайды в холодном растворе ацетона в течение 15 минут, а затем 3 шага стирки в PBS (5 минут каждый).
    2. Блок с 10% козьей сыворотки в растворе Dako в течение 30 минут при комнатной температуре.
    3. Инкубировать слайды с WGA: Добавить WGA 1:200 и инкубировать в течение 1 1 / 2 ч при 37 градусов по Цельсию в темноте.
    4. Вымойте слайды три раза с PBS.
    5. Инкубировать слайды с нуклеиновой кислоты красителя.
    6. Вымойте слайды три раза с PBS.
    7. Для монтажа снимите избыток жидкости и нанесите монтажные средства и крышку. Высушите горки в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте и храните при температуре 4 градусов по Цельсию.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Решения, используемые для окрашивания могут быть опасными. Снижение риска воздействия с помощью химического дыма капот, надлежащие процедуры и средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации обратитесь в MSDS.
12. Выполните иммунохимию легких для дальнейшей и конкретной оценки сосудистой ремоделирования. Например, гладкое окрашивание мышечных клеток может быть использовано для оценки мускулализации сосудов, в то время как окрашивание фактора фон Виллебранда может быть использовано для визуализации эндотелиальных изменений. Эти методы описаны в другом^{месте 5}.

В этом протоколе мы подробно описываем создание модели Hypoxia/SU5416 для индуцирования PH у мышей. Кроме того, мы подробно все необходимые шаги для выполнения легочной сосудистой и сердечной оценки в конце периода наблюдения.

Обзор экспериментального дизайна этой модели показан на рисунке 1A^13,14. Мыши подвергаются нормобатической гипоксии (10% O₂) и подкожно вводят один раз в неделю с SU5416 в течение трех недель подряд. Стимулы, используемые для индуцирования PH в этом протоколе, показаны на рисунке 1B и 1C.

Антагонист рецепторов VEGF SU5416 действует, вызывая эндотелиальный апоптоз клеток и, следовательно, допуская распространение апоптоза устойчивых эндотелиальных клеток. Это приводит к сосудистой ремоделирования в легочной сосудоугости и повышенной сосудистой резистентности⁵. Повышенное давление в легочной циркуляции увеличивает Р. после нагрузки и приводит постепенно к дисфункции Р.В. и отказ⁹. На первом этапе успех протокола Hypoxia/SU5416 можно оценить путем функциональной оценки функции Р.В. в конце периода наблюдения. В этом протоколе мы подробно описываем инвазивную оценку систолического давления Р.В. с помощью метода измерения давления открытой грудной клетки. Кривые репрезентативного давления и количественный анализ давления правого желудочка отображаются на рисунке 2.

Как мы можем количественно сосудистой ремоделирования, что приводит к повышенной сосудистой устойчивости и, следовательно, PH? Гистоморфометрия является золотым стандартом для характеристики легочной сосудов. В этом протоколе мы подробно описываем протокол гематоксилина и эозинного окрашивания (Н И Е). После окрашивания и захвата изображений, легочные артерии можно отличить в малых (Lt;50 мкм) и более крупных (nogt; 50 мкм). Бронхиальные артерии были исключены из нашего исследования. Для оценки медиальной толщины измеряется внешний (ЭД), а также внутренний диаметр (ID) артерий. Репрезентативные изображения реконструированных легочных артерий после лечения Hypoxia/SU5416 показаны на рисунке 3A. Процент медиальной толщины артерий по отношению к поперечному диаметру показан на рисунке 3B. Морфометрический анализ дистальных легочных артерий демонстрирует значительное увеличение медиальной толщины у гипоксии/SU5416 обработанных мышей по сравнению с животными нормоксия(рисунок 3).

Повышенная послезагрузка приводит к гипертрофии Р.В. и, как болезнь прогрессирует до^{фиброза Р.В. 9,15}. Гипертрофия Р.В. может быть оценена морфометрически путем измерения фултон-индекса (RV/LV-Septum), а также путем измерения гипертрофии кардиомиоцитов (CM). Соотношение веса правого желудочка (RV) к левому желудолю (LV) плюс перегородка «RV/(LV»S)» рассчитывается как индекс гипертрофии правого желудочка. Репрезентативные результаты фултон-индекса в Hypoxia/SU5416 и нормоксия мышей показаны на рисунке 4B. Метод, описанный здесь для оценки гипертрофии СМ является окрашивание правого желудочка разделов с пшеницей Герм Агглютинин (WGA). WGA связывается с гликопротеинами клеточной мембраны и может быть использован для определения поперечной области^{миоцитов 16,17}. Репрезентативные изображения правого желудочка разделы окрашены WGA показаны на рисунке 4A. Количественные оценки области СМ как у больных, так и у контрольных мышей показаны на рисунке 4.A. Гипоксия/SU5416 воздействие приводит к заметному увеличению размера кардиомиоцитов и гипертрофии правого желудочка(рисунок 4). Мы и другие ранее показали, что, по сравнению с одним хитом (только гипоксия), Гипоксия / SU5416 усугубляет фенотип^{Р.В. 5,18}.

Рисунок 1: Обзор метода Hypoxia/SU5416. (A) Экспериментальный дизайн модели мыши Hypoxia/SU5416. SU5416 вводится подкожно один раз в неделю в течение 3 недель подряд. (B) Схематическое представление гипоксии системы. Контроллер чувствует и регулирует кислород внутри камеры, вливая азот через газонастойную трубку. (C)Химическая структура SU5416. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Правое желудочковой давления у мышей, подверженных хронической гипоксии в сочетании с SU5416 инъекции. ( ) Представитель трассировки инвазивных измерений давления правого желудочка (RV).A (B) RV систолическое давление в Hypoxia/SU5416 мышей и контролировать животных, подверженных нормоксии. n 6-8 мышей на группу. p lt; 0.001. Все количественные данные сообщаются как средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Рисунок 3: Гипоксия/SU5416 вызывает легочную сосудистую ремоделирование. a) представитель гематоксилина/эозина окрашенных участков легких из указанных групп демонстрируют увеличение толщины стенок мультимедиа в легочных артериях мышей Hypoxia/SU5416. Шкала бар: 50 мкм. (B) Процент медиальной толщины артерий по отношению к поперечному диаметру. n 5 мышей на группу. p lt; 0.001. Все количественные данные сообщаются как средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Рисунок 4: Гипертрофия правого желудочка у мышей, подвергшихся воздействию хронической гипоксии в сочетании с инъекцией SU5416. (A)(Слева) представитель WGA (Wheat Germ Agglutinin) окрашивает правую желудочковой ткани после указанного лечения. Шкала бар: 50 мкм. (справа) Количественный анализ данных. n 5 мышей на группу. (B) Р. гипертрофия отражается на вес Р.В. над LV плюс интервентулярной перегородки (S) соотношение веса (Фултон индекс Р.В. / LV S) в каждой группе. n 8 мышей на группу. p lt; 0.001. Все количественные данные сообщаются как средства ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Этот протокол описывает, как моделировать PH у мышей, сочетая два патологических стимула: хроническая гипоксия и инъекция SU5416 (Hypoxia/SU5416)¹⁸. В попытке соотнести эту модель мыши с состоянием PH человека, неизбежно следует взглянуть на текущую классификацию PH, показанную в таблице 1. PH почти во всех формах характеризуется легочной сосудосуживающих и аномальной пролиферации эндотелиальных и гладких мышечных клеток. Это приводит к повышенному давлению в легочных артериях и, следовательно, к увеличению после нагрузки правого желудочка.

Каждая попытка охарактеризовать животное модель PH должны включать в себя доказательства гистопатологической реконструкции легочной сосудов и правого желудочка. Одно попадание гипоксии мыши модель приводит к мягкой форме сосудов ремоделирования^2,3. Эти патологические выводы включают в себя мышечную ранее немышечные сосуды, сопровождается эндотелиальной клетки, гладкой мышечной клетки и фибробластов пролиферации. Эти выводы усугубляются добавлением второго попадания (инъекция SU5416). Эффекты обратимы в однопоголожной (гипоксии) модели и лишь частично обратимы в модели Hypoxia/SU5416.

Основной причиной смерти пациентов с ПХ является отказ правого желудочка (РВФ)^4,,20. Легочная сосудистая ремоделирование в животных моделях не всегда сопровождается RVF. Для того, чтобы охарактеризовать модель животных с точки зрения морфологических, функциональных и молекулярных данных РВФ, необходимо проанализировать. Последнее выходит за рамки настоящего протокола. МОРФологическая реконструкция Р.В. включает в себя как макро-, так и микроскопические аспекты. На макроскопическом уровне основным индексом гипертрофии Р.В. является индекс Фултона, определяемый как вес Р.В., разделенный на левый желудочковый (LV) и septum (S) вес (RV/LV-S). На микроскопическом уровне, фиброз, воспаление и гипертрофия могут быть оценены Сириус красный, гематоксилин / Эозин и WGA окрашивания, соответственно.

Модель мыши Hypoxia/SU5146 (которая описана здесь) показывает дисфункцию Р.В., измеряемую повышенным систолическим давлением и морфологическими критериями. Что касается ремоделирования легочных сосудов, то медиальная гипертрофия наблюдается через три недели после начала протокола. По сравнению с моделью Hypoxia/SU5416 у крыс модель мыши не вызывает отказа Р.В. (только умеренная дисфункция), не приводит к тяжелой облитеративной ангиопатии, как это наблюдается у тяжелобольных людей, а легочная патология амелиорируется после возвращения к нормоксии. В целом, мышь Hypoxia/SU5416 модель подходит для имитации сосудистых травм, как это встречается в PH, преимущественно группы I (частично группа III, см. таблицу 1)^1,19. Преимуществом этой модели является применение у диких (генетически неизмененных) мышей, относительно легкая и недостойная реализация, относительно низкая смертность больных животных и быстрое развитие болезни интереса (3 недели). Исследования ph профилактики и терапии могут быть легко реализованы в этой модели, без необходимости передовых навыков, в отличие от хирургических моделей грызунов.

При реализации протокола есть несколько критических шагов, которые следует иметь в виду. При планировании исследования следует иметь в виду, что в группе Hypoxia/SU5416 смертность животных колеблется от 0-10% (неопубликованные наблюдения). Таким образом, для того, чтобы достичь статистической мощности и избежать недостаточной мощности исследований, по крайней мере 10 мышей в группе рекомендуется. Стоимость SU5416 низка. Поэтому необходимо использовать ДМСО или другой растворитель (например, карбоксиметиловая целлюлоза, CMC). DMSO в высоких дозах может быть токсичным. Сообщается,_{что LD 50} для подкожного (с.к.) использования у мышей составляет 13,9 - 25,6 г/кг^21,,22. LD₅₀ определяется как доза, необходимая для убийства 50% членов тестируемой популяции после определенной продолжительности^{теста 21,22}. Для мыши, которая весит 25 г, используется 4,4 г/кг ДМСО (расчеты на основе плотности DMSO 1,1 г/мл и 0,1 мл применяется s.c./mouse). Таким образом, подкожная доза намного ниже, чем значение LD_50. В наших руках применение SU5416, растворенного в DMSO, как описано здесь, может вызвать раздражение кожи в некоторых случаях, но никаких других токсических эффектов не наблюдается. Тем не менее, в нескольких докладах рекомендуется использовать CMC в качестве альтернативного транспортного средства для SU5416¹⁴. При выполнении функциональных измерений Р.В., пристальное внимание должно быть уделено при температуре тела, кровотечения, и глубина анестезии, как оценивается путем тестирования рефлексов мыши. Открытая техника груди для оценки давления Р.В., как описано здесь, имеет то преимущество, что легко реализуется даже неопытным пользователем. Закрытый метод (описанный в другом^{месте 23,24,25}) имеет то преимущество, что менее инвазивным и, следовательно, может быть реализован также в не-терминальных экспериментов. Это требует, хотя высокий уровень знаний.

После первого описания модели Hypoxia/SU5416 у крыс, модель мыши была успешно использована в^{нескольких исследованиях 5,9,13}. Тем не менее, есть доказательства того, что результаты зависят от генетического фона и пола мышей, производитель SU5416 и частота инъекций SU5416²⁶. В то время как инъекционные SU5416 в течение трех недель подряд приводит к PH у мышей, одна доза не будет вызывать PH⁴. Кроме того, другие формы PH, такие как связанные с болезнью левого сердца или из-за хронической тромбоэмболической болезни, требуют этиологических моделей. Новые методы лечения должны быть протестированы по крайней мере в 2 различных моделях животных, прежде чем быть в состоянии проложить путь к трансляционным исследованиям.

Авторам нечего декларировать.

Эта работа была поддержана грантами Американской ассоциации сердца (AHA- 17SDG33370112 и 18IPA34170258) и от Национальных институтов здравоохранения NIH K01 HL135474 Y.S. O.B была поддержана Deutsche Herzstiftung.