Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Bu iletişim kuralı, yapay mikroRNA aracılı RNA müdahale optogenetics özellikle presynaptic boutons selektif gene(s) sağlam nöronal devreler içinde azaltılmış ifade ile uyarmak için birleştirmek bir iş akışı sağlar.

Bu iletişim kuralı gen nakavt etkisi presynaptic işlev içinde sağlam nöronal devreler karakterize amacıdır. Biz nasıl yapay mikroRNA (miR) birleştirmek için bir iş akışı tarif-RNA müdahale ile optogenetics akut beyin dilimleri içinde işlenmiş presynaptic boutons seçici uyarılması ulaşmak için aracılık. Deneysel bir tek viral yapı ve bir optogenetic sonda ve yapay miR(s) presynaptic gene(s) karşı ifade sürücü için tek bir nöron özel organizatörü kullanımını gerektirir. Stereotactically faiz beyin bölgesi enjekte edildiğinde ifade yapısı ışıkla sadece nöronlar gene(s) soruşturma altında azaltılmış ifade ile teşvik olanak sağlar. Bu strateji geliştirme ve genetiği değiştirilmiş fare satırlarının Bakım gerektirmez ve diğer organizmalar ve nöronal herhangi bir gen seçim için prensip olarak uygulanabilir. Biz son zamanlarda nasıl CA3 adlı kısa vadeli sinaptik plastisite CA1 eksitatör sinapslarda akut Hipokampal dilimleri içinde için alternatif splice izoformlarının presynaptic P/Q-tipi voltaj kalsiyum kanal (VGCCs) nakavt düzenleyen araştırmak için başvurdum. Benzer bir yaklaşım, değiştirmek ve nöronal devresi içinde vivoyoklama için de kullanılabilir.

Bu iletişim kuralı gen nakavt etkisi presynaptic işlev içinde sağlam nöronal devreler karakterize etmek için yeni bir yaklaşım açıklar. Presynaptic işlevinde olduğu gibi nöronal devreler araştıran pek çok presynaptic boutons çok küçük olduğundan ve uzak kombine moleküler ve Elektrofizyolojik müdahaleler izin vermek için soma meydan okuyor. RNA müdahale devirme sinaptik proteinler¹için güçlü ve esnek bir araç içerse bu yaklaşım idareli giriþi özelliðini kullanarak nakavt etkileri tespit etmek zordur çünkü presynaptic işlevi araştırmak için kullanılmıştır arasında ayrım yapmamak elektrik elektrodlar manipüle ve saf presynaptic boutons². Burada, biz nasıl yapay mikroRNA (miR) birleştirmek açıklayın-akut beyin dilimleri içinde işlenmiş presynaptic boutons seçici uyarılması elde etmek için son zamanlarda geliştirilen optogenetic teknolojisi ile RNA müdahale aracılı.

Koşullu nakavt fareler Elektrofizyoloji ile birlikte aynı zamanda presynaptic proteinler^3,4işlevi araştırmak için kullanılabilir gibi görünse, bizim strateji geliştirme ve bakım genetik olarak gerektirmez fare satırları değiştirilmiş ve aynı zamanda kolayca belirli bir gen izoformlarının vurmak için istihdam edilebilir. Göreli daha yaygın olarak kullanılan kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs), biz burada istihdam, yapay miRs nöronlar içinde nakavt için önemli avantajlar sunuyoruz. ShRNAs, onlar bir polimeraz II organizatörü¹kontrol altında ifade edilebilir. Böylece, tek bir organizatörü miR ve floresan bir muhabir ile birlikte bir optogenetic sonda ifadesi sürücü için kullanılabilir. Bu şekilde, yapı boyutu rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV, şekil 1A) ambalaj sınırları içinde tutulabilir. Ayrıca, miR, optogenetic sonda ve sabit bir oranda floresan muhabir ifadesi izin veren bir yayın için tek bir yapı ve tek bir organizatörü kullanımı deneysel değişkenliği azaltır.

Son zamanlarda presynaptic kalsiyum kanal Hipokampus⁵alternatif olarak spliced izoformlarının rolünü incelemek için bu teknolojiyi başvurdum. Bu tür bir strateji genellikle fizyolojik alaka ilgi herhangi bir beyin devre presynaptically ifade diğer proteinlerin eğitim için geçerlidir.

Tüm deneyler Avrupa Toplulukları Konseyi (yönergesi 2010/63/AB 4 Mart 2014) tarafından kurulan yönergelere uygun olarak yapılmıştır ve İtalyanca Sağlık Bakanlığı tarafından kabul edildi.

1. tasarım mikroRNA'lar RNA müdahale ve onların verimliliği Contegra ifade sistemlerindeki değerlendirilmesi için

Not: Bu iletişim kuralı aşağıdaki köklü yöntemleri konusunda bilgili olmanız gerekir: Moleküler klonlama, DNA sıralama, bakım hücre hatları, Kalsiyum fosfat transfection, nicel gerçek zaman PCR (qRT-PCR), hücre lysates hücre satırlarından hazırlanması ve Western Blot.

1. Faiz gen Alternatif işlenim tabi olup olmadığını belirlemek. Gen genel nakavt için sadece kurucu ekzonlar seçin; belirli bir alternatif olarak spliced izoformu nakavt için ilgili alternatif olarak spliced exon seçin.
2. Özel yazılım (örneğin https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) RNA parazitlere karşı ilgi sıralaması için yapay miRs tasarlamak için kullanın.
   Not: Mümkün kapalı-hedefleri için aynı tür içinde kontrol etmek için bir temel yerel hizalama arama aracı (patlama) kullanmak önemlidir.
3. Hedef gen için ilk üç sırada yer miRs seçin.
4. Seçili miRs üst ve alt ipliklerini bir uygun satın alın. Negatif kontrol için seçilen miRs veya bir miR tahmin deneyde kullanılan türlerin bilinen herhangi bir gen hedef değil bir şifreli sürümünü kullanın (örn. omurgalı genler, miR pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negatif içinde mevcut için).
5. Seçili miRs ilgili üst ve alt ipliklerini tavlama ve onları içine standart klonlama stratejileri kullanarak miRs (örneğin pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR) ifade için tasarlanmış bir plazmid klon.
   Not: Amaç 5' miR kanat bölge, seçili miR sıra ve üzerinden 3' UTR bir muhabir genin RNA polimeraz tip II organizatörü kontrol altında ifade edilebilir bir 3' miR kanat bölgesi oluşan miR ifade kaset oluşturmaktır.
6. DNA sıralama seçili miRs doğru ekleme doğrulamak için kullanın.
7. Bir oksijen hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO₂) HEK293 hücrelerin büyümesine DMEM kullanarak orta % 10 fetal sığır serum ile 1 mM NaPyruvate, 10 mM HEPES (pH 7.39) desteklenmiş ve 1 x penisilin/streptomisin (kalem/Strep).
8. HEK293 hücreleri ~ %70 birleşmesi olduğunda, onları her miR ifade vektörel çizimler ve 1:1 DNA'sı oranında Kalsiyum fosfat yöntem⁶kullanarak hedeflenen gen ifade bir vektör ile birlikte transfect. Aşağıdaki denetimler içerir: (i) hücreleri untransfected, (ii) hücre transfected ile birlikte her iki taşıyıcı DNA (örneğin pBluescript II SK(+)) veya (iii) miR denetim. hedeflenen gen ifade vektör ile
   Not: miRs tarafından hedeflenen dizileri kesinlikle iki tür arasındaki nükleotit düzeyinde korunmuş sürece (i) ifade hedeflenen gen miRs hangi doğru tasarlanmış, aynı türlerden olması gerekir. (ii) hücre hatları HEK293 dışında kullanılabilir. (III) elektroporasyon veya yöntemler, lipozom tabanlı gibi transfection alternatif yöntemler kullanılabilir.
9. 48 h transfection sonra hücreleri parçalayıcı, protein jel koşmak, Western blot gerçekleştirmek ve protein hedef protein tanıma bir antikor ile içerik analiz. ≥50% devirme bir verimlilik için hedefliyoruz.
   Not: Devirme verimliliği alternatif olarak yapabilirsiniz, veya buna ek olarak, (i) ELISA analiz, varsa hedef protein etkinliğini ölçme (II) tarafından değerlendirilmesi (örneğin iyon kanalları için akım yoğunluğu) veya (iii) tarafından qRT-PCR mRNA düzeyinde e¤er uygun antikor are değil elde edilebilir (iletişim kuralı adım 3).
   1. Kültür yemekleri Buza koyun ve buz gibi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) bir kez hücrelerle yıkayın.
   2. PBS, Aspire edin sonra buz gibi RIPA arabellek (proteaz ve fosfataz inhibitörleri içeren 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, % 1 ' NP40, % 0,1 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), Ø 100 mm, 0.5 mL Ø 60 mm bir fincan için bir fincan için 1 mL) ekleyin.
   3. Yapışık hücreleri hücre kazıyıcı kullanarak yemek kazımak ve yavaşça hücre süspansiyon önceden soğutulmuş microcentrifuge tüp içine aktarın.
   4. 15.000 x g 4 ° C'de 15 dakika, tüp santrifüj kapasitesi, yeni bir önceden soğutulmuş microcentrifuge tüp süpernatant aktarmak ve Pelet atmak.
   5. BCA Protein tahlil seti veya başka uygun bir yöntem (örneğin Bradford tahlil) kullanarak protein konsantrasyonu belirlemek.
      Not: Örnekleri-20 ° C veya daha sonra kullanmak için-80 ° C arasında dondurulup veya hemen işlenir.
   6. Böylece tüm örneklerini aynı protein konsantrasyonu ve aynı birime kadar tüm lysates yapmak için yeterli buz gibi lizis arabellek eklemek lysates uygun bir hacmi microcentrifuge tüpler için transfer.
      Not: 30-50 µg toplam protein proteinler çoğu için yeterli olmalıdır, ama yüklenecek uygun miktar faiz protein bereket göre tespit edilmelidir.
   7. 2 x Laemmli arabellek uygun bir miktarda ekleyin (%4 SDS, %10 2-mercaptoethanol, % 20 gliserol, %0,004 bromophenol mavi, 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8) ve 5 min için 95 ° C'de örnekleri kaynatın.
   8. Akrilamid jel ile birlikte bir molekül ağırlığı işaretçisi üzerinde örnekleri yükleyin. Jel 100 V 1-2 h için çalıştırın.
      Not: Jel yüzde faiz protein boyutuna bağlıdır.
   9. Transfer sandviç montaj ve proteinler membran 100 V 2 h için üzerine jel aktarmak. Membran nitroselüloz veya PVDF olabilir. PVDF metanol 1 dakika ile etkinleştirin ve yığın hazırlamadan önce Aktarım arabellek ile durulayın.
   10. Membran için engelleme tampon kullanarak oda sıcaklığında 1 h blok (PBST sütte % 5 (PBS + %0,1 ara-20)), daha sonra birincil antikor engelleme arabellekte seyreltilmiş ile membran gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
   11. 10 dk için membran PBST içinde üç kez yıkama ve ikincil antikor HRP Birleşik oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabelleği ile kuluçkaya.
   12. Membran 10 min için PBS içinde dört kez yıkayın sonra chemiluminescent substrat membran için geçerlidir ve kamera tabanlı bir CCD Imager kullanarak chemiluminescent sinyalleri yakalamak.
   13. Görüntü analiz yazılımı devirme etkinliğini ölçmek için kullanın.
10. Üst üste dizileri daha fazla fonksiyonel deneyleri için hedefleme iki en verimli miRs seçin.
    Not: Hedefler kapalı etkileri asla tamamen için herhangi bir miR ekarte. İki bağımsız miRs benzer bir etki varsa, ancak, bu aynı hedef kapalı köşenize nedeniyle bu son derece düşüktür.
11. Seçili miRs devirme verimliliğini tatmin edici değilse (< % 50), diğer miRs için ekran. Alternatif olarak, ifade Tandem, Yani en verimli miR(s) onları devirme verimlilik artışı⁷' neden olabilir aynı ifade kaset üzerinden birden çok kopya ifade eder.

2. rekombinant Adeno ilişkili vektörel çizimler Probes Optogenetic birlikte ifade, ve mikroRNA'lar inşaatı

Not: Bu iletişim kuralı aşağıdaki köklü yöntemleri konusunda bilgili olmanız gerekir: Moleküler klonlama, DNA sıralama ve rAAV üretim.

1. Her en verimli miR ifade kaset içine 3' UTR rekombinant rAAVs üretimini ve uyarıcı optogenetic ifade için tasarlanan yapıları, klon probları, nerede gibi pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X (şekil 1A), nöron özel synapsin organizatörü ultrafast channelrhodopsin ChETA ifade, kırmızı floresan muhabir TdTomato ve miR(s) NheI ve EcoRI siteleri⁵arasında takılı sürücüler.
   Not: rAAVs, ambalaj sınırını yaklaşık 4.7 Kb uzunluğunda ITR (ters terminal tekrar) üzerinden ITR (şekil 1A, turuncu) için olan aşan (i) değil. (ii) miR ifade kaset kodonu ile WPRE (Dağ sıçanı hepatit virüsü Posttranscriptional düzenleyici öğe; arasında eklenmesi gerekiyor Şekil 1A). (III) kolayca Yerelleştirme ve enfeksiyon (iletişim kuralı adım 4) yoğunluğunu izlenmesi için izin verir TdTomato gibi bir floresan protein eklenmesi son derece yararlıdır.
2. DNA sıralama miR kaset doğru ekleme doğrulamak için kullanın.
3. Üretmek ve titresi rAAV1/2 daha önce yayımlanmış protokolü⁸göre seçili her miR için bir rAAV1/2. Bir tipik deneme bir gen nakavt için aynı gen ve bir miR denetim karşı iki bağımsız miRs yer alacak. Amaç ≥10⁹ viral genom (vg) için bir virüs titresi / µL.
   Dikkat: rAAVs bir biyogüvenlik Seviye 1 (BSL-1) tesiste ele alınması gerekir. Lütfen kurumsal Biyogüvenlik kurulu ile ayrıntılı bilgi için kontrol edin.
   Not: Laboratuvar viral bir tesise sahip değilse veya viral titreleri tatmin edici değilse, rAAV üretim taşeron. Örneğin, https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ veya https://vcf.charite.de/en/metas/ ziyaret edin.

3. miR nakavt verimliliği endojen genler qRT-PCR tarafından değerlendirilmesi için birincil nöronal kültürlerden RNA çıkarımı

Not: (i) bu iletişim kuralı aşağıdaki köklü yöntemleri konusunda bilgili olmanız gerekir: hazırlık ve birincil nöronal kültürler ve qRT-PCR bakım. (ii) en az 3 kez tekrarlayın devirme verimliliği (Adım 3.1-3.14) miktar (biyolojik çoğaltır). (iii) tahmini qRT-PCR tarafından mRNA düzeyinde devirme verimlilik uygun olduğunda protein içeriği analizi engellemiştir ne zaman alternatif olarak kapıyı kendisi için özel antikorlar kullanılabilir⁵değildir izoformlarının spliced gibi.

1. İlgi beyin bölgesinden birincil nöronal kültürler hazırlayın. İletişim kuralı önceki yayın⁹, aşağıdaki değişiklikler ile verilen kortikal kültürler için izleyin:
   1. İyi başına 500.000 nöronların bir yoğunluk itibariyle 6 iyi tabak tabak nöronlarda. 2,5 mL/iyi eki orta ve 3.3 mL/bakım ortamının iyi kullanın.
   2. Astrocyte aşırı büyüme görülmektedir, 0.5 mL/iyi bakım orta sitozin β-D-arabinofuranoside (için 1 µM son bir konsantrasyon) 7.5 µM ile takıma 3-4 gün vitro (DIV) ekleyin.
2. Üç kuyular miR (teknik çoğaltır) başına 5'te bulaştırmak-6 DIV. kullanım hangi ≥99% nöronların etkileyecek en düşük bulaşıcı doz.
   1. Orta 2 mL her kuyudan çıkarın ve bir 50 mL Şahin tüpte toplamak.
   2. Virüs doğrudan nöronlar için eklemek, karışımı yavaşça ve tabakları da kuluçka 37 ° C'de geri yerleştirin
   3. Toplanan orta da kuluçka makinesine saklayın. Şahin tüp gaz denge sağlamak için kap gevşek.
   4. 24 saat sonra kaldırılan orta arka her kuyuda (1,9 mL/de) ekleyin.
3. , 17-18 sayı, RNA çıkarılması için sinir hücreleri parçalayıcı.
   Dikkat: Lizis reaktif ve kloroform çok zehirli. Kimyasal bir başlık altında iş ve koruyucu giysiler giymek; atık, Milli ve kurumsal yönergelere uygun bir biçimde atın.
   Not: 3.3 – 3,13, merdiven için RNAse free koşullarda iş. Eldiven giymek ve RNAse free Züccaciye Mağazaları ve tek kullanımlık plasticware kullanın. Nasıl saplı RNA genel önlemler için örneğin ek A RNeasy mikro Handbook kullanılabilir online başvurun.
   1. Pasteur gecede bir fırın 180 ° C'de Pipetler cam kuluçkaya
   2. Tabakları eğilme ve tamamen kullanmaktan her şey için bir vakum pompası Pasteur pipet bağlı bir cam orta Aspire edin.
   3. Hemen her şey için 700 µL lizis reaktif ekleyin.
   4. Çözüm eşit sallanan ve plaka dikkatle ve kısaca el sallayarak yayıldı.
   5. Çözüm yukarı ve aşağı pipette 4-5 kez veya kadar homojen bir süspansiyon elde edilir.
   6. Çözüm her kuyudan ayrı 1,5 mL Eppendorf tüp aktarın.
      Not: Cep lysates-80 ° C'de depolanan veya hemen işlenir.
4. Gerekirse, hücre lysates RT, buzunu erit ve hemen 3.5 adıma geçin.
5. Kloroform 140 µL hücre lysates her örnek için ekleyin.
   Not: Kloroform uçucu ve pipet, en kısa zamanda Eppendorf tüpleri kapatmak zor değil.
6. Eppendorf tüpleri 15 için şiddetle sallamayın s veya örnekleri tam emülsiyon kadar.
7. Örnek 1-2 dk ya da sıvı fazlar ayırmak başlayana kadar RT devam et.
8. Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
9. Yeni bir Eppendorf tüp RNA içeren üst sulu faz (~ 320 µL) aktarmak ve geri kalan sıvı atın.
   Not: alt pembe organik faz veya beyaz ring pipet ucu ile iki aşamalar arasına dokunmayın.
10. Sulu faz % 100 etanol (480 µL) 1,5 birimleri ekleyin ve yukarı ve aşağı yavaş yavaş 3 kez karıştırmak için çözüm pipette.
11. Piyasada bulunan bir kit küçük örneklerinden RNA'ın arıtma için tasarlanmış kullanarak RNA arındırmak.
12. RNA konsantrasyon ve örnek saflık bir Spektrofotometre ile ölçmek.
    Not: (i) ≥3.5 µg/iyi verim bekliyoruz; 260/280 ve 260/230 oranları saflık proteinler ve organik bileşikler üzerinde her ikisi de gerekir olmak için ≥1.9. (ii) RNA örnekleri-80 ° C'de depolanan veya hemen işlenir.
13. Piyasada bulunan bir kit ile Retrotranscribe 250, 500 ya da 1000 ng RNA'ın.
14. İlgi endojen gen devirme verimliliği qRT-PCR tarafından ölçmek. Detaylı bir iletişim kuralı için bkz: başvuru¹⁰. ≥60% (Şekil 2) bir devirme verimlilik için hedefliyoruz. ≥2 temizlik genlerle (örn. veri normalleştirme GAPDH, ACTB, TUBB3, PPIA) birden çok iç kontrol gene yöntem¹¹kullanarak.
    Not: Eğer köstebeğiyle çalışma, aşağıdaki PCR astar için temizlik gen kullanın: GAPDH-fwd: 5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3' ve GAPDH-rev: 5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'; ACTB-fwd: 5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3' ve ACTB-rev: 5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'; TUBB3-fwd: 5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3' ve TUBB3-rev: 5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'; PPIA-fwd: 5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3' ve PPIA-rev 5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'.

4. Presynaptic proteinler tarafından hedeflenen çaldı aşağı nöronlar Optogenetics ile uyarılması sağlam nöronal devreler arasında rolünün değerlendirilmesi

Not: Aşağıdaki protokol ile akut beyin dilimleri ve Elektrofizyolojik bir kurulum Elektrofizyolojik kayıtlar önceki deneyim gerektirir.

1. Stereotactically rAAV1/2 önceki yayın¹²detaylı bir protokol sonrası beyin içine enjekte et. Beyin bölgesi stereotaksik atlaslar fare¹³ ya da sıçan beyin için¹⁴kullanarak ilgi için stereotaktik koordinatları belirleyin.
   1. 7-9 µm enjeksiyon MİKROPİPETLER Ø uzun shanks ile çekmek için bir micropipette çektirmenin kullanın; enjeksiyon MİKROPİPETLER makasla shanks üzerinde küçük. Bir ince marker ve grafik kağıdına enjeksiyon MİKROPİPETLER her 2 mm kalibrasyon işaretleri eklemenizi sağlar.
   2. İsoflurane hayvanla anestezi ve stereotaktik cihaz tamir.
   3. 37 ° C'de ayarla bir Isıtma yastığı ile hayvan işlemi sıcak tutmak
   4. Oküler yağ ile gözleri koruyun.
   5. Kürk tıraş ile kafa tıraş.
   6. Povidone iyot pamuk bud kullanarak kazılı kafa üzerinde yayılmış.
   7. Diseksiyon mikroskop altında bir ensizyon olun.
   8. Çok bregma ve lambda görünür yapmak için bir pamuk bud ile kafatası yüzeyi temizleyin.
   9. Enjeksiyon micropipette onun yuvasına yerleştirin. Bu şablonu bulunduranın stereotaksik kol iliştirin.
   10. X ve y koordinatları enjeksiyon bregma ve/veya lambda göre sitenin.
   11. Kafatası hedef alan üzerinde ince bir matkap kullanmak.
       Not: yumuşak dairesel hareketler kullanın ve bu beyin yüzeyine zarar kafatasını Sondaj kaçının.
   12. Eğer orada kanıyor, havlu kağıt ile aşırı kan emer.
       Not: Aşırı kan doğru z koordinat belirlemek zor yapacaktır.
   13. ≤2 µL şunun enjeksiyon micropipette kılcal eylem tarafından yük.
   14. Enjeksiyon micropipette getirmek x ve y koordinatlarını Enjeksiyon Makinası.
   15. Beyin zarı dan z koordinat hesaplamak ve pipet yavaşça beyine indirin.
   16. Z koordinat ulaşıldığında, doku ayarı için izin vermek için 3 dakika bekleyin.
   17. Enjeksiyon micropipette arkası için esnek bir tüp üzerinden bağlanan bir 1 mL şırınga kullanarak düşük pozitif basınç uygulayın. Görsel olarak diseksiyon mikroskop ve referans noktaları ayarlı işaretlerinin kullanılması yoluyla virüs çýkartýlmasýný hız enjeksiyon micropipette üzerinden izlemek.
       Not: Virüs yavaş hızda enjekte edilebilir gerekiyor (< 100 nL/dk) doku hasarı önlemek için.
   18. Enjeksiyon sona erdiğinde, 5 dk, enjeksiyon micropipette 0.2 mm tarafından çekilen, başka bir 5 min için geri tepme virüs önlemek için bekle.
   19. Enjeksiyon micropipette yavaş yavaş ve tamamen beyin ve bunu atmayın çamaşır suyu ile dolu bir kap içine geri alıyorum.
   20. Kafatası fizyolojik solüsyonu ile ıslak ve cilt ile 3-4 dikiş dikerim.
   21. Gentamisin merhem yaraya uygulayın.
   22. Tek-ev gıda ile temiz bir kafeste hayvan yemi ve a ısı lamba bu kadar altında tam kurtarır.
2. ≥15 gün sonrası enjeksiyon, hayvanlar derin isoflurane anestezi altında başını kesmek.
3. Akut beyin dilimleri ilgi beyin bölgesinin Vibratome benzin kullanarak bir ile (% 95'i O₂, % 5 CO₂) hazırlamak (mM) içeren buz gibi aCSF çözüm: 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1.5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 NaPyruvate ve 18 glikoz (Osmolarite için 300 mOsm ayarlanabilir). CA1 piramidal nöronların ile CA3 sinaptik iletimi analiz etmek istiyorsanız, örneğin, sagittal Hipokampal oluşumu (350 µm kalınlığında) dilim hazırlayın.
   Not: Bu adımından itibaren çevre ışık tarafından optogenetic sonda aktivasyonu önlemek için düşük ışık koşulları altında çalışırlar.
4. Yeniden elde etmek için aynı aCSF beyin dilimleri tutmak için tasarlanmış bir odasında 37 ° C'de 30 dk dilimleri izin. Dilimleri aynı beyin dilim odasında kayıt kadar oda sıcaklığında tutmak.
   Not: Bu koşul kullanma, dilimleri en fazla 6-8 saat için sağlıklı korunabilir.
5. Transfer bir dilim bir batık kayıt odası ve superfuse bu 2 mL/dk 1.5 mM CaCl₂ ile desteklenmiş kurtarma için kullanılan aynı aCSF ile (Ca^{2 +}Toplam: 2.5 mM) ve NaPyruvate olmadan.
   Not: Dilimleri hazırlanan ve toksisite en aza indirmek için Ca^{2 +} (1 mM) düşük konsantrasyon saklanır. Kayıtları 2.5 mM vezikül yayın lehine Ca^{2 +} gerçekleştirilir.
6. Kısaca ifade floresan muhabir (örn. sinyal kontrol TdTomato; Şekil 3B) Yerelleştirme ve enfeksiyon yoğunluğu tespit etmek için.
7. Bir yama elektrot bir hücre içi çözüm (mM) içeren ile doldurun: 110 K-glukonat, 22 KCl, 5 NaCl, 0.5 EGTA, 3 MgCl₂, 4 Mg-ATP, 0.5 Na₃-GTP, 20 K₂-kreatin fosfat, 10 HEPES-KOH (pH 7,28, 290 mΩ).
   Not: 5-6 mΩ bir pipet direnç ile yama elektrot kullanın.
8. Kızılötesi aydınlatma altında sıkı mühür bütün hücreli bir nöron sinaptik girişleri virüslü neurons alma yapılandırmasından ulaşmak. CA3 piramidal nöronların bulaşmışsa, örneğin, piramidal nöronların proksimal medial yolu CA1 bölgesinin (şekil 3 c) için yama.
   Not: Seri direnç uncompensated bırakılabilir ama sabit ve düşük (≤20 MΩ) olmalıdır.
9. Farmakoloji sinaptik akımları soruşturma altında belirlemek için kullanın. Amaç eksitatör sinaptik iletimi araştırmak için ise, örneğin, inhibitör sinaptik iletimi ile 10 µM bicuculline engellemek.
10. Sinaptik akımları, bir enfekte nöronlar (örn. somata üzerinde konumlandırılmış fiber optik (Ø ≤250 µm) birleştiğinde 473 nm mavi lazer kullanarak örneğin, eksitatör postsinaptik akımları (EPSCs), uyandırmak CA3 piramidal nöronların).
    1. Birden fazla aksiyon potansiyeli hafif darbe başına çağrıştıran olasılığını azaltmak için en az, stimülasyon uzunluğunu ayarlayın. ChETA kullanıyorsanız, 2 ms¹⁵' e ayarlayın.
    2. Küçük ama açıkça tespit sinaptik akımları vermeye lazer stimülasyon gücünü ayarlamak (≤50 pA pik genlik EPSCs için kaydedilen-70 holding potansiyelini mV arasında CA3 ve CA1 piramidal nöronların; Şekil 3D). ChETA ve 250 µm bir optik lif çapı kullanıyorsanız, 1 – 3 mW lif, güçlü çıkmak stimülasyon uygun olmalıdır.
       Not: lazer gücü düzenlenir, nötral yoğunluk filtreleri kullanın.
    3. 473 nm lazer ışık enfekte nöronlar somata, ama onların aksonlar üzerinde parlaklık. Örneğin, CA3 somata ve akson doğrudan depolarizasyon önlemek için Schaffer de¤erler, uzak ışık.
    4. Tetradotoksin (TTX; 0.5 µM) uygulamak, sodyum kanalları, kanal onaylamak için örnek bir engelleyici aksiyon potansiyeli tahrik.
    5. Farklı kayıtları, seçici bir engelleyici sinaptik geçerli stimülasyon seçicidir onaylamak için soruşturma altında geçerlidir.
       Not: Örneğin, NBQX geçerli (10 µM) AMPA tipi Glutamat reseptör aracılı EPSCs.
    6. Aynı akut beyin dilim tekrarlayan stimülasyon (≥2 uyaranlara ≤20 Hz değerinde) yanıt olarak optik ve elektriksel olarak uyarılmış sinaptik akımlar karşılaştırın. Sinaptik kolaylaştırma veya depresyon benzer derecede böylece benzer hücresel mekanizmaları iki tür elektrodlar tarafından etkinleştirilen düşündüren bir denetim miR kullanırken elektrikli ve optik stimülasyon arasında dikkat edilmelidir.
       Not: Yukarıdaki adımları optik stimülasyon presynaptic boutons, böylece bazı mekanizmalar sinaptik iletimi atlayarak doğrudan bir depolarizasyon teşvik değil emin olmak gereklidir.
11. Tek ve tekrarlayan elektrodlar (≥2 uyaranlara ≤20 Hz değerinde) arasında bir denetim miR ve soruşturma altında presynaptic proteinler hedefleme miRs yanıt olarak sinaptik iletimi karşılaştırın.

Yukarıda açıklanan yordamlar nasıl sinaptik iletimi değerlendirmek için sağlam bir yöntem presynaptic nöronlar sinaptik proteinlerin nakavt etkiler sağlar. Nasıl alternatif nakavt splice izoformlarının presynaptic Ca_v2.1 temsilcisi sonuçlarında (P/Q-tipi) VGCCs CA3 CA1 eksitatör sinapslarda örnek olarak aşağıda verilmiştir için kısa vadeli sinaptik plastisite düzenlemektedir.

CA_v2.1 (P/S-type) kanallar vardır, merkezi sinir sistemi içinde en hızlı sinapslarda baskın presynaptic VGCCs. Alternatif Uçbirleştirme dışlayan ekzonlar 37a ve 37b bir gözenek oluşturan α₁ alt Ca_v2.1 (α_1A) birimi üreten iki ana çeşidi, Ca_v2.1 [EFa] ve Ca_v2.1 [EFb]^{16,17 ,18}. CA_v2.1 [EFa] ve Ca_v2.1 [EFb] differentially sinaptik iletimi ve sıçan Hipokampal piramidal nöronların plastisite düzenleyen olup olmadığını belirlemek için ilk izoformu özgü miRs nakavt için seçmeli olarak geliştirdiğimiz Ca_v 2.1 [EFa] veya Ca_v2.1 [EFb]⁵. Kısa boyutuna karşın (97 bp) ve yüksek benzerliği (%61.86 kimlik nükleotit düzeyinde) arasında ekzonlar 37a 37b, biz tasarım ve üç miR dizileri karşı Ca_v2.1 [EFa] fare (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) ve iki fare Ca_v2.1 [EFb] karşı (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) öngörülen yüksek devirme verimlilik ile. (MiR denetim) negatif kontrol bilinen herhangi bir omurgalı gen hedef değil bir sıra içeren pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negatif plazmid kullandık. İlk ekran Contegra kanalları karşı HEK 293 hücrelerdeki bağlı olarak, seçili miR EFa1, miR EFa3 ve miR EFb2 ve içine 3' UTR rAAVs üretimi için tasarlanmış vektör pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, onların ifade kaset klonlanmış ve nerede synapsin organizatörü ultrafast channelrhodopsin ChETA, kırmızı floresan protein TdTomato ve eklenen miR (şekil 1) ifade ediyor. Biz de miR bu miR devirme verimliliğini artırmak için EFb2 ve ifade kaset çoğaltılamaz.

Ardından, rAAV1/2 yukarıdaki dört yapıları için hazırlanan ve devirme etkinlik ve seçicilik izoformu özgü qRT-PCR kullanarak birincil fare nöronal kültürlerde sayılabilir. miR EFb mRNA yerel Ca_v2.1 [EFb] ~ 60 oranında ama bu Ca_v2.1 [EFa] (Şekil 2) azaltılmış iken miR EFa1 ve miR EFa3 mRNA yerel Ca_v%2.1 ~ 70 [EFa] ama bu Ca_v2.1 [EFb], azaltılmış.

Biz daha sonra stereotactically her biri dört rAAV1/2 P18 fareler (şekil 3A-C), Hipokampus CA3 alanına (A-P/M-L/D-V Bregma gelen) −2.6 koordinatları ile enjekte / ± 2.9 / −2.9. On beş yirmi dört gün sonrası enjeksiyon, akut Hipokampal dilimler rAAV1/2-Injected sıçanlarından emir hazırlanmış ve TdTomato floresan ifade ve rAAVs (3B rakam) lokalizasyonu onaylamak için kullanılan. Presynaptic nakavt [EFb] Ca_v2.1 [EFa] veya Ca_v2.1 CA3 adlı kısa vadeli sinaptik plastisite CA1 sinapslarda için etkilenen olup olmadığını araştırmak için biz seçmeli olarak enfekte CA3 nöronlar kısa 473 nm lazer ışık darbeleri (2 ms-uzun ile uyarılmış ; Şekil 3 c) ve piramidal nöronların proksimal medial yolu CA1 bölgesinin (şekil 3 c) için yama tarafından elde edilen EPSCs kaydedildi. Ca_v2.1 splice izoformlarının nakavt yanıt için eşleştirilmiş-nabız stimülasyon ters yönde etkilenen bulduk: nakavt [EFa] (miR EFa1 veya miR EFa3) Ca_v2.1 artırdığını eşleştirilmiş-nabız kolaylaştırma (PPF) ise Ca'nın devirme _v2.1 [EFb] (miR EFb2) o (şekil 3D, E) kaldırıldı.

Resim 1: Şeması yapıları ultrafast optogenetic sonda ChETA ve izoformu özgü miRs Ca_v2.1 [EFa] ve Ca_v2.1 [EFb] karşı kombine ifade için. (A) rAAV haritası oluşturmak pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, synapsin organizatörü (Syn) içeren, TdTomato ve içinde proksimal 3' UTR, bir Ca_v2.1 splice izoformu özgü miR ChETA ultrafast channelrhodopsin erimiş. Kısıtlama gösterilen tek kesiciler enzimlerdir. (B) en iyi, düzeni ifade kaset. Synapsin düzenleyici ChETA-TdTomato ve bir izoformu özgü miR ifade ediyor. Alt, miR kaset parçası 21-nükleotit hedef sıralarının geriye doğru tamamlayıcı. MiR EFb2 için iki özdeş miR kaset birbiri ardına bir tandem ifade edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Devirme verimliliği ve izoformu özgü miRs Ca_v2.1 [EFa] ve Ca_v2.1 [EFb] selectivity değerlendirilmesi. 17-18 DIV birincil kültürler 6 DIV ya Ca_v2.1 [EFa] (miR EFa1 ve miR EFa3) hedefleme miRs ifade rAAVs ile enfekte izole RNA izoformu özgü qRT-PCR analiz veya Ca_v2.1 [EFb] (miR EFb2). Veri negatif kontrol (miR denetim) normalleştirilmiş. miR EFa1 miR EFa3 önemli ölçüde ve seçmeli olarak azaltmak ve mRNA Ca_v2.1 [EFa] (n = 8 ve 7 kültürleri, sırasıyla), miR EFb önemli ölçüde ve seçmeli olarak azaltır [EFb] mRNA Ca_v2.1 iken (n 4 kültürler; = *** p < 0,001; tek yönlü analizi Varyans testi) Tukey Kramer sonrası test tarafından takip. Veri ± SEM demek olarak sunulan Bu rakam Thalhammer, A. ve ark. adapte edilmiş ⁵. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Rolü Ca_v2.1 [EFa] ve Ca_v2.1 [EFb] tarafından yerel Hipokampus değerlendirirken hedef çaldı aşağı nöronlar optogenetics ile uyarılması. Vivo enfeksiyonu için kullanılan rAAV yapıları ve ifade kaset (A) şeması. ((B)) Hipokampal bölümünde gösterilen TdTomato floresan CA3 bölge ve onun projeksiyonlar ile sınırlıdır. (C) deneysel yapılandırma: lazer ışını CA3 somata Yönetmen: ve yama kelepçe kayıtları CA1 piramidal nöronların gerçekleştirilen. (D) 2 ms-uzun mavi (473 nm) lazer ışık darbeleri 20 Hz parlıyordu uyandırmak kimin PPF Ca_v2.1 [EFa] hedefleme miRs tarafından arttı ve miR Ca_v2.1 [EFb] tarafından kaldırılmış EPSCs. (E) gösterilen bir artış miR denetim göreli PPF miR EFa1 ve miR EFa3 ve bir düşüş miR EFb2, için için özetini eşleştirilmiş-nabız oranı (D), olduğu gibi deneyler için (n = 9-11 kayıtları; * p 0,02; = ** p = 0,01; *** p < 0.0004; Kovaryans analizi). Veri ± SEM demek olarak sunulan Bu rakam Thalhammer, A. ve ark. adapte edilmiş ⁵. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bir optogenetic sonda ve miR ilgi presynaptic bir gen karşı ortak ifadesi gen nakavt etkisi presynaptic işlev içinde sağlam nöronal devreler karakterize etmek için güçlü bir yaklaşım sunmaktadır. Bu deneysel yaklaşım için tanımlamak ve son derece verimli ve yerel sistemler ilgi gen aşağı knocking seçici miRs karakterize önemlidir. Mümkünse, iki veya daha fazla bağımsız miRs ilgi aynı mRNA karşı kontrol etmek için nihai hedef kapalı efektleri kullanılmalıdır. Kurtarma deneyler, hangi miR dayanıklı bir gen sisteminde yeniden ortaya çıkar bir denetim olarak özgüllük için kullanılabilir.

Bir optogenetic ifade etmek için aynı yapıyı kullanarak sonda ve bir miR sağlar optik manipüle sadece presynaptic nöronlar uyarıcı için. Bu nedenle karışık ve seyreltilmiş sonuçlar üreten bulaşmış ve sigara enfekte nöronlar arasında ayrım yapmamak için bu elektrik elektrodlar ile mümkün değildir. Optik elektrodlar birden çok aksiyon potansiyelleri¹⁵neden olabilir çünkü bir genişleyen paleti^15,19,20,21arasında sadece en hızlı optogenetic sondalar seçmek önemlidir. Buna ek olarak, optik stimülasyon presynaptic boutons doğrudan bir depolarizasyon teşvik değil, sinaptik iletimi adımlardan bazıları atlayarak önlemek için bir²²araştırmak dilek sağlamak için önemlidir.

Biz burada, tarif deneysel yaklaşım paralel olarak sınırlı sürede (4-6 ay) birden çok presynaptic genler ilgi fizyolojik uygunluğunu değerlendirmek mümkün kılar. Ancak, nakavtlar nadiren % 100 ulaşmak aklınızda tutmanız önemlidir. Dahası, rAAVs maksimal devirme ve tam ifade bir süre sınırlaması ne zaman erken gelişimsel süreçleri soruşturma temsil edebilir optogenetic soruşturma için izin vermek en az iki hafta boyunca ifade edilmesi gerekir. Genellikle daha fazla zaman alıcı, koşullu nakavt fareler presynaptic nöronlar için sınırlı sonuçlanır rağmen faiz gen kaldırmayı tamamlamak ve bu nedenle geçerli tamamlayıcı bir yaklaşım sunuyoruz.

Birden fazla miRs aynı organizatörü üzerinden ifade sağlar miR teknolojinin belirli bir avantaj sağlıyor. Bu özellik, birden çok kopyasını aynı miR veya farklı miRs karşı aynı hedef gen ekleyerek devirme verimliliğini artırmak için esas olarak kullanılmıştır. Ancak olabilir karşı farklı hedef genlerin^7,23miRs ifade ederek nakavt için birden çok gen kullanılıyor. Bu özellik presynaptic sinyal yolları incelemek için birden çok presynaptic proteinler susturmak için kullanılabilir olur.

Burada, akut Hipokampal dilimler presynaptic işlevinde gen nakavt etkilerini karakterize etmek için yapay miRs ile optogenetics birleştirdik. Benzer bir yaklaşım, değiştirmek ve nöronal devreler vivo içindeyoklama için de kullanılabilir. Buna ek olarak, yapay miRs chemogenetic ile birleştirerek yaklaşımlar bir uzun zaman ölçeklerde nöronal devreler sorgulamaya sağlayacak.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz F. Benfenati (Istituto Italiano di teknoloji, IIT) destek ve Carmela Vitale için gösteri ile yardımcı olduğunuz için teşekkür ederiz. Bu eser IIT ve Compagnia San Paolo (hibe No 9734 LAC) tarafından finanse edildi.