الجمع بين أوبتوجينيتيكس ميكرورناس الاصطناعية لتوصيف "تأثيرات الجينات ضربة قاضية" في وظيفة Presynaptic داخل "الدوائر العصبية سليمة"

يوفر هذا البروتوكول سير عمل في كيفية الجمع بين تدخل الجيش الملكي النيبالي microRNA بوساطة الاصطناعية مع أوبتوجينيتيكس لحفز على وجه التحديد presynaptic boutons مع انخفاض التعبير عن gene(s) انتقائية داخل الدوائر العصبية سليمة.

والغرض من هذا البروتوكول لوصف تأثير الجينات ضربة قاضية على وظيفة presynaptic داخل الدوائر العصبية سليمة. يمكننا وصف سير عمل في كيفية الجمع بين ميكرورنا الاصطناعية (مير)-تدخل الجيش الملكي النيبالي في أوبتوجينيتيكس لتحقيق التحفيز الانتقائي من boutons بريسينابتيك التلاعب في شرائح الدماغ الحادة بوساطة. النهج التجريبي الذي ينطوي على استخدام تركيبة فيروسية واحد ومروج العصبية محددة واحدة محرك التعبير عن كلا من المسبار أوبتوجينيتيك ومصطنعة miR(s) ضد gene(s) بريسينابتيك. عند حقن ستيريوتاكتيكالي في منطقة الدماغ للفائدة، بناء أعرب يجعل من الممكن لحفز مع الضوء حصرا الخلايا العصبية مع انخفاض التعبير عن gene(s) قيد التحقيق. هذه الاستراتيجية لا يتطلب تطوير وصيانة خطوط الماوس المعدلة وراثيا ويمكن من حيث المبدأ تطبيق للكائنات الحية الأخرى وأي الجينات الخلايا العصبية للاختيار. لقد قدمنا طلبا للتحقيق كيف ينظم ضربة قاضية isoforms الوصلة البديلة لقنوات الكالسيوم الجهد عن طريق بوابة P/Q-نوع بريسينابتيك (فجككس) قصيرة الأجل اللدونة متشابك في CA3 إلى نهايات ضادات CA1 في شرائح هيبوكامبال الحادة مؤخرا. يمكن أيضا استخدامها نهجاً مماثلاً التلاعب والتحقيق في الدوائر العصبية فيفو.

ويصف هذا البروتوكول نهجاً جديداً لوصف تأثير الجينات ضربة قاضية على وظيفة presynaptic داخل الدوائر العصبية سليمة. التحقيق في الدالة بريسينابتيك في الدوائر العصبية سليمة هو التحدي نظراً لأن العديد من بتونس بريسينابتيك صغيرة جداً وبعيدا من سوما للسماح بالجمع بين التدخلات الجزيئية والكهربية. على الرغم من أن تدخل الجيش الملكي النيبالي يوفر وسيلة قوية ومرنة للبروتينات متشابك ضربة قاضية¹، هذا النهج قد استخدمت ماما للتحقيق الدالة بريسينابتيك لأنه من الصعب الكشف عن آثار ضربة قاضية باستخدام التقليدية التحفيز الكهربائية، التي لا تميز بين التلاعب والسذاجة boutons بريسينابتيك². هنا، نحن تصف كيفية الجمع بين ميكرورنا الاصطناعية (مير)-تدخل الجيش الملكي النيبالي مع التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا أوبتوجينيتيك لتحقيق التحفيز الانتقائي من boutons بريسينابتيك التلاعب في شرائح الدماغ الحادة بوساطة.

يمكن أيضا استخدام الفئران مشروطة بالضربة القاضية في تركيبة مع الكهربية للتحقيق في وظيفة البروتينات بريسينابتيك^3،4، استراتيجيتنا لا يتطلب تطوير وصيانة وراثيا تعديل خطوط الماوس، ويمكن أيضا أن تستخدم بسهولة نهدم isoforms محددة من الجينات. النسبي لأكثر شيوعاً دبوس الشعر القصير المستخدمة الكشف (شرناس)، ميرس الاصطناعية، التي نستخدمها هنا، تقدم المزايا الرئيسية لضربة قاضية في الخلايا العصبية. وخلافا شرناس، يمكن أعربوا تحت سيطرة المروج الثاني بوليميراز¹. وهكذا، يمكن استخدام مشجع واحد لمحرك التعبير عن مير وتحقيقا أوبتوجينيتيك، جنبا إلى جنب مع مراسل فلورسنت. وبهذه الطريقة، يمكن الاحتفاظ بحجم بناء المؤتلف فيروسات الغدد المرتبطة (راف، الشكل 1A) في حدود التعبئة والتغليف. أيضا، يقلل استخدام بنية واحدة ومروج واحدة تجريبية تقلب لأنه يسمح للتعبير عن مير والتحقيق أوبتوجينيتيك والمراسل الفلورسنت في نسبة ثابتة.

نحن مؤخرا تطبيق هذه التكنولوجيا دراسة دور isoforms المقسمة كبديل لقنوات الكالسيوم بريسينابتيك في الحصين⁵. هذه استراتيجية تنطبق بصورة عامة إلى دراسة أهمية الفسيولوجية للبروتينات الأخرى أعربت عن بريسينابتيكالي في أي دائرة الدماغ للفائدة.

جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها "مجلس الجماعات الأوروبية" (التوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي في 4 مارس 2014)، وقد وافقت عليها وزارة الصحة الإيطالية.

1-تصميم ميكرورناس لتدخل الجيش الملكي النيبالي، وتقييم كفاءتها في "أنظمة تعبير مغايرة"

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول معرفة الأساليب الراسخة التالية: الاستنساخ الجزيئي، وتسلسل الحمض النووي، وصيانة خطوط الخلايا، تعداء فوسفات الكالسيوم، الحقيقي كمية الوقت بكر (قرة-PCR)، إعداد ليساتيس الخلية من خطوط الخلايا والنشاف الغربية.

1. تحديد ما إذا كانت الجينات التي تهم رهنا بالربط بديلة. بالنسبة لضربة قاضية عامة من الجينات، حدد حصرا exons التأسيسي؛ بالنسبة لضربة قاضية isoform بدلاً من ذلك المقسمة محددة، حدد إكسون بدلاً من ذلك المقسمة ذات الصلة.
2. استخدام برنامج مخصص (مثل https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) لتصميم ميرس مصطنعة لتدخل الجيش الملكي النيبالي ضد تسلسل الفائدة.
   ملاحظة: من المهم استخدام الأساسية المحلية المحاذاة البحث أداة (الانفجار) للتحقق من إمكانية إيقاف أهدافا داخل نفس الأنواع.
3. حدد ميرس المرتبة الثلاثة العليا للجينات المستهدفة.
4. ترتيب خيوط العلوي والسفلي من ميرس مختارة من شركة مناسبة. للمراقبة السلبية، استخدام إصدار سارعت أحد ميرس المحدد أو مير وتوقع لا يستهدف أي الجينات المعروفة من الأنواع المستخدمة في التجربة (على سبيل المثال-للفقاريات الجينات، مير الموجودة في pcDNA6.2-غيغاواط/امجفب-مير-الراتب).
5. يصلب خيوط أعلى وأسفل كل منها من ميرس المحدد ونسخة منها إلى بلازميد مصممة للتعبير عن ميرس (مثلاً pcDNA6.2 غيغاواط/امجفب-مير) باستخدام استراتيجيات الاستنساخ القياسية.
   ملاحظة: الهدف هو إنشاء كاسيت تعبير مير تتكون من 5 'مير منطقة ترافقه والتسلسل المحدد مير 3' مير ترافقه منطقة التي يمكن التعبير عنها من 3 ' UTR الجينات مراسل تحت سيطرة المروج الثاني نوع الحمض النووي الريبي بوليميراز.
6. استخدام تسلسل الحمض النووي للتحقق من صحة إدراج ميرس المحدد الصحيح.
7. تنمو خلايا HEK293 في حاضنة ثقافة خلية هوميديفيد (37 درجة مئوية، 5% CO₂) استخدام دميم وتستكمل المتوسطة مع 10% مصل بقرى الجنين، 1 مم نابيروفاتي مم 10 حبيس (الرقم الهيدروجيني 7، 39) و 1 x البنسلين/ستربتوميسين (القلم/بكتيريا).
8. عندما تكون الخلايا HEK293 روافد ~ 70%، شارك ترانسفيكت لهم مع كل من ناقلات التعبير مير وناقل التعبير عن الجينات المستهدفة في نسبة الحمض النووي 1:1 باستخدام أسلوب فوسفات الكالسيوم⁶. تتضمن عناصر التحكم التالية: () أونترانسفيكتيد الخلايا، (ثانيا) خلايا transfected مع ناقل التعبير عن الجينات المستهدفة جنبا إلى جنب مع الناقل أما الحمض النووي (مثل ببلويسكريبت SK(+)) الثاني أو (ثالثا) مير التحكم.
   ملاحظة: يجب أن تكون الجينات المستهدفة (ط) أعرب من نفس الأنواع التي تم تصميمها في ميرس، إلا إذا كان تسلسل التي تستهدفها في ميرس هي المحافظة على الإطلاق على مستوى النوكليوتيدات بين هذين النوعين. (ثانيا) يمكن استخدام خطوط خلية خلاف HEK293. (ثالثا) يمكن استخدام أساليب تعداء، مثل انهانسر أو الأساليب المستندة إلى الحويصلية، البديلة.
9. ح 48 بعد تعداء، الخلايا وتشغيل جل البروتين، وأداء لطخة غربية وتحليل البروتين المحتوى مع جسم الاعتراف بالبروتين المستهدف. هدف لضربة قاضية من كفاءة إيه فايف زيرو في المائة.
   ملاحظة: كفاءة ضربة قاضية يمكن بدلاً من ذلك، أو بالإضافة إلى ذلك، يمكن تقييمها (ط) بتحليل إليزا، (الثاني) بقياس نشاط البروتين المستهدف إذا كان ذلك ممكناً (مثل الكثافة الحالية للقنوات الأيونية) أو (الثالث) عن طريق قرة-بكر على مستوى مرناً إذا مناسبة لا تتوفر الأجسام المضادة (الخطوة 3 من البروتوكول).
   1. ضع الأطباق الثقافة على الجليد وغسل الخلايا مرة واحدة مع المياه المالحة المثلج مخزنة الفوسفات (PBS).
   2. نضح برنامج تلفزيوني، ثم قم بإضافة المخزن المؤقت ريبا المثلج (50 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، يدتا، 1% NP40، 2 مم 0.1% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، التي تحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز؛ 1 مل لطبق من Ø 100 مم، 0.5 مل لطبق من Ø 60 مم).
   3. كشط الخلايا ملتصقة قبالة الطبق باستخدام مكشطة خلية ولطف نقل تعليق خلية في أنبوب ميكروسينتريفوجي قبل يبرد.
   4. الطرد المركزي الأنبوب في 15,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، ونقل المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي قبل تبريد جديدة وتجاهل بيليه.
   5. تحديد تركيز البروتين باستخدام طقم "مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي" أو طريقة مناسبة أخرى (مثل المقايسة برادفورد).
      ملاحظة: عينات يمكن أما مجمدة عند-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق، أو تتم معالجتها فورا.
   6. نقل وحدة تخزين مناسبة من ليساتيس إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي حيث أن جميع العينات بتركيز البروتين نفسه وإضافة المخزن المؤقت تحلل المثلج كافية لتعويض جميع ليساتيس على نفس وحدة التخزين.
      ملاحظة: 30 إلى 50 ميكروغرام من البروتين الكلي ينبغي أن يكون كافياً بالنسبة للبروتينات، ولكن ينبغي أن يتحدد الكمية المناسبة يتم تحميلها وفقا وفرة بروتين الفائدة.
   7. إضافة مبلغ مناسب من المخزن المؤقت x Laemmli 2 (الحزب الديمقراطي الصربي 4%، 10% 2-mercaptoethanol، الجلسرين 20%، 0.004% بروموفينول الأزرق، 0.125 M تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 6.8) وتغلي في العينات من 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   8. تحميل عينات على هلام اكريلاميد جنبا إلى جنب مع علامة وزن الجزيئي. تشغيل الهلام في 100 الخامس ح 1-2.
      ملاحظة: النسبة المئوية جل يعتمد على حجم بروتين الفائدة.
   9. تجميع ساندويتش نقل ونقل البروتينات من الجل على غشاء في 100 الخامس ح 2. يمكن أن يكون الغشاء النيتروسليلوز أو PVDF. تنشيط PVDF مع الميثانول لمدة 1 دقيقة وشطف مع نقل المخزن المؤقت قبل إعداد المكدس.
   10. كتلة الغشاء ح 1 في درجة حرارة الغرفة باستخدام المخزن المؤقت حظر (الحليب 5% في ببست (برنامج تلفزيوني + 0.1% توين-20))، ثم احتضان الغشاء بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع جسم الابتدائي المخفف في المخزن المؤقت لحظر.
   11. يغسل الغشاء لمدة 10 دقائق في ببست ثلاث مرات واحتضان أنه مع جسم الثانوي مترافق HRP في المخزن المؤقت حظر لح 1 في درجة حرارة الغرفة.
   12. يغسل الغشاء لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني أربع مرات، ثم تطبيق الركيزة تشيميلومينيسسينت للغشاء والتقاط الإشارات تشيميلومينيسسينت استخدام تصوير الكاميرا على أساس اتفاقية مكافحة التصحر.
   13. استخدام برمجيات تحليل الصورة لقياس كفاءة ضربة قاضية.
10. حدد ميرس أكفأ هما استهداف تسلسلات غير متداخلة لفحوصات فنية أخرى.
    ملاحظة: الآثار قبالة أهداف يمكن ابدأ أن يكون تماما استبعد أي مير. ومع ذلك، إذا كان قد ميرس المستقلة اثنين تأثير مماثل، من المرجح أن هذا يرجع ضربة قاضية خارج الهدف نفسه.
11. إذا كانت كفاءة ضربة قاضية ميرس المحدد ليس مرضيا (< 50%)، شاشة لأخرى ميرس. وبدلاً من ذلك، نعرب عن miR(s) الأكثر كفاءة بالترادف، أي التعبير عنها بنسخ متعددة من نفس الكاسيت التعبير، مما قد يتسبب في زيادة كفاءة ضربة قاضية⁷.

2-بناء ناقلات المرتبطة "الغدة المؤتلف" "الجمع بين التعبير من أوبتوجينيتيك تحقيقات" وميكرورناس

ملاحظة: يتطلب هذا البروتوكول معرفة الأساليب الراسخة التالية: الاستنساخ الجزيئي وتسلسل الحمض النووي وإنتاج راف.

1. استنساخ كل من الأشرطة مير الأكثر كفاءة على التعبير إلى 3 ' UTR من بنيات مصممة لإنتاج رافس المؤتلف، والتعبير عن أوبتوجينيتيك ضادات يسبر، مثلما حدث في بافسينتشيتاتدتميركس (الشكل 1A)، حيث محركات مروج سينابسين العصبية على حدة التعبير عن تشانيلرهودوبسين فائق السرعة ChETA، مراسل الفلورسنت الأحمر تدتوماتو، و miR(s) إدراجها بين مواقع ني واكوري⁵.
   (ط) يتجاوز ملاحظة: لا حد رافس، التعبئة والتغليف وهو حوالي 4.7 كيلو بايت في طول من ساحة التجارب الموحدة (تكرار طرفية المقلوب) إلى ساحة (الشكل 1A، البرتقالي). (ثانيا) كاسيت التعبير مير يحتاج إلى تدرج بين كودون التوقف ووبر (وودكوك الالتهاب الكبدي فيروس بوسترانسكريبشونال التنظيمية العنصر؛ الشكل 1A). (ثالثا) إدراج بروتين فلوري، مثل تدتوماتو، مفيد للغاية حيث أنه يسمح لسهولة رصد التعريب وكثافة العدوى (الخطوة 4 من البروتوكول).
2. استخدام تسلسل الحمض النووي للتحقق من صحة الإدخال الصحيح من أشرطة الكاسيت مير.
3. إنتاج وعيار rAAV1/2 وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا⁸، rAAV1/2 واحد لكل مير المحدد. وتشمل تجربة نموذجية واحدة لضربة قاضية من أحد الجينات ميرس المستقلة اثنين ضد نفس الجين ومراقبة مير واحد. تهدف لعيار فيروس إيه وان زيرو⁹ الجينوم الفيروسي (vg)/ميليلتر.
   تنبيه: رافس تحتاج إلى معالجة في مرفق للسلامة الأحيائية المستوى 1 (BSL-1). الرجاء التحقق مع مؤسسي لجنة السلامة البيولوجية للحصول على معلومات مفصلة.
   ملاحظة: إذا لم يكن لدى المختبر منشأة فيروسي أو إذا كان التتر الفيروسية ليست مرضية، راف الإنتاج يمكن الاستعانة بمصادر خارجية. على سبيل المثال، قم بزيارة https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/أو https://vcf.charite.de/en/metas/.

3-استخراج الحمض النووي الريبي من "الثقافات الخلايا العصبية الأولية" لتقييم مير "الكفاءة ضربة قاضية للجينات الذاتية" ببكر قرة

ملاحظة: (ط) هذا البروتوكول يتطلب معرفة الأساليب الراسخة التالية: إعداد وصيانة ثقافات الخلايا العصبية الأولية وبكر قرة. (ثانيا) كرر التحديد الكمي لكفاءة ضربة قاضية (الخطوات 3.1 – 3.14) 3 مرات على الأقل (replicates البيولوجية). (ثالثا) تقدير الكفاءة ضربة قاضية على مستوى مرناً qRT-PCR مناسبة عندما تنتفي تحليلاً لمحتوى البروتين، مثل عندما هدمت بدلاً من ذلك تقسم isoforms التي أجسام مضادة محددة لا تتوفر⁵.

1. إعداد الثقافات الخلايا العصبية الأولية من منطقة الدماغ للفائدة. يتبع البروتوكول للثقافات القشرية في السابق نشر⁹، مع إجراء التعديلات التالية:
   1. صفيحة من الخلايا العصبية في 6 لوحات جيدا في كثافة الخلايا العصبية 500,000 كل بئر. استخدام 2.5 مل/البئر متوسطة مرفق ومل 3.3/جيد للصيانة المتوسطة.
   2. إذا لوحظ فرط astrocyte، إضافة 0.5 مل/جيد للصيانة المتوسطة وتستكمل مع 7.5 ميكرومتر من السيتوزين β-د-أرابينوفورانوسيدي (لتركيز نهائي من 1 ميكرومتر) في 3-4 أيام في المختبر (DIV).
2. إصابة ثلاثة آبار كل مير (replicates التقنية) في 5-6 DIV. استخدام أقل جرعة المعدية التي سوف تصيب % إيه ناين ناين من الخلايا العصبية.
   1. إزالة 2 مل متوسطة من كل بئر وأنه جمع في أنبوب فالكون 50 مل.
   2. إضافة الفيروس مباشرة إلى الخلايا العصبية وتخلط برفق ووضع اللوحات في الحضانة عند 37 درجة مئوية.
   3. تخزين المتوسطة التي تم جمعها في الحاضنة. تفقد عملية النداء الموحد للأنبوب فالكون للسماح للموازنة الغاز.
   4. بعد 24 ساعة، إضافة إزالة الخلف متوسطة في كل بئر (1.9 مل/جيد).
3. في 17–DIV 18، الخلايا العصبية لاستخراج الحمض النووي الريبي.
   تنبيه: الكاشف تحلل وكلوروفورم شديدة السمية. تعمل تحت غطاء كيميائية وارتداء ألبسة واقية؛ التخلص من النفايات طبقاً للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية الخاصة بك.
   ملاحظة: للخطوات 3.3-3.13، تعمل في ظروف خالية من رناسي. ارتداء القفازات واستخدام الأواني خالية من رناسي وبلاستيكواري المتاح. لاحتياطات عامة حول كيفية التعامل مع الحمض النووي الريبي، راجع على سبيل المثال التذييل ألف "الكتيب الصغير رنيسي" المتاحة على الإنترنت.
   1. احتضان الزجاج الماصات باستور بين عشية وضحاها في فرن على 180 درجة مئوية.
   2. إمالة، اللوحات ونضح المتوسطة تماما من كل أيضا استخدام زجاج ماصة باستور متصلاً بمضخة فراغ.
   3. فور إضافة 700 ميليلتر من "تحلل كاشف" لكل بئر.
   4. نشر الحل بالتساوي بالهز وهز اللوحة بدقة وإيجاز باليد.
   5. "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً 4 – 5 مرات أو حتى يتم الحصول على تعليق متجانسة.
   6. نقل الحل من كل بئر في منفصلة 1.5 مل أنابيب ايبندورف.
      ملاحظة: يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية ليساتيس خلية أو معالجتها فورا.
4. إذا لزم الأمر، تذويب الخلايا ليساتيس في RT، والشروع فورا في الخطوة 3، 5.
5. إضافة ميليلتر 140 من كلوروفورم لكل عينة من خلايا ليساتيس.
   ملاحظة: كلوروفورم متقلبة وصعبة "الماصة؛"، وإغلاق أنابيب ايبندورف في أقرب وقت ممكن.
6. اهتز أنابيب ايبندورف قوة 15 s أو حتى العينات هي مستحلب تماما.
7. الحفاظ على العينة في RT 1-2 دقيقة أو حتى تبدأ مراحل السائل لفصل.
8. الطرد المركزي هذه العينات في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
9. نقل المرحلة المائية العليا (~ 320 ميليلتر) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي لأنبوب ايبندورف جديدة، وتجاهل السائل المتبقية.
   ملاحظة: لا تلمس المرحلة العضوية الوردي أقل أو الخاتم الأبيض بين المرحلتين بطرف الماصة.
10. إضافة مجلدات 1.5 من 100% إيثانول (480 ميليلتر) إلى مرحلة مائي، و "الماصة؛" الحل ببطء صعودا وهبوطاً 3 مرات لخلط.
11. تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً مصممة لتنقية الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة.
12. تحديد مقدار نقاء تركيز وعينه الحمض النووي الريبي مع جهاز المطياف الضوئي.
    ملاحظة: (ط) توقع غلة ≥3.5 ميكروغرام/جيدا؛ 260/280 و 260/230 نسب لنقاء أكثر من البروتينات والمركبات العضوية ينبغي على حد سواء أن يكون ≥1.9. (ثانيا عينات الحمض النووي الريبي) يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية أو معالجتها فورا.
13. ريتروترانسكريبي 250 أو 500 أو 1000 نانوغرام من الجيش النيبالي الملكي مع مجموعة متاحة تجارياً.
14. قياس كفاءة ضربة قاضية للجينات الذاتية للفائدة قبل qRT-PCR. لبروتوكول مفصلة، راجع مرجع¹⁰. هدف لضربة قاضية كفاءة إيه سيكس زيرو % (الشكل 2). تطبيع البيانات إلى إيه تو التدبير المنزلي الجينات (على سبيل المثال. جابده، أكتب، TUBB3، بيا) استخدام الأسلوب من الجينات الرقابة الداخلية متعددة¹¹.
    ملاحظة: إذا كان العامل في الفئران، استخدام كبسولة تفجير PCR التالية للجينات التدبير المنزلي: إعادة توجيه جابده: 5 '3' جتجكتجاجتاتجتكجتجا والقس جابده: جاتجاتجاكككتتتجك 5 '3'؛ أكتب--إعادة توجيه: 5 '3' كاتكاكتاتكجكاتجاجك والقس أكتب: تكاتجاتجككاكاجات 5 '3'؛ TUBB3--إعادة توجيه: 5 '3' جككتتجاكاككتاتكاج والقس TUBB3: تكاكاتكتتككتكاكجاك 5 '3'؛ بيا--إعادة توجيه: 5 '3' كاكتجججاجااجاتتج والقس بيا ككاتاتجكجتجتجاجتك 3 '5'.

4-تقييم دور البروتينات بريسينابتيك في الدوائر العصبية سليمة التي تستهدف حفز طرقت لأسفل الخلايا العصبية مع أوبتوجينيتيكس

ملاحظة: يتطلب البروتوكول التالي التجربة السابقة مع التسجيلات الكهربية في الدماغ الحادة شرائح والوصول إلى إعداد الكهربية.

1. حقن ستيريوتاكتيكالي rAAV1/2 في الدماغ بعد بروتوكول مفصل في المنشور السابق¹². تحديد إحداثيات المناظير باستخدام الأشعة لمنطقة الدماغ لمصلحة استخدام اﻷطالس المناظير باستخدام الأشعة للماوس¹³ أو الفئران الدماغ¹⁴.
   1. استخدام ساحبة ميكروبيبيتي لسحب ميكروبيبيتيس حقن مع شانكس طويلة من Ø 7 – 9 ميكرومتر؛ مقطع ميكروبيبيتيس الحقن على شانكس مع المقص. استخدام علامة رقيقة وورق الرسم البياني لوضع علامات المعايرة على حقن ميكروبيبيتيس كل 2 مم.
   2. تخدير الحيوان مع إيسوفلوراني وإصلاحها في جهاز المناظير باستخدام الأشعة.
   3. الحفاظ على الحيوان الدافئة طوال العملية مع لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية.
   4. حماية العينين مع زيوت التشحيم العين.
   5. يحلق الفراء على الرأس حلاقة الكهربائية.
   6. انتشار اليود البوفيدون على رأسه حلق استخدام برعم القطن.
   7. تحت مجهر تشريح، جعل شق خط الوسط.
   8. تنظيف سطح الجمجمة مع برعم القطن، حتى لجعل بريجما وامدا مرئية.
   9. ضع ميكروبيبيتي الحقن إلى صاحبها. إرفاق الحامل ذراع المناظير باستخدام الأشعة.
   10. تحديد x و y إحداثيات الموقع للحقن بالنسبة بريجما و/أو لامدا.
   11. استخدم مناورة رقيقة الجمجمة فوق المنطقة المستهدفة.
       ملاحظة: استخدام حركات دائرية رقيقة، وتجنب الحفر من خلال الجمجمة وهذا سوف تلحق الضرر سطح الدماغ.
   12. إذا كان هناك نزيف، استيعاب الدم المفرط مع ورقة منشفة.
       ملاحظة: الدم المفرط وسوف تجعل من الصعب تحديد إحداثي z بشكل صحيح.
   13. تحميل دي تو ميليلتر للفيروس في ميكروبيبيتي حقن بعمل شعري.
   14. جلب ميكروبيبيتي الحقن إلى x و y إحداثيات الموقع للحقن.
   15. حساب إحداثي z من دوراً، وأقل الماصة ببطء في الدماغ.
   16. عندما يتم التوصل إلى تنسيق z، انتظر 3 دقائق إتاحة الفرصة لتعديل الأنسجة.
   17. تطبيق الضغط الإيجابي منخفضة باستخدام حقنه 1 مل متصلة عبر أنبوب مرن إلى الجزء الخلفي ميكروبيبيتي الحقن. رصد سرعة خروج الفيروس من ميكروبيبيتي حقن بصريا من خلال مجهر تشريح ومعايرة استخدام علامات كنقاط مرجعية.
       ملاحظة: الفيروس يحتاج إلى حقن بمعدل بطيء (< nL 100/دقيقة) لتجنب تلف الأنسجة.
   18. عند الانتهاء من الحقن، انتظر 5 دقائق، سحب ميكروبيبيتي حقن من 0.2 مم، الانتظار لمدة 5 دقائق أخرى، لتجنب الدفق الفيروس.
   19. سحب ميكروبيبيتي الحقن ببطء وتماماً من الدماغ والتخلص منه في حاوية مليئة بالتبييض.
   20. الرطب في الجمجمة مع الحل الفسيولوجية وخياطة الجلد بغرز 3-4.
   21. تطبيق مرهم الجنتاميسين للجرح.
   22. واحد دار الحيوان في قفص نظيف مع الأغذية الكريات وتحت مصباح حرارة حتى يتعافى تماما.
2. إيه وان فايف أيام بعد الحقن، قطع رأس الحيوانات تحت التخدير إيسوفلوراني العميق.
3. إعداد شرائح الدماغ الحادة لمنطقة الدماغ للفائدة مع فيبرتوم استخدام الغاز (95% O₂، 5% CO₂) الحل قام المثلج، التي تحتوي (مم): 123 كلوريد الصوديوم، 1.25 بوكل، 1.25 خ₂ص₄، 1.5 مجكل₂، 1 كاكل₂، 25 ناكو₃ونابيروفاتي 2 و 18 الجلوكوز (الاسموليه المعدلة لموسم 300). على سبيل المثال، إذا كان الهدف تحليل انتقال متشابك من CA3 إلى CA1 الخلايا العصبية الهرمية، إعداد شرائح السهمي لتشكيل هيبوكامبال (350 ميكرون سميكة).
   ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا العمل في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة لتجنب التنشيط المسبار أوبتوجينيتيك ضوء البيئية.
4. واسمحوا شرائح استرداد لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في قام نفس في غرفة مصممة لعقد شرائح المخ. تبقى الشرائح في قاعة شريحة الدماغ نفسه في درجة حرارة الغرفة حتى التسجيل.
   ملاحظة: باستخدام هذه الشروط، شرائح يمكن الحفاظ على صحية لما يصل إلى 6 – 8 س.
5. نقل أحد شريحة إلى دائرة تسجيل المغمورة وسوبيرفوسي مع 2 مل/دقيقة قام نفس المستخدمة للانتعاش وتستكمل مع 1.5 مم كاكل₂ (مجموع Ca^{2 +}: 2.5 ملم) ودون نابيروفاتي.
   ملاحظة: تعد شرائح والاحتفاظ بتركيز منخفض من Ca^{2 +} (1 ملم) لتقليل السمية. تتم التسجيلات في 2.5 ملم Ca^{2 +} لصالح إطلاق سراح حويصلة.
6. الاختيار بإيجاز الإشارة الواردة من المراسل نيون المعرب عنها (على سبيل المثال. تدتوماتو؛ الشكل 3) للتأكد من أن التعريب وشدة الإصابة.
7. ملء قطب تصحيح مع الحل داخل الخلايا التي تحتوي (مم): 110 كغلوكونات، 22 3 مجكل₂, 4 مغ-ATP, 0.5 غ، 0.5 عطا بوكل، كلوريد الصوديوم 5₃-أنشئ، 20 ك₂-فوسفات الكرياتين، حبيس 10-كوه (pH 7.28، 290 mΩ).
   ملاحظة: استخدام التصحيح قطب كهربائي مع مقاومة ماصة من mΩ 5 – 6.
8. تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء، التوصل إلى تكوين ختم ضيق كامل الخلية من الخلايا العصبية تلقي مدخلات متشابك من الخلايا العصبية المصابة. على سبيل المثال، إذا كانت إصابة الخلايا العصبية الهرمية CA3، تصحيح الخلايا العصبية الهرمية في الدانية إلى المسالك الآنسي المنطقة CA1 (الشكل 3).
   ملاحظة: سلسلة المقاومة يمكن أن تترك دون تعويض، ولكن ينبغي أن يكون ثابت ومنخفض (دي تو زيرو MΩ).
9. استخدام الأدوية لعزل التيارات متشابك قيد التحقيق. على سبيل المثال، إذا كان الهدف هو التحقيق ضادات انتقال متشابك، كتلة المثبطة انتقال متشابك مع 10 ميكرون بيكوكوليني.
10. استحضار متشابك التيارات، على سبيل المثال، ضادات بوستسينابتيك التيارات (ابسكس)، باستخدام ليزر نانومتر أزرق 473 بالإضافة إلى ألياف الضوئية (Ø دي تو فايف زيرو ميكرومتر) المتمركزة في سوماتى من الخلايا العصبية المصابة (على سبيل المثال. CA3 العصبية الهرمية).
    1. ضبط طول التحفيز إلى الحد أدنى، الحد من إمكانية تستحضر إمكانيات العمل أكثر من كل نبض الخفيفة. في حالة استخدام ChETA، تعيين إلى 2 مللي ثانية¹⁵.
    2. ضبط قوة التحفيز من الليزر تسفر عن التيارات متشابك صغيرة ولكن واضحة قابلة للاكتشاف (دي فايف زيرو السلطة الفلسطينية السعة القصوى ابسكس المسجلة في إمكانية عقد من-70 mV بين الخلايا العصبية الهرمية CA3 و CA1؛ 3D الشكل). في حالة استخدام ChETA وألياف الضوئية من 250 ميكرومتر في القطر، ينبغي أن تكون مناسبة تحفيز الخروج من نقاط القوة من 1 – 3 ميغاواط في الألياف.
       ملاحظة: إذا كان لا يمكن أن تنظم قوة الليزر، استخدام مرشحات الكثافة محايدة.
    3. تألق ضوء الليزر نانومتر 473 على سوماتى من الخلايا العصبية المصابة، ولكن ليس على محاور عصبية بهم. على سبيل المثال، تألق الضوء على سوماتى CA3، وبعيدا عن الضمانات شافر، لتجنب depolarization مباشرة من محاور عصبية.
    4. تطبيق تيدرودوتاكسين (ت؛ 0.5 ميكرومتر)، مانع لقنوات الصوديوم، إلى عينة لتأكيد القنوات يحركها إمكانات العمل.
    5. في تسجيلات مختلفة، تطبيق حظر الإطارات انتقائية الحالية متشابك قيد التحقيق للتأكد من التنشيط انتقائية.
       ملاحظة: تطبيق على سبيل المثال، نبقكس (10 ميكرون) لنوع امبا غلوتامات مستقبلات بوساطة ابسكس.
    6. مقارنة التيارات متشابك مقولة بصريا وكهربائيا في شريحة الدماغ الحادة نفسها استجابة للتحفيز المتكررة (المحفزات إيه تو في دي تو زيرو هرتز). ينبغي أن يراعي قدرا مماثلاً من تيسير متشابك أو الاكتئاب بين التحفيز الكهربائية والبصرية عند استخدام مير السيطرة، مما يشير إلى أن يتم تنشيط آليات مماثلة للهاتف الخلوي بالنوعين من التحفيز.
       ملاحظة: الخطوات المذكورة أعلاه ضرورية لضمان أن التحفيز البصري الحث على عدم ديبولاريزيشن مباشرة من boutons presynaptic، وبالتالي تجاوز بعض آليات انتقال متشابك.
11. المقارنة بين انتقال متشابك في الاستجابة للتحفيز واحدة ومتكررة (المحفزات إيه تو في دي تو زيرو هرتز) بين مير تحكم وميرس استهداف البروتينات presynaptic قيد التحقيق.

الإجراءات المذكورة أعلاه توفر وسيلة قوية لتقييم انتقال متشابك كيف يتأثر بضربه قاضية للبروتينات متشابك في الخلايا العصبية بريسينابتيك. النتائج ممثلة في كيفية لصق ضربة قاضية لبديل isoforms presynaptic Ca_v2.1 فجككس (نوع-P/Q) ينظم قصيرة الأجل اللدونة متشابك في CA3 إلى CA1 ضادات نقاط الاشتباك العصبي وترد أدناه كمثال.

Ca_v2.1 (نوع-P/Q) هي القنوات فجككس بريسينابتيك الغالبة في نهايات أكثر سرعة في الجهاز العصبي المركزي. البديلة الربط من exons التبادلية و 37a و 37b فرعية₁ α تشكيل المسام Ca_v2.1 (α_1A) تنتج الخيارين الرئيسية وكاليفورنيا_v2.1 [الجميع] وكاليفورنيا_v2.1 [EFb]^{16،17 ،18}. لتحديد ما إذا كان Ca_v2.1 [الجميع] وكاليفورنيا_v2.1 [EFb] خلطات تنظيم انتقال متشابك واللدونه في الخلايا العصبية الهرمية هيبوكامبال الفئران، أولاً وضعنا ميرس isoform محددة لضربة قاضية بشكل انتقائي Ca_الخامس 2.1 [الجميع] أو Ca_v2.1 [EFb]⁵. وعلى الرغم من الحجم القصير (97 bp) والتشابه عالية (هوية 61.86% على مستوى النوكليوتيدات) بين exons 37a و 37b، يمكن أن نقوم بتصميم ثلاث متواليات مير ضد الفئران Ca_v2.1 [الجميع] (مير EFa1: تككتاتاجتجاتجكجككج؛ مير EFa2: أتجتككتاتاجتجاتجكج؛ مير EFa3: تجكاجكاكككتاتجاجا) واثنان ضد الفئران Ca_v2.1 [EFb] (مير EFb1: أتاكاتجتككججتاجكات؛ مير EFb2: أتكتجاتاكاتجتككججتا) مع توقع ارتفاع كفاءة ضربة قاضية. كمراقبة سلبية (مير التحكم)، استخدمنا بلازميد pcDNA6.2-غيغاواط/امجفب-مير-الراتب الذي يحتوي على تسلسل التي لا تستهدف أي الجينات الفقاريات المعروفة. استناداً إلى شاشة أولى في الخلايا HEK 293 ضد القنوات مغايرة، تحديد مير EFa1 ومير EFa3 مير EFb2 والمستنسخة على شرائط التعبير إلى 3 ' UTR ناقل بافسينتشيتاتدتميركس، الذي صمم لإنتاج رافس، وحيث محركات مروج سينابسين التعبير تشانيلرهودوبسين فائق السرعة ChETA والبروتين الأحمر نيون تدتوماتو مير المدرج (الشكل 1). ونحن أيضا تكرار كاسيت التعبير من مير EFb2 لزيادة كفاءة ضربة قاضية لهذا مير.

المقبل، على استعداد rAAV1/2 على بنيات الأربعة المذكورة أعلاه، وكمياً كفاءتها ضربة قاضية والانتقائية في الثقافات الخلايا العصبية الأولية الفئران استخدام محددة isoform qRT-بكر. مير EFa1 مير EFa3 تخفيض ومرناً الأصلي Ca_v2.1 [الجميع] ~ 70% ولكن ليس هذا المرجع المصدق_v2.1 [EFb]، في حين خفضت مير EFb مرناً الأصلي Ca_v2.1 [EFb] ~ 60% ولكن ليس هذا المرجع المصدق_v2.1 [الجميع] (الشكل 2).

نحن ثم ستيريوتاكتيكالي حقن كل من أربعة rAAV1/2 في منطقة CA3 الحصين الفئران p18 وبطاقات مجانية (الشكل 3 ألف-ج)، مع الإحداثيات (أ-ف/M-L/د-V، من بريجما) −2.6/± 2.9/−2.9. حقن بعد خمسة عشر إلى أربعة وعشرين يوما، إعداد شرائح هيبوكامبال الحاد من rAAV1/2-حقن الفئران وتستخدم تدتوماتو الأسفار تأكيد التعبير وإضفاء الطابع المحلي على رافس (الشكل 3B). للتحقيق في ما إذا كانت ضربة قاضية presynaptic Ca_v2.1 [الجميع] أو Ca_v2.1 [EFb] أثرت قصيرة الأجل اللدونة متشابك في CA3 إلى نهايات CA1، نحن تحفز الخلايا العصبية CA3 المصابة بشكل انتقائي مع 473 نانومتر الليزر الخفيفة نبضات قصيرة (2 مللي طوله ; الشكل 3)، وسجلت ابسكس الناتجة من الترقيع الخلايا العصبية الهرمية في الدانية إلى المسالك الآنسي المنطقة CA1 (الشكل 3). وجدنا أن ضربة قاضية لكاليفورنيا_v2.1 الوصلة isoforms تتأثر الاستجابات لتحفيز نبض إقران في اتجاهين معاكسين: ضربة قاضية لكاليفورنيا_v2.1 [الجميع] (مير EFa1 أو مير EFa3) عزز نبض إقران التيسير (PPF) حين ضربة قاضية للمرجع المصدق _v2.1 [EFb] (مير EFb2) بإلغائها (3D الشكل، هاء).

الشكل 1: مخطط بنيات للتعبير مجتمعة أوبتوجينيتيك فائق السرعة مسبار ChETA وميرس isoform محددة ضد كاليفورنيا_v2.1 [الجميع] وكاليفورنيا_v2.1 [EFb]. (أ) خريطة راف بناء بافسينتشيتاتدتميركس، التي تحتوي على مروج سينابسين (Syn)، تشانيلرهودوبسين فائق السرعة تنصهر ChETA تدتوماتو، وفي الدانية 3 ' UTR، كاليفورنيا_v2.1 وصلة خاصة isoform مير. إنزيمات التقييد هو موضح يتم تقطيعه واحدة. (ب) نظام أعلى، من كاسيت التعبير. مروج سينابسين محركات التعبير ChETA-تدتوماتو ومير isoform محددة. أسفل، تكملة عكس تسلسل الهدف 21-النوكليوتيدات، التي تشكل جزءا من كاسيت مير. مير EFb2 أبديت اثنين مير متطابقة شرائط جنب واحدة تلو الأخرى. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 2. تقييم كفاءة ضربة قاضية والانتقائية في ميرس isoform محددة لكاليفورنيا_v2.1 [الجميع] وكاليفورنيا_v2.1 [EFb]- تحليل محددة Isoform qRT-بكر في الجيش الملكي النيبالي معزولة عن الثقافات الأولية DIV 17-18 المصابين رافس معربا عن ميرس تستهدف أما Ca_v2.1 [الجميع] (مير EFa1 ومير EFa3) في الدرجة 6 أو Ca_v2.1 [EFb] (مير EFb2). يتم تطبيع البيانات إلى عنصر تحكم السلبية (مير التحكم). مير EFa1 ومير EFa3 إلى حد كبير وانتقائية خفض مرناً Ca_v2.1 [الجميع] (n = الثقافات 7 و 8، على التوالي)، في حين أن مير EFb كثيرا وانتقائية يقلل مرناً Ca_v2.1 [EFb] (n = 4 الثقافات؛ * * * ف < 0.001؛ واتجاه تحليل الفرق اختبار متبوعاً بالاختبار بعد توكي-كرامر). وترد البيانات يعني ± sem. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ثالهاممير، A. et al. ⁵- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. تقييم دور Ca_v2.1 [الجميع] وكاليفورنيا_v2.1 [EFb] في الحصين الأصلية التي تستهدف تحفيز الخلايا العصبية طرقت إلى أسفل مع أوبتوجينيتيكس- (أ) مخطط كاسيت التعبير من بنيات راف المستخدمة للعدوى في الجسم الحي . (ب) قسم هيبوكامبال تبين أن الأسفار تدتوماتو لا تقتصر على منطقة CA3 وإسقاطاتها. (ج) تكوين التجريبية: تم توجيه شعاع الليزر على سوماتى CA3، وأجريت تسجيلات المشبك التصحيح من CA1 الخلايا العصبية الهرمية. (د) 2 مللي طوله الأزرق (473 nm) نبضات ضوء الليزر أشرق في 20 هرتز استحضار ابسكس الذين PPF هو زاد ميرس استهداف Ca_v2.1 [الجميع] وألغى بموجب مير لكاليفورنيا_v2.1 [EFb]. (ه) ملخص لنسبة النبض إقران للتجارب كما هو الحال في (د)، تظهر زيادة في PPF مير EFa1 ومير EFa3 ونقصان مير EFb2، النسبي إلى محطة مير التحكم (n = تسجيلات 9-11؛ * p = 0.02؛ * * ف = 0.01؛ * * * ف < 0.0004؛ وتحليل التباين المشترك). وترد البيانات يعني ± sem. وهذا الرقم قد تم تكييفه من ثالهامير، A. et al. ⁵- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التعبير المشارك تحقيقا أوبتوجينيتيك ومير ضد جين presynaptic الاهتمام يقدم نهجاً قويا لوصف تأثير الجينات ضربة قاضية على وظيفة presynaptic داخل الدوائر العصبية سليمة. لهذا النهج التجريبي، من المهم تحديد وتوصيف ميرس ذات كفاءة عالية وانتقائية في إسقاط جينات الاهتمام بنظم الأصلية. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي استخدام ميرس المستقلة اثنين أو أكثر ضد مرناً نفس الاهتمام لمراقبة الآثار خارج الهدف في نهاية المطاف. تجارب الإنقاذ، التي جين مقاوم مير مجددا في النظام، ويمكن استخدامها كعنصر تحكم لخصوصية.

باستخدام نفس بنية للتعبير عن أوبتوجينيتيك التحقيق، ومير يسمح لحفز بصريا فقط presynaptic الخلايا العصبية التي قد تم التلاعب بها. وهذا غير ممكن مع التحفيز الكهربائية نظراً لأنها لا تميز بين الخلايا العصبية المصابة وغير المصابة، وبالتالي نتائج مختلطة والمخفف. لأنه يمكن أن يستحث التحفيز البصرية متعددة إمكانات العمل¹⁵، من المهم أن تختار إلا أسرع تحقيقات أوبتوجينيتيك، بين توسيع لوح^15،19،،من²⁰²¹. وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري ضمان أن التحفيز البصري الحث على عدم ديبولاريزيشن مباشرة من presynaptic boutons، لتجنب تجاوز بعض الخطوات لانتقال متشابك أحد يرغب في التحقيق في²².

النهج التجريبي الذي يصف لنا هنا، يجعل من الممكن لتقييم بالتوازي مع أهمية الفسيولوجية للجينات بريسينابتيك متعددة للفائدة خلال فترة زمنية محدودة (4 – 6 أشهر). ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن كنوكدوونس نادراً ما تصل إلى 100%. وعلاوة على ذلك، تحتاج رافس يعبر عنه لمدة أسبوعين على الأقل للسماح للتعبير ضربة قاضية وكامل القصوى للتحقيق أوبتوجينيتيك، التي قد تمثل قيداً وقت عند التحقيق في العمليات الإنمائية المبكرة. على الرغم من الفئران خروج المغلوب مضيعة للوقت، والشرطي أكثر محدودة للخلايا العصبية presynaptic، يؤدي عموما في إكمال إزالة الجينات للفائدة ونقدم لذلك اتباع نهج متكاملة صالحة.

ميزة معينة من التكنولوجيا مير أنه يمكن التعبير عن ميرس متعددة من نفس المروج. قد استخدمت هذه الخاصية أساسا لزيادة كفاءة ضربة قاضية بإدراج نسخ متعددة من نفس مير أو ميرس مختلفة ضد نفس الجين المستهدف. ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لضربة قاضية جينات متعددة بالإعراب عن ميرس ضد مستهدفة مختلفة الجينات^7،23. يمكن استخدام هذه الخاصية لإسكات البروتينات presynaptic متعددة تشريح مسارات إشارات بريسينابتيك.

وهنا جمعنا بين أوبتوجينيتيكس مع ميرس مصطنعة لوصف آثار ضربة قاضية الجينات في الدالة بريسينابتيك في شرائح هيبوكامبال الحاد. يمكن أيضا استخدام نهجاً مماثلاً التلاعب والتحقيق في الدوائر العصبية في فيفو. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين ميرس الاصطناعية مع تشيموجينيتيك النهج سيمكن أحد باستجواب الدوائر العصبية على فترات زمنية أطول.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ونشكر ف. بينفيناتي (معهد Italiano دي تكنولوجيا، IIT) للدعم وحسام فيتالي للمساعدة مع هذه المظاهرة. تم تمويل هذا العمل من IIT ومؤسسة سان باولو (منحة رقم 9734 لأمريكا اللاتينية والكاريبي).