Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Hücresel iyon taşıma kez değerlendirilen hücre içi pH izleyerek (pH_ben). Genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) olduğu gibi hücrelerde hücre içi pH optik miktar sağlar. Bu iletişim kuralı aracılığıyla hücresel ex vivo canlı görüntüleme, Drosophila melanogaster Malpighi tübüllerin pHerry ile hücre içi pH miktar detayları, sözde ratiometric genetik olarak kodlanmış pH göstergesi.

Epitel iyon taşıma sistemik iyon homeostasis gibi temel hücresel elektrokimyasal gradyan bakımından önemlidir. Hücre içi pH (pH_ı) birçok iyon taşıyıcılar tarafından etkilenir ve böylece pH_ben izleme ışınlama etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Modern genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) optik miktar pH_ben sağlam hücrelerde, hücre ve hücre altı ölçekte sağlar. Bu iletişim kuralı hücresel pH_ben yönetmelikte Malpighi tübüllerin (MTs) Drosophila melanogaster ex vivo canlı görüntüleme yoluyla pHerry, sözde ratiometric GEpHI pK_{, gerçek zamanlı miktar açıklar bir} sitozol pH değişiklikleri izlemek için oldukça uygundur. Ayıklanan yetişkin sinek MTs tek hücre katmanı epiteli morfolojik ve fonksiyonel olarak ayrı bölümden oluşmaktadır ve epitel taşıma incelenmesi için erişilebilir ve genetik olarak uysal bir model olarak hizmet verebilir. GEpHIs geleneksel pH duyarlı floresan boyalar ve iyon-seçici elektrot çeşitli avantajlar sunuyor. Uygun organizatörü öğeleri kullanılabilir olması şartıyla GEpHIs farklı hücre popülasyonlarının etiketleyebilirsiniz. Bu etiketleme ex vivo, in vivove doğal olarak heterojen situ hazırlıklar, özellikle kullanışlı olur. GEpHIs da sağlam dokularda ezelî lüzum için tekrarlanan boya tedavi veya doku dışa zamanla pH_i miktar izin. Birincil geçerli GEpHIs yanıt olarak doku hasarı sitozolik kapanımlar toplamak ve aşırı ifade oluşturmada eğilimi dezavantajıdır. Bu eksiklikler, çözümleri ve GEpHIs doğal avantajları bu protokolü demiri proton (H⁺) taşıma ayıklanan sineğin MTs işlevsel olarak ayrı asıl ve Yildiz Seklinde hücrelerdeki değerlendirilmesi ile gösterilen. Teknikleri ve analiz açıklanan çeşitli omurgalı ve omurgasız hazırlıkları için kolayca uyarlanabilir ve tahlil sofistike labs karmaşık iyon akı belirli taşıyıcılar yoluyla belirlenmesi için öğretim ölçeklendirilebilir.

Bu protokol miktar hücre içi pH (pH_i) bir genetik olarak kodlanmış pH-gösterge (GEpHI) kullanarak açıklamak ve bu yöntem demiri H⁺ Ulaştırma modeli böcek (ö. değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için hedeftir melanogaster) böbrek yapısı, Malpighi tübül (MT). MTs meyve sineği boşaltım organları hizmet ve işlevsel olarak birkaç anahtar bakımdan¹memeli nefron benzer. MTs tübüllerin (anterior ve posteiror) göğüs ve karın anında 2 çift olarak düzenlenir. Tek hücreli epitelyal tüp her MT metabolik olarak aktif asıl hücreleri ile farklı apikal oluşmaktadır (luminal) ve demiri (hemocoel) polarizasyon gibi Yildiz Seklinde hücre ara. Anterior MTs 3 oluşan morfolojik, işlevsel olarak, ve gelişimsel olarak farklı kesimleri, özellikle ilk kesimi, geçiş bölütü ve üreter²' ye katıldı salgı ana segment büyümüş. Hücresel ölçekte trans-epitel iyon taşıma Lümen içine bir apikal plazma zarı V-ATPaz³ ve bir alkali-metal/H⁺ Eşanjör gibi bir demiri Na⁺-K⁺tarafından gerçekleştirilir-ATPaz⁴, içe-doğrultucu K⁺ kanal⁵, Na⁺-Cl⁻/HCO₃⁻ Eşanjör (NDAE1)⁶ve⁺Na -K⁺tahrik-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Yildiz Seklinde hücre Cl^- aracılık ve su taşıma^8,9Ncc69)⁷. Bu karmaşık ama erişilebilir fizyolojik sistemi farklı genetik ve davranışsal toolsets Drosophilaile birleştirildiğinde endojen iyon taşıma mekanizmaları incelenmesi için mükemmel fırsatlar sağlar.

Bu iletişim kuralı için gerekçe epitel iyon taşıma hücreden Tümleştirme davranış ve araçları diğer sistemleri modellemek için ihracat potansiyeli ile çalışmak için genetik olarak yumuşak bir sistemi açıklamak için yapıldı. PHerry¹⁰ifadesi, bir füzyon kırmızı pH-duyarlı mCherry¹³, MTs ve yeşil pH duyarlı süper tutulum pHluorin^11,12 (SEpH) türetilmiş bir GEpHI miktar H⁺ taşıma izni Tek MT hücreleri ile yüksek K⁺/nigericin kalibrasyon tekniği¹⁴. Birçok iyon taşıyıcılar H⁺ eşdeğerleri geçtiğinizde, hücre içi pH_ben bir miktar iyon hareketi taşıyıcılar çeşitli yoluyla fonksiyonel bir temsili olarak hizmet vermektedir. Drosophila MT modeli sistem Ayrıca doku özgü transgene¹⁵ ve hücresel görüntüleme ve bütün organ deneyleri¹⁷ ile birlikte RNA müdahale (RNAi)¹⁶ ifade güçlü genetik araçlar sunar ^{, 18 , 19} tübül işlevinin davranışına molekülleri üzerinden dikey entegrasyon ile sağlam bir araç kümesi oluşturmak için. Bu Buna ek olarak diğer birçok protokolün epitel biyoloji, tarihsel olarak bu tür ölçümler üzerinde karmaşık yararlanmıştır olarak değerlendirilmesi ve mikro-diseksiyon, sofistike iyon-seçici elektrot^20,21yıldırıcı anlamına gelir, ve pahalı pH duyarlı²² kısıtlayıcı yükleme gereksinimleri ve türdeş olmayan dokularda zavallı hücresel özgüllük ile boya. GEpHIs kapsamlı pH_ben hücre türleri²³çeşitli ölçmek için kullanılmaktadır. Erken dönem çalışmaları doğal pH-duyarlılık, yeşil flüoresan Protein (pH_ben kültürlü epitel hücreleri²⁴ içinde izlemek için GFP) yararlanan ama son yirmi yılda nöronlar²⁵, glia²⁶, mantar^{27 kullanılan GEpHIs gördün mü} , ve bitki hücreleri²⁸. GAL4/UAS ifade sistem¹⁵ ve Drosophila MT fizyolojik erişilebilirliğini genetik yapıları, hücresel hedefleme için potansiyel kombinasyon bu araştırmalar pH_{için ideal bir hazırlık yapmak ben} düzenlemesi ve epitel iyon taşıma.

pH yönetmelik_ben yıllardır okudu ve yaşam için çok önemlidir. Fizyoloji pH yönetmelik_ben öğretmek ama aynı zamanda gerçekleştirmek için güçlü bir modeli pH_i yönetmelik ex vivo ve içinde vivosofistike MT hazırlık kursları sunar. Bu iletişim kuralı miktar H⁺ hareketinin Drosophila NH₄Cl darbe asit tekniği²¹yükleme kullanarak MT epitel hücrelerinin demiri membran arasında açıklar, ancak pH göstergesi olarak genetik olduğunu kodlanmış, bu yöntemler ve teorik çerçeve herhangi bir hazırlık transgenesis mükellef ve canlı görüntüleme için uygulanabilir.

Bu iletişim kuralı tüm adımlarını Mayo Clinic (Rochester, MN) hayvan kullanım yönergelerle uyumlu olmak.

1. yetiştirme fly

1. Zam uçar ve set standart yetiştirme²⁹göre haçlar.
   Not: Floresan muhabir ifade GAL4/UAS sistem tarafından sıcaklığı ile doğru orantılıdır ve böylece sıcaklık yetiştirme ifade düzeyini değiştirmek için ayarlanabilir. Yüksek ifade düzeyleri genellikle daha iyi bir sinyal / gürültü oranı yol GFP kırmızı floresan Protein (RFP) fusion kullanarak oluşturur pHerry¹⁰gibi^{zaman bu durum aynı zamanda artan sitozolik ve organellar toplamları ile ilişkili ise, 30,31}. Toplama kaçınılmaz miktar gerçekleştirerek hala mümkün ise, Gelin kalibrasyonlar her deney ve normalleştirme verilerde böyle 1.0 Floresans oranında pH_ben 7.0 karşılık gelir (bkz. adım 7,4 kalibrasyon aşağıdaki notta).
2. Haçlar homozigoz Çapar-GAL4³² erkeklerin homozigoz UAS-pHerry¹⁰ bakire kadın ve homozigoz c724-GAL4² erkek görüntüleme izni için homozigoz UAS-pHerry bakire kadın için ayarla pH_ben asıl hücreler ve MT Yildiz Seklinde hücreleri, anılan sıraya göre. Gıda ve 28 ° C'de dostum bırak taze ampul 3 GAL4 erkek 6 UAS-pHerry kadınlarla yerleştirin
   Not: Larvalar 4 d içinde belirgin olmalı ve yetişkin eclose gün yaklaşık 10 başlayacaktır.
3. Dişi sinek eclosion üzerine toplamak ve yaş 28 ° C'de 10 d için kenara
   Not: Deneme zamanlaması hücre içi canlı pH görüntüleme için ilişkili herhangi bir kısıtlayıcı davranış deneyleri (gibi Ramsay salgı tahlil^17,19) karşılık gelecek şekilde ayarlanabilir. Erkek sinek kullanılabilir ancak tübüllerin kadın üzerinden çoğu kez daha büyük ve daha güçlü.

2. slaytlar Poly-L-lizin hazırlanması.

1. Standart 75 x 25 mm'lik slaytlar üst çevresinde hidrofobik PAP kalemle 40 x 20 mm Kenarlık Çiz ve slaytları optik görüntüleme ile uyumlu değilse RT. kullanım büyük coverslips de 15 dakika kurumasını bir kenara koyun.
2. Hisse senedi % 0,01 Poly-L-lizin (PLL) çözüm her slayt üzerine 2 mL transfer ve bir kenara koyun için 1 h RT.
3. Bir pipet ile aşırı PLL kaldırın. Çözüm 50 mL konik şişe ileride kullanmak üzere kaydedin. 4 ° C'de mağaza
4. Kalan herhangi bir çözüm bir vakum hattı ile Aspire edin. Vakum hattı çözüm slaytlar üzerinde kalmasını sağlamak için tüm slayta yüzey üzerinde çalıştırın.
5. 1 ek h bir kenara slaytlarını kullanmadan RT önce ayarlayın. En fazla 1 ay içinde bir standart slayt kitap slaytları RT kuru depolama.

3. yemek ve cam çubuklar dissekan hazırlık

1. Elastomer 35 x 10 mm polistren Petri kabına RT bir derinlik, 5 mm. Mix bir tek kullanımlık pipet ucu ile üretmek için temel 4.5 mL 0.5 mL elastomer kür Aracısı ekleyin. O/N, RT. tedavisi elastomer izin
   Not: Açık ve ücretsiz Bubbles Elastomer olmalıdır. Takas baloncuklar elastomer plakaları 10-15 dk için vakum kavanozda dökme sonra tutarak kolaylaştırılmış olacak.
2. 5 mm çapında cam çubuk eller arasında tutun ve merkezi çubuk üzerinde yanan Bunsen burner sonuna ayrı kablolarıylaberaber eritebilir. Cam gibi erir bir ince (0,1 mm) ve Konik Şaft (şekil 1) hızlı bir şekilde üretmek için daha fazla çek.
   Not: Şaft 45 ° açıyla kez tübüllerin işleme yardımcı olur. Bu bıçağı (bkz. şekil 1) çekilmiş gibi bir yandan azaltarak elde edilebilir.
3. İnce şaft orta Karbonlu çelik tek taraflı jilet kör tarafı ile bölünürler. İnce çubuk aradan temiz olduğundan emin olmak için bir diseksiyon kapsamı altında sonuna bakarak kontrol edin.

Resim 1: Cam çubuklar Malpighi tübüllerin işlemek için imalatı.
A - E. Isıtma ve bir mum tıkıp üretmek ve açı bir cam çubuk MTS'yi okları işleme için uygun çekme işlemi göstermek yönü ve büyüklüğü uygulanacak kuvvet. F. bir uygun şekilde fabrikasyon cam araç fotoğrafı. Ölçek çubuğu 10 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. çözümler ve perfüzyon sistemi hazırlanması

Not: Perfüzyon sistemleri üreticisi tarafından farklıdır. Bu iletişim kuralı bir yerçekimi beslenen 8-kanal açık rezervuar bir giriş akış hızı regülatör ve elektrikli tahrik çıkış ama MTs burada açıklandığı gibi herhangi bir perfüzyon sistemi ile çalışmaya adapte edilebilir montaj yöntemi ile dayanmaktadır.

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   1. Aliquot Schneider'ın orta (50 mL konik tüpleri içine 40 mL) ve 4 ° C'de mağaza
   2. Çözümler hazırlamak (Yani böcek Phosphate-Buffered serum fizyolojik (iPBS) ve iPBS NH₄Cl) adlı Tablo 1göre gerektiğinde RT). RT sıcak çözümler deneme gününde kullanmadan önce.
      Not: iPBS ve iPBS 40 mM NH₄Cl ile büyük miktarlar (1 L veya daha fazla) hazırlanan ve 4 ° C'de depolanan
   3. 500 mL cilt pH 8 kalibrasyon çözüm hazırlamak 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7,6, 8.0 ve 9.0 Tablo 1 ve stok 4 ° C'de gösterildiği gibi = Her çözüm pH titrasyonu N-metil-D-glucamine (NMDG) ve HCl ile ayarlayın.
   4. Deneyler günü, 5 mL aliquots kalibrasyon çözüm RT için sıcak ve hisse senedi nigericin çözüm (Dimetil sülfoksit (DMSO) 20 mM) 10 µM son bir konsantrasyon ekleyin.
      Dikkat: nigericin eldiven ile başa. Nigericin tek kullanımlık olarak temas geliyor tüm ekipman tedavi. Nigericin cam ve plastik üzerinde kalır ve donanımları yeniden varsa biyolojik hazırlıklar tehlikeye sokacaktır.
2. Perfüzyon sistemi:
   1. Perfüzyon sistemi tüm su depoları (Şekil 2) GKD₂O ile doldurarak Başbakan. Bir seferde tüm satırlarını doldurmak için akış hızı regülatör proksimal izin vermek için bir kanal açın.
      Not: Durdu kanal açıp bir dalgıç sürücü akışı için rezervuar kullanarak satırları hava temizlemek gerekli olabilir.
   2. 2 kanal açmak ve drenaj GKD₂O izin vermek. Rezervuarlar neredeyse boş olduğunda, iPBS ve NH₄Cl Geniş puls iPBS ile ikinci rezervuar ile ilk rezervuar doldurun. Akış hızı akış hızı regülatörü ile maksimuma ayarlayın ve distal satırlarını doldurmak 1 dk akmaya her çözüm izin verin ve sonra akışı (Resim 2) durdurmak.
   3. Pozisyonu 2 görüntüleme mikroskop Sahne Alanı'nda "eller yardım" kelepçeler lehimleme ayarlar. Bir kelepçe görüntüleme platformu her yanına koyun.
   4. Dikkatlice ısı kapiller cam parçası distal 0,5 inç (iç çap dış çap 0,86 mm, uzunluğu 1.5 mm 100 mm) Bunsen brülör üzerinde. Bir 45 °'lik dirsek yerçekimi tarafından katlayın için distal uç sağlayan ve bir kez istenen açıda elde alev cam kaldırma oluşturun. İkinci bir kılcal cam parçası ile bu işlemi tekrarlayın.
   5. Bükülmüş cam kılcal akış olmayan çizgi ve vakum bağlı çıkış hattı, sırasıyla Ekle ve "helping hands" mount onları mikroskop (şekil 3) görüntüleme sahne alanı ile hizalamak için.

Resim 2: Perfüzyon sistemi ve yapılandırma görüntüleme.
MT demiri taşıma fonksiyonu sayesinde aynı anda fizyolojik değerlendirilmesi için gerekli bileşenleri Floresans görüntüleme ve hızlı çözüm değişimi yaşıyor. Gaz satırları isteğe bağlıdır ve genişleme deneyler HCO₃^- taşıma değerlendirilmesi için izin vermek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Akış şeması perfüzyon cihazları, NH₄Cl darbe için deneyler.
Oklar akış yolunu ve Vana noktaları geçiş tasvir. Çözüm rezervuar numune için yerçekimi akışı tarafından hareket ve numune odasından atık şişeye vakum emme tarafından çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

5. yetişkin Drosophila ön Malpighi tübüllerin diseksiyon.

1. Diseksiyon çanak toplamak ve çekti bölümünden 3 cam çubuk, PLL kaplı slayt bölümünde 2, yapışkan bir perfüzyon-şey bölücü, vakum yağ, bir 4 x 2" şerit film sızdırmazlık, # 5 2 Çift ince forseps ve 40 mL aliquots buz gibi Schneider'ın orta ve RT iPBS.
2. Vakum yağ sızdırmazlık bandı üzerinde yayılmış ve yağ ile alt kat için teyp üzerine yapışkanlı perfüzyon-şey bölücü tuşuna basın. Yapışkanlı perfüzyon-şey bölücü soyma ve yağ yan aşağı bir PLL kaplamalı slayt üzerine yerleştirin. Hidrofobik yağ ile takip wells bireysel numune bırakmak perfüzyon-şey bölücü kaldırın.
3. RT iPBS yağ çevrili içinde yer 200 µL PLL kaplamalı slayt üzerinde iyi ve stereoscope altında slayt taşımak.
4. Boş bir sinek yer UAS-pHerry/Çapar-GAL4 sinekli şişe ve onları 10 dakika buzda anestezi.
   Not: Bu yöntem anestezi, CO₂, aksine sinekler değil kurutmak sağlar.
5. Buz gibi Schneider'ın orta diseksiyon çanak içine dökün ve iyi forseps altında diseksiyon stereoscope çanak içine bir tek imzalat dişi sinek aktarmak için kullanın.
6. Toraks forseps bir dizi tarafından anında tutun ve diğer yavaşça karın arka kavrama için kullanın. Kısacası, forseps kullanarak anında kasıtlı hareketleri arka çekerek açın. Hindgut görünür olduğunda, distal uç kavrama ve tekrarlayan, kısa tugs vücuda uzak hindgut çekerek temel tracheoles ücretsiz olarak gut ve MTs.
   Not: Anterior ve posteiror MTs midgut ve hindgut üreter ile buluştuğu görünür. MTs posterior tübüllerin hindgut sarmak gibi özgür irade büyük olasılıkla olmak ilk çifti. Bunlar olabilir (şekil 4A) göz ardı.
7. Kapalı üreter, anterior MTs MTs ikinci kümesi karın Ücretsiz olduğunda iyi Forseps ile çimdik. Bu ön MTs gut ayırmak ve üreter kapatın.
8. Ücretsiz ön MTs çekti cam çubuk ile öyle ki her iki tarafına tübüllerin düşmek altında üreter çubuk kaydırarak almak. MTs çözüm dışarı düz yukarı kaldırın.
9. Öyle ki MTs ve üreter çubuk alt yapıştırılır vardır ve üreter düz aşağı slayt alt cam çubuk açın. Üreter yapıştırmayın ve MTs distal ucunun üreter aşağı cam slayt (şekil 4B) bastırarak kapatın. MTs gerekenden daha fazla işlemek değil. MTs kadar çözümde slayda demirlemiş üreter ile yüzüyor.
10. Cam çubuk iyi sonu yavaşça her tübül slayt yüzey üzerinde süpürme için kullanın. Çubuk tübül kırma önlemek ve hareket proksimal, PLL kaplı slayt (şekil 4 c) yüzeyine her tübül tam uzunlukta iliştirmek için distal tübül tepesinden çubuk slayt için slayt karşı hazırla.
11. Yapışkanlı perfüzyon-şey bölücü de takılı tübül sıvı dolu küçük oluşturmak için sürgüyü geri yerleştirin.
12. Numune mikroskop sahnesinde yerini. Giriş akımı getirin ve kılcal damarlar giriş ve çıkış açılması iyi, perfüzyon üzerinde sırasıyla çıkış.
    Not: bir açık perfüzyon odası istenirse iyi bölücü bırakılabilir. Bu durumda giriş ve çıkış kılcal bir görüntüleme iyi ters tarafı için hizalanabilir.

6. doğrulama protokolü ve tübül sağlık görüntüleme

Not: Bu protokol bir ters geniş alanlı epifluorescent mikroskobu GFP (SEpH) ve RFP (mCherry) filtre setleri ile gerçekleştirilir (470/40 nm uyarma (ex), 515 nm longpass emisyon (em), 500 nm dikroik ve 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dikroik), 10 X / 0.45 hava amacı, tek renkli kamera canlı görüntü yakalama ve düşsel bilgisayar yazılımı için. Protokol için herhangi bir dik adapte olur veya en uygun pozlama süreleri, ışık şiddeti ve binning parametrelere göre değişir, ancak mikroskop GFP ve RFP optik ve görüntü edinme şalter bilgisayar yazılımı arasında otomatik filtre ile ters. Her kanaldaki bir yatırım Getirisi ile kullanarak arka plan çıkarma hiçbir Floresans sinyal ROI bitişik içerir sonra tüm analizi, faiz (ROI), bölgedeki ortalama piksel yoğunluğu olarak floresan yoğunluğu analiz edilmelidir.

1. Mikroskop, ışık kaynağı ve görüntüleme sistemi açın.
2. Açık ilişkili düşsel bilgisayar yazılımı.
3. Mercek ile bakmak ve MT Lümen iletilen ışık altında açıkça görünene kadar odak el ile ayarlayın.
4. Görüntü analiz yazılımı "Satın alma" sekmesini tıklatın ve "2" x 2 "Satın alma modu" bölümündeki "Binning" aşağı açılır menüsünde seçin.
5. %5 nötr yoğunluk filtresi aydınlatma ışık azaltmak ve photobleaching en aza indirmek için ışık yolunu yerleştirin.
6. GFP (SEpH) kanalı "Kanallar" menüsünde tıklatın, sonra kamera ile floresan sinyal gözlemlemek için "canlı"'yı tıklatın.
7. En parlak piksel yoğunluğu çubuk grafik en büyük değeri yaklaşık % 40 değerler gibi çekim hızı ayarlamak için "Zaman" kaydırıcıyı ayarlayın, daha sonra "aydınlatma durdurmak için" Durdur'u tıklatın.
8. Tekrar RFP (mCherry) 6,6-6,7 adımda kanal ve ön MT dilate ilk segmentinin varlığını doğrulamak ve sitozolik mCherry yokluğu (doku hasarı veya overexpression gösterge) toplar (şekil 4 d).
   Not: Dilate segment olarak en proksimal tübül parçasını ve bu kesimi iç Lümen çapı ~ 20 µm bitişik geçiş bölütü daha büyük olduğunu açıkça belli olmalıdır. 2 x 2 piksel binning kez yeterli ama daha da gerekli Aydınlatma şiddeti azaltmak için artmıştır. Tipik pozlama süreleri 150 & 800 ms/kanal arasında vardır. Photobleaching en aza indirmek için mümkün olduğunca az ışık olarak kullanın. Photobleaching en aza iki fluorophores bağımsız olarak, böylece herhangi bir oranı kalibrasyon geçersiz duruma getirmelerini bleach gibi pHerry gibi çift-fluorophore göstergeleri kullanmak çok önemlidir.
9. Hızlandırılmış bir görüntüleme Protokolü "Saat serisi" onay kutusunu tıklatarak etkinleştirin.
10. "Maksimum resim alma hızı ile toplam yakalama süresini ayarlamak için süresi" 10 dk ve "Aralığı" kaymak "Saat serisi" bölümünde açılan menüde 0 ayarlayın. Toplam edinme oranı 0,2 Hz kez yeterlidir.
11. GFP (SEpH) ve "Kanallar" bölümünde RFP (mCherry) kutuları kontrol edin.
12. Uygun Vana denetleyicisi etkinleştirerek perfüzyon sistemi iPBS satırı açın ve "Başlangıç deneme." tıklayarak görüntüleme Protokolü başlatın NH₄Cl darbe çözüm için 20 1 dakika sonra geçmek uygun vana açma ve kapama iPBS satır tarafından s sonra geri iPBS için NH₄Cl hat kapatma ve yeniden iPBS Vana açılması. Perfüzyon sistemi durdurmadan önce tamamlamak tam görüntüleme iletişim kuralı sağlar.
    Not: Hızlandırılmış inceleme istikrarlı mCherry sinyal ve NH₄huzurunda Cl artırır, başarısızlık quenches ve yavaş yavaş kurtarır bir SEpH sinyali ortaya.
13. 2 nokta kalibrasyon gerçekleştirin.
    1. Temel slayt uzak soyulması tarafından iyi ayırıcıyı kaldırmak ve perfüzyon kılcal ve kelepçeler görüntüleme iyi kaldırın.
    2. 200 µL kalibrasyon iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) 200 µL pipet ile iyi görüntüleme için geçerlidir. Pipet ile iyi görüntüleme çözümü kaldırın, sonra kalibrasyon çözüm başka bir 200 µL ile değiştirin. Bu işlem tam çözüm değişimi sağlamak için 4 kere tekrar edin.
    3. 30 dk önce görüntüleme kalibrasyon çözüm hazırlıklarında kuluçkaya. 6.6-6.11 adımlarda belirlenen aynı parametreleri kullanarak görüntüleme Protokolü tekrar ediyorum, sadece 1 dk görüntünün değişiklik ile yakalamak.
       Not: Perfüzyon sistemi ve kılcal Bu adımda gerekli değildir ve görüntüleme için eklenmelidir değil de kılcal nigericin için kullanılmasını önlemek için.
    4. 200 µL pipet ile iyi görüntüleme için 200 µL kalibrasyon iPBS (pH 9.0, 10 µM nigericin) ekleyin. Pipet ile iyi görüntüleme çözümü kaldırın, sonra kalibrasyon çözüm başka bir 200 µL ile değiştirin. Bu işlem tam çözüm değişimi sağlamak için 4 kere tekrar edin.
    5. 10 dk önce görüntüleme ikinci kalibrasyon çözüm hazırlıklarında kuluçkaya. Adım 6.13.3 olduğu gibi görüntüleme Protokolü yineleyin.
    6. Her iki kanaldaki pikselleri "Demek ROI" tıklayarak ve yine de görüntü yığını hiçbir değer yoğunluğu histogram içinde bildirilen gözlemleyerek ederken "Çerçeve" kaydırıcı ile kaydırma doygun onaylamak için görüntü analiz yazılımı Yakalanan Görüntü yığınında gözden geçirin en büyük tespit değer ulaşmak. Herhangi bir çerçeve maksimum tespit yoğunluğu ulaşmak piksel içeriyorsa, pozlama süresi veya aydınlatma yoğunluğu ve tekrar Bölüm 6 azaltmak.
       Not: Kez kurulan değişmez görüntü parametreleri ayraç deneyler veya kalibrasyon noktası kalibrasyonlar her hazırlanmasında kullanılacak olmadıkça (bkz. Adım 8.3).
14. Floresan yoğunluğu ve floresan oranı (SEpH/mCherry) zaman bir fonksiyonu çizmek için görüntü yığını analiz.
    1. "ROI demek" tıklatıp serbest biçim aracı seçin. MT. ~ 50 µm uzunluğu izlemek için sol tıklayın tutun ROI çizim bitirmek için sağ tıklatın, sonra bir arka plan yatırım Getirisi (şekil 5A) tanımlamak için MT bitişik bir alanda yineleyin.
    2. "Ortalama yoğunluğu" "Ölçümleri." altında'ı tıklatın Tıklatarak yoğunluk değerleri tablosu oluşturma "İhracat > veri tablosu > Oluştur."
    3. Yapılandırma dişli simgesini tıklatın ve "Zaman" ve "Yoğunluk demek." dışındaki tüm parametrelerden seçimini kaldırıyorsunuz. Yeni oluşturulan veri tablosu sekmesini sağ tıklatın, "Farklı Kaydet" seçin ve verileri bir .csv dosyası olarak verin.
       Not: Benzer ölçümleri ImageJ gibi ücretsiz yazılımlar kullanılarak da yapılabilir.
    4. Bir elektronik tabloyu açın ve veri tablosu "Dan tarafından metin" takip "Veri" sekmesini seçerek alabilirsiniz.
    5. SEpH arka plan yoğunluğu SEpH sinyal şiddeti, her zaman bir noktada dan çıkarmak için elektronik tabloda fonksiyonlarını kullanın. MCherry sinyal için bu işlemi yineleyin.
    6. Zaman ve yoğunluğu veri arka plan-düzeltilir ve sonra tıklatın içeren sütunlar seçerek her kanal yoğunluğu zamanın bir fonksiyonu olarak çizmek "Ekle > dağılım (grafikler) > düz çizgileri olan dağılım" (şekil 5B).
    7. Elektronik tablo işlevleri, her zaman bir noktada SEpH/mCherry floresan oranını hesaplamak için kullanın.
    8. Arsa Floresans oranı zaman süresi ve oranı veri ve sonra tıklatın içeren sütunlar seçerek bir fonksiyonu olarak "Ekle > dağılım (grafikler) > düz çizgileri olan dağılım" (şekil 5C).

7. tam kalibrasyonu Malpighi tübüllerin Ex VivopHerry.

1. İncelemek ve anterior MTs yeni bir set 5 bölümde açıklandığı gibi monte edin.
2. İPBS kalibrasyon iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericin) için 6.13.2 adımda anlatıldığı gibi değişimi. 30 dk için kuluçkaya.
3. MTs bulun ve 6.1-6.11 adımlarda açıklandığı gibi SEpH/mCherry görüntülerin toplamak. Çözüm iPBS 6.13.4, adımda anlatıldığı gibi 10 dakika bekleyin ve tekrar görüntü kalibrasyon başka bir hisse senedi ile değiştirin. SEpH/mCherry oranı tüm çözümlerinde görüntüsü kadar bu işlemi yineleyin. PH 9.0 görüntü elde son örnek, nadiren yüksek pH kurtarır.
4. SEpH Floresans oranı mCherry için sekiz numune kalibrasyonlar üzerinden empoze pH_ben bir fonksiyonu olarak 6.14.9 adımda anlatıldığı gibi arsa. Denklem 1 (şekil 5 d) göre tam kalibrasyon işlevi elde etmek için bir Boltzmann eğrisi calibration verilerle uygun. Veri tutarsız, kalibrasyon kümeleri pH_i için 7.0 1.0 Floresans oranında karşılık gelen öyle ki normalleştirilmiş her örnekten arsa ve (şekil 5E) yeniden analiz.
   Not: ikinci işlem gerekli ise bireysel deneyleri kendi iç noktası kalibrasyonlar³³ gerekir (miktar aşağıdaki yordama (Adım 8.3) bakın).
5. Denklem 1
   
   Nereye R SEpH/mCherry oranı ve₁,₂, x_ove dx = eğri uydurma parametreleridir en az Floresans oranı, en fazla Floresans oranı, pK_birve işlev genişliğini temsil eden anılan sıraya göre. x_o belirgin pK_bir 7.1 ve hücre tipi ve tam kalibrasyon koşullara bağlı olarak 7.4 arasında değişebilir pHerry, =.

8. demiri asit ekstrüzyon Ex Vivo Malpighi tübül epiteli gelen miktar.

1. Görüntü pHerry ifade Yildiz Seklinde hücreleri ve pHerry ifade etmek müdür hücreleri aynı anda.
   1. 5 bölümde açıklandığı gibi ön UAS-pHerry/Çapar-GAL4 karıncayı MTs teşrih ama MTs diseksiyon Schneider'ın ortamından iyi görüntüleme için aktarılmaz.
   2. UAS-pHerry/c724-GAL4 karıncayı 5 bölümde özetlenen yordamı kullanarak aynı diseksiyon tabak içinde ön MTs incelemek.
   3. MTs 2 kümesi aynı 5.8-5.11 adımlarda açıklandığı gibi de Imaging içine aktarın.
      Not: asıl ve Yildiz Seklinde hücre pHerry ifade görüntülenir aynı alan () içinde zaman arms MTS slayt aşağı süpürme, MTs UAS-pHerry/c724-GAL4 ve birbirine yakın UAS-pHerry/Çapar-GAL4 tübüllerin yerleştirin Şekil 6A).
2. NH₄Cl prepulse 6.12. adımda açıklandığı gibi geçerli.
   Not: tutarlı kalibrasyon (şekil 4B) elde değil, bir nokta kalibrasyon sonra yapıştırıcı 7.0 kalibrasyon iPBS (pH 7,0, 10 µM nigericin, 30 dk kuluçka) ile her deneme sonunda pH_i ayarlayarak gerçekleştirin perfüzyon-şey bölücü ve perfüzyon ekipman kaldırılmıştır.
3. İzlemleri farklı MT parçaların (mutlak veya normalleştirilmiş oranı uygun şekilde kullanarak) Yildiz Seklinde ve asıl hücrelerden denklem 2 ile kalibre ve Üstel çürüme işlevlerini kullanarak uygulayarak NH₄Cl çekilme sonra kurtarma aşaması analiz istatistiksel analiz yazılımı ve çürümesine sabit (τ) (şekil 6B) kaydetti.
   Denklem 2
   
   Nereye R SEpH/mCherry oranı ve₁,₂, x_ove dx = eğri ayarı'nda adım 7,4 (Denklem 1) tarafından belirlenen uygun parametreleridir.
   1. Asit ekstrüzyon oranı (J_{S +}, bkz: Denklem 3) pH_ben ve hazırlıklar³⁴arasında yükleme asit dinlenme içinde çeşitleri için hesap için pH_ben bir fonksiyonu olarak hesaplayın. 8.3. adımda elde edilen Üstel fonksiyonların türevi pH_ben zaman ile ilgili olarak her zaman aralığında ve hesaplamak için kullanın.
      Denklem 3
      
   2. İçsel tamponlama kapasitesi (β_i; hesaplamak Denklem 4) pH sitozol, önceki edebiyat dayalı_ben adım 8.3.1 her aralıkta başlangıcını ( Denklem 4bakınız).
      Not: Drosophilaiçinde β_ben en kapsamlı karakterizasyonu larva motor sinir terminallerine³⁵ gelir ve bu veriler MT hücrelerin yokluğunda, diğer kullanılabilir veri tutmak için kabul edilebilir.
      Denklem 4
      
   3. J_{S +} (Denklem 3) belirlemek için β_T (Kimden adım 8.3.2)_{ve ben}dpH /dt (Kimden adım 8.3.1) ürün hesaplamak.
      Not: sözde bikarbonat ücretsiz çözümler Bu protokol için açıklananlar gibi bikarbonat kaynaklı tamponlama kapasitesi (β_b) olduğu varsayılır ~ 0 mM. Toplam kapasite (β_T) tampon toplamıdır β_ben ve_βbve böylece β_{ben =} β_T HCO₃^-co₂³⁶yokluğunda.
   4. J_{H +} adım 6.14.9 belirtildiği gibi her zaman aralığının başında pH_ben bir fonksiyonu olarak çiz.
   5. Üstel çürüme işlevler istatistiksel analiz yazılımı kullanarak pH_ben içinde üst üste tüm veri kümeleri bölümüne uygulanır. Değişim elde edilen fonksiyonların hücreler ve MT kesimleri (şekil 6C) arasındaki asit ekstrüzyon oranlarını karşılaştırmak fiyatları karşılaştırın.
      Not: tek bir üstel eğri uydurma için kullanılan en uygun işlev her zaman olmayabilir. Uyum iyiliği geliştirmek Eğer diğer işlevleri yerine.
   6. Asit hesaplamak için hücre boyutu ve şekli hesap pH_ben bir fonksiyonu olarak (bkz: Denklem 5) akı.
      Denklem 5
      
      Not: Cep boyutları doğrudan Albümdeki ölçülen veya sonuna benzetilir. Asıl hücreleri aşağıdaki boyutları ile içi boş bir tüp yarısı olarak temsil: iç çapı 24 µm; dış çapı 48 µm; Yükseklik 50 µm. geçiş Yildiz Seklinde hücre değişken ama kabaca silindir yükseklikleri 50 µm ve çapları 10 µm olarak temsil edilebilir. Temsilcisi sonuçları aşağıdaki son paragrafa bakın.
   7. Üstel çürüme işlevler istatistiksel analiz yazılımı kullanarak pH_ben içinde üst üste tüm veri kümeleri bölümüne uygulanır. Hücreler ve MT kesimleri (şekil 6D) arasındaki asit Cerayanlar karşılaştırmak için elde edilen fonksiyonların değişim oranlarını karşılaştırmak.

Sağlıklı doku ve uygun ön MTs tanımlaması bu protokolü başarısı için önemlidir. Diseksiyon sırasında doğrudan dokunmak MTs özen gösterilmelidir ve tek tanıtıcısına onları doğrudan MTs sürükleyici olarak üreter tarafından kırılması (- 4A şekil B) götürecek. MTs düz slayt süpürüldü vardır, tübüllerin mümkün olduğu kadar az değiştirilmesi gereken ve aşırı hareket bu kadar kaçınılması tek hücreli epitel tabakası (şekil 4 c) zarar verir. Düzgün disseke ön MTs kırmızı ve yeşil Floresans sitozol epitel hücreleri ve morfolojik ayrı tübül kesimleri ile eşit dağılımı gösterir. Tübüllerin uygunsuz perfüzyon tarafından zarar görmüş veya ilgilenmedikleri eşleştirilmiş yok yeşil toplamları ile kırmızı Floresans toplama görüntüler ve misidentified posterior MTs proksimal kör sonundan itibaren Tekdüzen Morfoloji distal üreter (şekil 4 d) için göstereceğim . 

Düzgün pHerry teyit gerekir ama fizyolojik değerlendirme hem de Morfoloji. Uygun pH algılamalı teyit en uygun yöntemi bir NH₄Cl darbe uygulamaktır. Bu koşullar altında yeşil SEpH sinyal beklenen pH değişiklikleri bildirmelisiniz (pH_ı NH₃ darbe sırasında bir artış girer hücre, darbe sırasında kademeli bir düşüş olarak NH₄⁺ K⁺ taşıyıcılar girer ve kanalları ve bir hızlı asitleştirme ve NH₄kırmızı mCherry sinyal sabit kalması gereken süre Cl çekilme²¹, üzerine kademeli kurtarma (şekil 5A- B). SEpH sinyal değişiklikleri büyüklüğü protokolü ile değişir ve türü hücre, ama mCherry sinyal her durumda kararlı olmalıdır. Bireysel deneyler sırasında mCherry sinyal değişiklikleri hareketi eserler veya sensör toplamları hücre hasarı nedeniyle ilerici nesil gösteriyor. İkinci miktar pH_ben , engeller ve kaçınılması gerekir. NH₄Cl darbe tamamlanması üzerine 2 nokta kalibrasyon gerçekleştirmek önemlidir (kalibrasyon iPBS, pH 7,4 ve 9.0, 10 µM nigericin) bir dinlenme pH_ı 7,4 yakınındaki onaylamak ve geçerli görüntüleme parametrelerini doygunluk için yol değil emin olmak için Floresans pH 9.0 (şekil 5C) ekranı kapladığında Floresans algılama. Dinlenme pH 7.4 önemli ölçüde daha düşük ise, protokol ile sağlıklı MTs yinelenmelidir; ve doygunluk pH 9.0 ortaya çıkarsa, protokol ile düşük ışık yoğunluğu veya pozlama zaman yinelenmelidir. Bir kez yeterli görüntü parametreleri belirlenir, mutlak Floresans oranları kullanılacak varsa onlar deneyler veya kalibrasyonlar arasında değiştirilmemelidir. PHerry pseudo-ratiometric doğası hareketi düzeltme hareketi eğilimli müstahzarları veya hücre çapı değişimler yöntemini sağlayabilir, pH_ben , mutlak miktar pHerry SEpH tam sistematik korelasyon gerektirir / pH_ben nigericin/yüksek K⁺ tekniği ile mCherry oranı. PHerry sağlıklı müstahzarları kalibrasyonu tutarlı kalibrasyon eğrileri ile bir belirgin pK_bir 7.1-7,4 hücre türü ve Kalibrasyon koşullarına (şekil 5 d) bağlı olarak, üretmek gerekir. Öyle ki 1.0 Floresans oranında pH için karşılık gelen hangi mCherry toplama kaçınılmaz, hazırlıkları oranı değerleri normalleştirme_ben 7.0 benzer (şekil 5E) sonuçlar. Noktası kalibrasyonlar ve normalleştirilmiş eğrileri kullanılır eğer, parametreleri görüntüleme, optimize edilebilir her hazırlık için. 

_Ben kalibre edilmiş pH izlemeler pH düzenleyici mekanizma hücre tipleri arasında karşılaştırmak için kullanılabilir. Drosophila GAL4/UAS ifade sisteminde pHerry asıl hücreler ve ön MT (şekil 6A) Yildiz Seklinde hücre ifade etmek için kullanılabilir. _Ben pH yönetmelik asit-yük hücreleri NH₄Cl bakliyat ve_ben pH kurtarma oranı miktarının tarafından tespit edilebilir. Bu hücreler daha hızlı H⁺ sızma ile daha hızlı (ve böylece düşük değerler τ) görüntüler gibi çürümesine sabit (τ) ayıklamak için farklı deneysel koşullarda kurtarma aşaması için Üstel fonksiyonların yaklaştırarak gerçekleştirilebilir. Bu çözümleme bağlı olarak, MT Yildiz Seklinde hücreleri daha güçlü asit ekstrüzyon asıl hücreler (şekil 6B) daha gibi görünüyor. Dinlenme pH_ben, asit yükleme ve kapasite tampon olarak deneysel grupları arasında benzer bu analizi yapacak. Bu koşullar yerine, ancak, birçok hücre (β_i) sitozol içsel tamponlama kapasitesi kendisi olduğunu müşahede pH bağımlı^35,37,38 hesap için gerekli olmasıdır ve böylece_ben pH değişikliği, farklı pH_i oranı doğrudan karşılaştırılabilir değildir. Bu gibi durumlarda, bir NH₄Cl darbe ve içsel tamponlama kapasitesi (β_i) önceden belirlenmiş tahminleri asit ekstrüzyon oranı (J_{S +}) çizmek için bir işlev kullanılabilir asit ekstrüzyon aşama aşağıdakileri üstel eğri Sığdır pH_ı ve asit ekstrüzyon (denklemler 3 & 4) telafi oranı belirlemek. Belirgin için yükleme ve pH_ı dinlenme asit farklılıkları sayılı mı bir kez geçiş bölütü asit ekstrüzyon asıl hücrelerdeki aşan bu Yildiz Seklinde hücre (şekil 6C). Zorlayıcı süre, bu analiz ölçülen gidermez pH_ben plazma zarı arasında asit ekstrüzyon membran yüzey alanının bir işlevi ise birim bir fonksiyonu olduğunu. J_{H +} faiz cep hacim oranı için yüzey alanı tarafından bölen değerleri mol başına birim yüzey alanı birim birim zamanda (Denklem 5), asit eşdeğerleri böylece düzeltme hücre boyutu ve Morfoloji farklılıkları için izin verecektir. Geçici segmentleri MT çevresi yaklaşık iki asıl hücreler oluşturan ve böylece tek hücreleri bir tüp (iç çapı 24 µm; dış çapı 48 µm; yükseklik 50 µm) yarısı modellenmiş. Yildiz Seklinde hücreleri ve küçük çubuk şeklindeki MT²geçiş segmentinde olma eğilimindedirler. Yüzey alanı ve hacim tam miktar zor ancak geçiş Yildiz Seklinde hücre şeklin (silindir yüksekliği 50 µm ve çapı 10 µm ile) bile muhafazakar yaklaşımları gösteren bir yüzey alanı birim oranı en az 2 x o asıl hücreler. Bu dikkate alarak Yildiz Seklinde hücre asit akı bu geçiş asıl hücreler önemli ölçüde ve aslında bu ilk segment asıl hücre (şekil 6D) yaklaşımlar ortaya koymaktadır.

Şekil 4: Diseksiyon yetişkin Drosophila ön Malpighi tübüllerin.
A. ön MT kaldırma 2 Çift soğutulmuş Schneider'ın orta iyi Forseps ile şematik gösterimi. "A. tübül" Anterior MT. "P. tübül" = arka MT. B=. Alma ve ayıklanan MTs ince cam çubuklar kullanarak montaj işlemi. C. tam uzunlukta kalarak işlemi için bir slayt görüntüleme ve fizyolojik değerlendirmesi için MTs ayıklanır. D. SEpH görüntülerini temsilcisi widefield (470/510 nm ex / em) ve mCherry (556/630 nm ex / em) bileşenlerini tasvir Çapar-GAL4 tarafından ön sağlıklı tahrik UAS-pHerry MTs, anterior MTs zarar yeterli perfüzyon tarafından ve misidentified posterior MTS'yi Not sağlıklı ön MTs bir açık dilate kör ilk segment, bir dar geçiş bölütü Çapar-GAL4ve distal ana tarafından tahrik zaman UAS-pHerry nispeten yüksek ifadesi ile görüntüleme segment. MTs ekran göze çarpan agrega mCherry floresan karşılık gelen hiçbir SEpH floresan ile zarar. Posterior MTs çapında hiçbir morfolojik farklı kesimleri ile üniforma. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Doğrulama ve kalibrasyonu Malpighi tübüllerin pHerry.
A. SEpH görüntülerini temsilcisi widefield (470/510 nm ex / em) ve mCherry (556/630 nm ex / em) bileşenleri, sağlıklı ön MTS "ROI" tasvir Çapar-GAL4 tarafından tahrik UAS-pHerry işaretleri bölge ilgi sinyal. Daha sonra aynı kanaldaki ROI sinyalinden düşülen ilgi "BG" işaretleri arka plan bölgesi. Ölçek çubuğu 50 µm. B=. PHerry yanıt olarak 20 s 40 mM NH₄Cl darbe SEpH ve mCherry sinyaller göreli Floresans değişiklikler. MCherry sinyal SEpH sinyal darbe sırasında karakteristik bir artış görüntülerken kararlı olduğunu unutmayın (alkalization göstergesi, Yani artan pH_ı) ve Silinerek geçiş (gösterge asitleştirme, Yani üzerine keskin bir düşüş pH_bendüşmüştür). C. pHerry (SEpH/mCherry) oranını Floresans kalibrasyon iPBS (10 µM nigericin, 130 mM K⁺, pH 7,4 ve 9.0) 30 dk kuluçka sonra ek veri ile b verilerden hesaplanan. D. Kalibrasyon eğrisi mutlak pHerry oranı inşa (SEpH / mCherry) gibi bir fonksiyonu_ben pH kalibrasyon iPBS sekiz pH değeri birine arabelleğe alınmış maruz sırasında empoze. Gri daireler tek tek değerleri form 8 hazırlıklar vardır. Siyah kareler ve barlar var. ortalama ±SD eğrisi Boltzmann uygun bu. E. D olduğu gibi aynı veri normalleştirilmiş böyle o floresan pH 7,0 1.0 oranıdır. Eğri sigmoidal eğrisi (bkz. adım 7.4, Denklem 1) uygun değiştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: Miktar asit ekstrüzyon Malpighi tübül epiteli.
A. Widefield görüntü ön MT asıl hücrelerdeki SEpH floresan (dan pHerry) (sol, Çapar-GAL4 sürücü tarafından tahrik) ve ön MT Yildiz Seklinde hücreleri (değil, tahrik c724-GAL4tarafından). Not Yildiz Seklinde hücre çubuk şeklindeki ilk segmente geçiş segmentinde, değişken ve ana segmentte ayrı hücresel tahminlerini görüntülemek. Ölçek çubuğu 100 µm. B=. _Ben pH değişiklikleri yanıt olarak 20 s 40 mM NH₄Cl darbe bir (asıl hücrelerde geçiş bölütü, ilk parçasının asıl hücrelerin ve geçiş segmentin Yildiz Seklinde hücre) ile belirtilen faiz bölgelerinde kalibre. Kesik çizgili eğriler tek üstel uyar NH₄takip asit kurtarma aşamasında belirtilen çürümesine sabit (τ) değerleri türetildiği Cl çekilme uygulanan gösterir. C. asit ekstrüzyon oranı (J_{H +}) çizilen üstel türetilmiş bir işlev pH_i B. görülen uygun olarak Adım 8.3.1 J_{S +} hesaplama (Denklem 3) bakın. Kesik çizgili eğriler üstel uyan her veri arsa gri kutusu tarafından belirtilen pH_ben örtüşen alanı içinde uygulanan vardır. D. asit akı çizilen üstel türetilmiş bir işlev pH_i B ve Denklem 5görülen uyuyor gibi. Kesik çizgili eğriler üstel uyan her veri arsa gri kutusu tarafından belirtilen pH_ben örtüşen alanı içinde uygulanan vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Deneysel sinek çözümleri.
iPBS çözümleri oda sıcaklığında hazırlanır ve pH HCl ve NaOH ile titrasyon tarafından ayarlanır. Kalibrasyon çözüm NMDG HCl ile titre. Arabellek kalibrasyon çözüm temel alınarak istenen pH çeşitli [2-(N-morpholino) ethanesulfonic asit (MES) pH 4.0-6.0; = 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) pH 6,5-7,5; = N-[tris (hydroxymethyl) metil] -3-aminopropanesulfonic asit (MUSLUKLAR) pH için 8,0-9.0 =]. MM, pH (unitless) ve osmolalite (mmol/kg) dışındaki tüm değerleri. Hisse senedi nigericin DMSO 10 µM kullanmadan önce son bir konsantrasyon kalibrasyon çözüm eklenir.

Tablo 2: Yayımlanmış sitozolik GEpHIs listesi
Uyarma maxima, emisyon maxima ve belirgin pK_bir değerler yaklaşık değerlerdir ve ifade sistemi, görüntüleme tekniği ve Kalibrasyon yöntemi bağlı olarak değişebilir. FLIM Floresans mikroskobu Imaging ömür boyu =. NIR kızılötesi =.

Miktar pH_ben in başarısında Drosophila MTs tamamen ayıklanan MTs ve montaj ve diseksiyonu (Şekil A - C) kalitesini sağlığı üzerinde bağlıdır. Bu nedenle, dikkatli işleme doku açıklanan zorunludur. Taze PLL içinde kaplı slaytlar önemli ölçüde daha fazla yapışkan olma eğilimi olarak yardım MT montaj daha önce kullandığı eriyik-e doğru kayıyor. Dikkatli montaj da ayrı MT kesimleri (Şekil D) tanımlaması içinde yardımcı olacak. Sağlıklı MTs kalibrasyon pHerry ve işlevsel değerlendirme mCherry toplama azaltılması ve asit ekstrüzyon, çok daha tutarlı miktar sırasıyla verimli kolaylaştırmak. Deneysel koşullar doğal olarak MT epiteli zarar veya floresan muhabiri önemli aşırı ifade üretmek gibi bazı durumlarda, mCherry toplama kaçınmak mümkün değildir. Bu gibi durumlarda, öyle ki Floresans oranı 1,0 pH_ben 7.0 karşılık gelen ve nokta kalibrasyonlar miktar (Şekil E) izin verir bir pseudo-ratiometric kalibrasyon normalleştirilmiş. Nigericin ionophore olarak görüntüleme ve perfüzyon sistemlere kalıcı unsurları kullanılmasını önlemek için nokta kalibrasyonlar gerçekleştirme cam ve plastik için uygun olacaktır zaman özen gösterilmelidir. Hatta pseudo-ratiometric kalibrasyon için şartlar içinde deneysel bir manipülasyon indükler hücresel hasar bir deney sırasında mümkün değildir bu hasar bir ilerici belirgin neden olacak Yani mCherry floresan artırmak deney boyunca. Daha sonra bu durumda SEpH Floresans sinyal bir normalleştirilmiş kalibrasyon eğrisi ile kullanılabilir ve kalibrasyonlar görüntüleme artık hareket eserler ve odak vardiya için doğru olacağını ihtar ile gelin.

GEpHIs için pH_ben bir miktar floresan boyalar ile karşılaştırıldığında bazı genel sınırlamaları taşırlar. Boya tutma membran bütünlüğü ve hücre sağlık³⁹bir göstergesi olarak kullanılabilir, ancak hiçbir eşdeğer tahlil GEpHIs kullanılabilir durumda. Bu nedenle, eğer hücre hasarı sonuçları yıkmak için öngörülen hazırlık sağlık bağımsız yollarla izlenmesi gerekir. GEpHIs, potansiyel olarak en az rahatsız vivo içinde hazırlıklar üzerinden görüntüleme izni ama doku bütünlüğü doğal olarak deneysel manipülasyonlar sınırlar ve kalibrasyonlar imkansız gelin yapabilirsiniz. Başka özel sınırlama pHerry ve diğer sitozolik çift fluorophore pH göstergeleri (örneğin, ClopHensor⁴⁰) kullanarak doğal türeyen üzerinden iki fluorophores bir başka ve pH_{bağımsız olarak kendi floresan değiştirme eğilimi} . Teklif toplama toplama eserler bu sınırlama en önemli göstergesidir ama miktar aynı zamanda bir veya her iki fluorophores photobleaching tarafından tehlikeye girebilir. Böylece, iletişim kuralları görüntüleme çok uzun pozlama süreleri ve satın alma oranları yol açabilir photobleaching en aza indirmek için ayarlanmış < vardiya 0,2 Hz. uzun pozlama süreleri hızlı pH_ben bildirmek için başarısız olur. SEpH Floresans doğrusal korelasyon pH_ben pH 6.8-7,8 çoğu müstahzarları gösterir, ancak bu ölçümlerin doğruluğu nigericin/yüksek K⁺ tekniği doğruluğunu bağlıdır. Nigericin K⁺/h⁺ ionophore davranır ve ekstraselüler [K⁺] ile hücre içi [K⁺] sıcaklığına uygun kalibrasyon dayanır. Hücre içi [K⁺] tahminleri elde edilebilir ya da kolayca elde edilebilecek tüm deneysel sistemleri için değildir. Oranları göreceli değişiklik oranını pH_ben içinde tutarlı olacak olsa da_ben pH miktar doğruluğunu ancak hücre içi [K⁺], tahminleri güvenilir. Bu sınırlama ve pH_ben ilişkinin ters Logaritmik hücre içi [H için⁺] göz önüne alındığında, her zaman pH_ben, değişim oranları olarak rapor verileri için tercih edilir asit ekstrüzyon oranı (J_{S +}, şekil 6C), veya pH_benmutlak değişiklikler yerine asit akı (şekil 6D). Veri çözümlemesi asit akı yüzey farklılıkları için düzeltme yararı olduğu gibi hücre tipleri arasında hacim oranı vardır.

Yetişkin yorumlama verileri bu protokol için açıklanan MT hazırlık uçarken çeşitli uyarılar takdir etmek gerekir. Başlangıç, geçiş ve ana segmentleri morfolojik ayrım bir basitleştirme, işlevsel ve genetik etki alanları MTs²mevcut gerçek çeşitliliğin olasıdır. Ayrıca, bu iletişim kuralı işlevi demiri asit taşıyıcılar, saptamak için tasarlanmıştır apikal taşıma pH_i ölçümleri de etkileyebilir mümkün iken. MTs (Adım 5,9) Montaj bu çözüm değişimi sağlar zaman üreter öncelikle mühürleme demiri yüzeyde oluşur ama para-cep ve apikal hareketi iyonlar pH_i demiri taşıma sonuçta değiştirir gibi etkisi hala Lümen/sitozolik iyon degradeler sitoplazmik tarafında. Mutlak apikal ayrılması ve demiri işlev bağımsız olarak luminal Ventriküler tarafından gerçekleştirilebilir ve MT ama tür yöntemler demiri yüzeyleri önemli ölçüde daha teknik micropipette cannulation^{41 gerektiği talep ediyorlar} .

GEpHIs_ben, pH ölçme geleneksel yöntemler üzerinden pek çok avantajları sunmak ve bu güçlü ne zaman kombine ile genetik yumuşaklık ve düşük maliyetli Drosophila MT hazırlık güçlendirilmiş. Miktar pH_ben , tarihsel olarak (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)²² veya iyon-seçici elektrot^{20 üzerinden karmaşık Elektrofizyolojik değerlendirme gibi floresan boyalar üzerine güvendi ,21}. PHerry genetik olarak kodlanmış gibi belirli hücresel nüfus (burada asıl hücreleri ve şekil 6MT Yildiz Seklinde hücreleri içinde gösterildiği gibi) belirli rehberleri tarafından ifade edilebilir ve transgenesis tabi herhangi bir doku kullanmak için müsait, transfection, ya da aracılı viral enfeksiyon. Boya bireysel ürünleri ve türdeş olmayan dokularında hiçbir hücre özgüllük ifade potansiyel olarak karmaşık uygulama protokolleri maliyete göre sınırlıdır. PHerry tek widefield epifluorescent mikroskobu ile geleneksel gerekirken GFP ve RFP kümelerini süzmek, imalat ve ölçüm için özel ekipman iyon-seçici elektrot gerektirir. GEpHIs taze ayıklanan dokularda ve zaman içinde vivoüzerinden takip edilebilir iken boyalar ve elektrotlar kullanımı faiz dokusunun optik erişimin yanı sıra fiziksel gerektirebilir. _Ben pH yönetmelik diğer bir teknoloji olarak hücresel fizyolojisi değerlendirirken endojen tampon huzurunda pH_ben bir miktar izin verdiğinde sağlam müstahzarları canlı görüntüleme için özel ilgi bir fırsattır mekanizmaları.

Drosophila yetişkin MT hazırlık hücresel pH yönetmelik ve iyon taşımacılığında ilgilenenler için birçok çekici özellikleri sunar. Drosophila yetiştiriciliği ucuzdur ve genetik olarak kodlanmış Biyoalgılayıcı yapıları ve RNAi ifade ekler gibi araçların hisse senedi merkezleri (Bloomington Drosophila hisse senedi, Indiana Üniversitesi Merkezi; çeşitli kolayca kullanılabilir Viyana Drosophila Araştırma Merkezi). Drosophila MTs onları transepithelial iyon taşıma incelenmesi için idealdir polarize epitel hücrelerinin tek bir katman oluşur. Demiri taşıma kolayca (aşağıda gösterildiği gibi) apikal tam değerlendirme denetlesinler ve demiri iyon hareketi micropipette cannulation⁴¹ile mümkündür. Ramsay salgı tahlil¹⁷ ve luminal kalsiyum oksalat ifade¹⁸ iyi karakterize ve için sıvı salgılanması modellerin epitelyal hücresel Fizyoloji olanak vermek gibi Ayrıca, organ fonksiyon deneyleri ve nephrolithiasis, anılan sıraya göre. Bu özellikler sağlam analiz için fırsatlar sunarken, epifluorescent mikroskobu alçak-fiyat ve geniş kullanılabilirliğini Drosophila MT modeli laboratuvarları öğretim hücresel ve bütün organ Fizyoloji gösteriler için idealdir.

Bu yöntemler ustalık miktar pH yönetmelik_ben H⁺ akı yetişkin Drosophila MTs içinde bir erişilebilir henüz güçlü modeli transepithelial iyon taşıma demiri tarafından izin verir. PHerry diğer omurgasız hücre tipleri, pH_i yönetmelikte değerlendirmek için kolayca adapte edilebilir gibi GEpHIs kullanımı memeli hücreleri ve in vivo hazırlıklar kültürlü. Yeni GEpHIs gelişimine büyük olasılıkla görünür spektrum kapsayan ve toplama eserler^30,42, gibi mevcut kısıtlamaları adresleme yeni nesiller ile bu genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerin takip edecek ^{43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49}. GEpHIs zaten yoğun mitokondrial matris pH^50,51bildirmek için hem de hücre altı hedefleme stratejiler vardır biyosensörler endoplazmik retikulum⁵², çekirdek ^{yerelleştirmek için 53}, sinaptik veziküller^12,43ve sitoplazmik⁵⁴ ve hücresel plazma zarı⁵⁵ dış yüzeyleri (yayımlanmış reaktifler bir listesi için bkz: Tablo 2 ). Bu nedenle kullanılabilir araçları onlar alt hücresel pH yönetmelik dikey entegrasyon Ca^{2 +} işleme ve hücre içi sinyal, gibi hücresel fizyolojisi ve bütün organ fonksiyon diğer yönleri ile omurgalılar çeşitli izin verir ve omurgasız hazırlıkları.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu eser NIH DK092408 tarafından desteklenen ve DK100227 MFR. AJR için T32-DK007013 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Julian A.T. Dow Çapar-GAL4 ve c724-GAL4 için teşekkür etmek istiyorum Drosophila stokları. Ayrıca Jacob B. Anderson deneysel sinek haçlar sürdürmek yardım için teşekkür ediyoruz.